專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用(2－咪唑啉－2－基氨基)喹喔啉治療視神經(jīng)損傷的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物眼睛的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜免受有害刺激的方法，此有害刺激包括由于青光眼或其它病因因素導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高的壓迫性(機(jī)械的)效應(yīng)以及供給這些神經(jīng)的血流受損。
青光眼是一種特征為眼內(nèi)壓升高的眼睛疾病。按病因分類(lèi)，青光眼可分為原發(fā)性及繼發(fā)性。進(jìn)一步地，成人的原發(fā)性青光眼可以是慢性開(kāi)角型或慢性閉角型。繼發(fā)性青光眼由先于其存在的眼睛疾病如色素膜炎，眼內(nèi)腫瘤或增大的白內(nèi)障所致。
原發(fā)性青光眼的根本原因尚不很清楚。眼內(nèi)壓的升高是由于阻塞或房水外流。在慢性開(kāi)角型青光眼，前房角及其解剖結(jié)構(gòu)顯示正常，但房水引流有障礙。在急性和慢性閉角型青光眼，前房角淺，濾過(guò)角狹窄，虹膜可能在Schlemm管的入口外阻塞了小梁網(wǎng)絡(luò)。瞳孔擴(kuò)大可能推動(dòng)虹膜根部進(jìn)一步壓迫房角，或可能產(chǎn)生瞳孔的阻滯，因此出現(xiàn)急性發(fā)作的眼內(nèi)壓升高。前房角狹窄的眼易于出現(xiàn)各種嚴(yán)重程度的急性閉角型青光眼發(fā)作。
繼發(fā)性青光眼是由于對(duì)房水自后房角至前房角，并隨之至Schlemm管流動(dòng)的任何干擾所致。
眼前部的炎癥性疾病可能引起虹膜“隆起部位”(bombe)內(nèi)完全性后虹膜粘連而阻礙房水外流，并且滲出物可能堵塞引流通道。其它常見(jiàn)的原因有眼內(nèi)腫瘤，增大的白內(nèi)障，腹側(cè)視網(wǎng)膜靜脈閉塞，眼部創(chuàng)傷，手術(shù)操作及眼內(nèi)出血。
將所有類(lèi)型考慮在一起，在所有40歲以上的人中約2％發(fā)生青光眼，并且在進(jìn)行性并到迅速視力喪失之前的許多年可以是無(wú)癥狀的。在無(wú)外科手術(shù)適應(yīng)癥的情況，局部用β-腎上腺素受體拮抗劑是治療青光眼的選擇藥物。然而，α-腎上腺素能激動(dòng)劑正等待批準(zhǔn)用于治療眼內(nèi)壓升高，且一旦它們得到應(yīng)用，將可能成為治療這種病的主力。
具有α2激動(dòng)劑活性的各種喹喔啉衍生物已被建議作為治療劑，例如Danielewicz等，美國(guó)專(zhuān)利第3,890,319和4,029,792號(hào)。他們公開(kāi)了作為心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的化合物，它具有如下通式
其中2-咪唑啉-2-基氨基基團(tuán)可在喹喔啉母核的5-、6-、7-或8-位置的任何一位；x、y和z可在剩余的5-、6-、7-或8-位置的任何一位且可選自氫、鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的或2-或3-位置的任意取代基并且可以是氫、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。目前有用的化合物可按照Danielewicz等提出的步驟制備。美國(guó)專(zhuān)利第3,890,319和4,029,792號(hào)的內(nèi)容被在此全部收載作為參考。
在“相對(duì)選擇性α-2激動(dòng)劑(UK-14，304-18)對(duì)貓、兔和猴的眼部效應(yīng)”〔J.A.Burke，等，Current Eye Rsrch 5，(9)，pp 665-676(1986)〕中，喹喔啉衍生物對(duì)降低兔、貓和猴的眼內(nèi)壓顯示有效。此研究中的化合物被局部應(yīng)用于所研究動(dòng)物的眼。
很早就已知青光眼的后遺癥之一是對(duì)視神經(jīng)頭的損傷。此損傷，被稱(chēng)為“杯狀陷凹形”或“cupping”導(dǎo)致視盤(pán)的神經(jīng)纖維區(qū)域機(jī)能降低。由于此cupping所致的視力喪失是進(jìn)行性的，且如果此疾病未得到有效的治療則會(huì)致盲。
然而不幸的是，應(yīng)用藥物或外科手術(shù)促進(jìn)房水外流而降低眼內(nèi)壓并不總能有效地避免青光眼狀況對(duì)神經(jīng)的損傷。這個(gè)明顯的矛盾由Cioffi和Van Buskirk〔眼科學(xué)研究，38，增刊，p.S107-16，討論S116-171994年5月〕在文章“前眼神經(jīng)的微血管系統(tǒng)”中談到。摘要說(shuō)明青光眼的傳統(tǒng)定義是眼內(nèi)壓(IOP)升高的異常，使得臨床狀況過(guò)分簡(jiǎn)單化。一些青光眼病人從未具有高于正常的IOP，而另一些病人盡管最大限度降低IOP仍繼續(xù)發(fā)生視神經(jīng)損傷。在青光眼病因?qū)W中的其它可能因素是前眼神經(jīng)局部微血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。相信微血管因素是重要的一個(gè)理由是許多微血管疾病與青光眼視神經(jīng)病變有關(guān)。
繼Cioffi等之后，Matusi發(fā)表了關(guān)于“系統(tǒng)性血管炎的眼科學(xué)改變”〔Nippon Rinsho，52(8)，p.2158-63，August 1994〕的文章進(jìn)一步支持許多微血管疾病與青光眼視神經(jīng)病變有關(guān)的觀(guān)點(diǎn)。摘要說(shuō)明全身性血管炎如結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞小血管炎和主動(dòng)脈炎綜合癥的眼部表現(xiàn)已被評(píng)述。全身性紅斑狼瘡未分類(lèi)為全身性血管炎，然而它的眼部表現(xiàn)是微血管病變。因此其眼部表現(xiàn)的評(píng)述亦包括在本文中。這些疾病最常見(jiàn)的眼底發(fā)現(xiàn)是局部缺血性視神經(jīng)病變或視網(wǎng)膜血管閉塞。因此一些關(guān)于視神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜血管閉塞的診斷或發(fā)病機(jī)理的觀(guān)點(diǎn)得到討論。由于熒光素血管造影被應(yīng)用于這些疾病，脈絡(luò)膜局部缺血已經(jīng)能夠臨床診斷。當(dāng)脈絡(luò)膜動(dòng)脈閉塞時(shí)，壓在上面的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞將受到損傷。此導(dǎo)致上皮細(xì)胞的屏障功能受損，并使得來(lái)自脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)的液體能夠進(jìn)入感光層下的視網(wǎng)膜空間。這是漿液性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)病機(jī)理。視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞形成了無(wú)灌注視網(wǎng)膜。此缺氧的視網(wǎng)膜釋放血管形成因子，它刺激視網(wǎng)膜和虹膜新生血管形成，而虹膜新生血管形成可能造成新生血管性青光眼。
B.Schwartz在“眼科高血壓和高壓性開(kāi)角型青光眼中視盤(pán)和視網(wǎng)膜的循環(huán)缺陷”〔Surv.Ophthalmol.，38，Suppl.pp.S23-24，1994年5月〕一文中討論了與青光眼進(jìn)展有關(guān)的進(jìn)行性視神經(jīng)和視網(wǎng)膜缺陷的治療，他說(shuō)明熒光素缺陷與視野喪失及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層喪失顯著相關(guān)。其次的循環(huán)缺陷是視網(wǎng)膜血管，特別是視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)熒光素流量的下降，以致于年齡越大，舒張期血壓越高，眼壓及視野喪失越大，流量就越小。視盤(pán)和視網(wǎng)膜循環(huán)缺陷均發(fā)生于未治療的眼壓過(guò)高的眼。這些觀(guān)察表明視盤(pán)和視網(wǎng)膜循環(huán)缺陷發(fā)生于眼壓過(guò)高和開(kāi)角型青光眼，且隨疾病的進(jìn)展增加。
因此，顯然有著不能滿(mǎn)足的對(duì)一種藥物的需要，這種藥物具有眼內(nèi)神經(jīng)保護(hù)作用，它能夠阻止或延緩青光眼或其它眼科疾病導(dǎo)致的神經(jīng)的進(jìn)行性損傷。
發(fā)明概要一種保護(hù)哺乳動(dòng)物眼睛的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜免受青光眼的其它有害刺激傷害的新方法已被發(fā)明。此方法包括應(yīng)用于哺乳動(dòng)物或者全身性或者球內(nèi)注射有效劑量的一種或多種某些芳香基-亞氨基-2-咪唑烷(如在此定義)，其鹽類(lèi)和其混合物。當(dāng)用作預(yù)防性治療時(shí)，此新方法尤其有效，即用在神經(jīng)損傷發(fā)生之前，或用在疾病如青光眼的長(zhǎng)期進(jìn)展已經(jīng)發(fā)生之前。
發(fā)明的詳細(xì)描述首先對(duì)圖作簡(jiǎn)短的描述。
附1是自谷氨酸治療的天數(shù)繪制的直方圖，顯示細(xì)胞被谷氨酸處理后殺死的百分率。包括未用谷氨酸處理的對(duì)照以測(cè)定未用任何這種處理時(shí)發(fā)生的細(xì)胞死亡。還顯示的有用AGN 191103和谷氨酸處理后，及用MK-801和谷氨酸處理后的測(cè)定結(jié)果。MK-801是本領(lǐng)域熟知的神經(jīng)保護(hù)制劑。在谷氨酸；AGN 191103+谷氨酸；和MK-801+谷氨酸直方柱下面的數(shù)據(jù)顯示用于各個(gè)例子的谷氨酸和藥物的濃度。在第8天，在保護(hù)細(xì)胞免受谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性方面，AGN 191103和MK801顯示了類(lèi)似的效應(yīng)。產(chǎn)生此圖的數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)實(shí)施例1。
圖2顯示測(cè)量的視神經(jīng)纖維復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)圖在左手的圖框內(nèi)，測(cè)定于損傷后2周(即，神經(jīng)壓碎后)，用AGN 191103治療的視神經(jīng)(上面的線(xiàn))和用作對(duì)照的未治療的神經(jīng)(下面的線(xiàn))；在右手的圖框內(nèi)，為未損傷視神經(jīng)的對(duì)照CAP。在每個(gè)圖框中給出了圖的標(biāo)度。損傷后的圖橫座標(biāo)標(biāo)度是未損傷圖標(biāo)度的25×(單位毫伏和毫秒)。復(fù)合動(dòng)作電位的值以每一曲線(xiàn)下面積的積分計(jì)算。曲線(xiàn)的不規(guī)則性是復(fù)合反應(yīng)分散的特征；一些神經(jīng)細(xì)胞傳導(dǎo)較其它更為迅速，因此測(cè)量電壓的振幅隨時(shí)間而變化。
圖3是以微伏(μV)表示的細(xì)胞最大CAP振幅的直方圖，這些細(xì)胞是大鼠視神經(jīng)壓碎而損傷并用以下治療1)單用賦形劑；2)可樂(lè)定和3)AGN 191103。每種藥物以四種不同的濃度試驗(yàn)(用作被試驗(yàn)對(duì)象體重的倍數(shù))并以圖中的直方柱表示。可樂(lè)定以其已被非常明確的藥理學(xué)作用被選為標(biāo)準(zhǔn)α2激動(dòng)劑化合物，與被試驗(yàn)化合物AGN 191103相比較，但是當(dāng)可樂(lè)定較單用賦形劑相比的確顯示一些神經(jīng)保護(hù)活性時(shí)，它只顯示AGN 191103最大CAP反應(yīng)的約一半值。
圖4是視覺(jué)激發(fā)性電位反應(yīng)的曲線(xiàn)圖，并顯示了作為視覺(jué)(光)刺激的結(jié)果在視覺(jué)腦皮質(zhì)的表明激發(fā)的電的電位活性(類(lèi)似于腦電圖)。此試驗(yàn)在活的大鼠進(jìn)行并且是整個(gè)視覺(jué)系統(tǒng)的完整性的測(cè)量，即自視網(wǎng)膜經(jīng)過(guò)視神經(jīng)進(jìn)入雙側(cè)膝狀核并最后進(jìn)入位于腦后部的神覺(jué)腦皮質(zhì)的整個(gè)視覺(jué)系統(tǒng)。左手的圖框顯示無(wú)神經(jīng)壓碎損傷的反應(yīng)，右手的圖框顯示于損傷后2周測(cè)量的用AGN 191103治療的大鼠的反應(yīng)，為上面的線(xiàn)(標(biāo)為陽(yáng)性)，及神經(jīng)壓碎前對(duì)照大鼠的反應(yīng)，為下面的線(xiàn)(標(biāo)為陰性)。兩張圖均以μV對(duì)毫秒標(biāo)度，顯示于縱座標(biāo)軸下方。
關(guān)于神經(jīng)壓碎模型及其在評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷和修復(fù)中它的重要性的討論及文獻(xiàn)目錄參見(jiàn)“視神經(jīng)損傷后的功能修復(fù)及形態(tài)學(xué)變化”，Sabel，B.A.和Aschoff.A.，神經(jīng)精神生物學(xué)28.pp.62-65(1993)。
哺乳動(dòng)物視神經(jīng)的損傷，如同哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的任何其它部位，致使軸突的變性及隨后細(xì)胞體喪失，軸突自幸存的神經(jīng)元不能再生。起初，損傷的神經(jīng)的變性可能歸因于直接的神經(jīng)元損傷。然而，損傷后立即發(fā)生于神經(jīng)中的有關(guān)生理和生化事件可能對(duì)隨后的進(jìn)行性變性有作用，不僅是對(duì)直接損傷的軸突，而且是對(duì)那些避開(kāi)了初次的損傷而且在更大程度上決定了長(zhǎng)期功能的后果。
立即的損傷誘導(dǎo)反應(yīng)極大地影響了隨后的變性反應(yīng)。因此減少或減弱立即反應(yīng)的治療似乎是達(dá)到最理想的預(yù)防或延緩繼發(fā)的變性過(guò)程。為了監(jiān)測(cè)立即反應(yīng)，顯然優(yōu)選應(yīng)用非侵入性的技術(shù)。修正的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)監(jiān)測(cè)技術(shù)使得能夠測(cè)定最早期的創(chuàng)傷后事件，已被證明是有價(jià)值的非侵入性方法。此技術(shù)的應(yīng)用使損傷的立即反應(yīng)能夠在真實(shí)時(shí)間內(nèi)得到評(píng)價(jià)并在活體成年大鼠視神經(jīng)遭到仔細(xì)控制的壓碎損傷之前和之后進(jìn)行的評(píng)價(jià)。在此實(shí)驗(yàn)范例中，損傷的視神經(jīng)代謝活性的測(cè)定代表了損傷的軸突和它們相關(guān)的非神經(jīng)元細(xì)胞的活性，因此等于評(píng)價(jià)了應(yīng)付損傷性應(yīng)激反應(yīng)的潛在能力。此模型還可用于各種試劑的活性的監(jiān)測(cè)，這些試劑可以克服或緩解來(lái)自于此類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡。
在局部缺血性事件能夠被完全排除的情況下，最早期的損傷誘導(dǎo)反應(yīng)是神經(jīng)的能量狀態(tài)減少。能量狀態(tài)的減少可能涉及1)游離脂肪酸水平在損傷后升高，這可能干擾線(xiàn)粒體功能并導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)；和2)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平顯著升高。已知軸突的損傷通常隨后出現(xiàn)細(xì)胞外鉀離子的升高，它通過(guò)電壓敏感通道(L，T或N型)或受體-操縱的Ca2+通道，刺激了Ca2+的攝取。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的顯著升高能加速不利于細(xì)胞生存的過(guò)程，包括那些涉及Ca2+依賴(lài)性的酶，主要是脂酶，蛋白酶和核酸內(nèi)切酶的過(guò)程，這可能引起線(xiàn)粒體損傷并最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了克服這些事件，細(xì)胞需要更多的能量以便主動(dòng)地恢復(fù)離子的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在損傷部位由于線(xiàn)粒體功能障礙所致的增加的能量需求和減少的能量保存的組合可能是損傷后隨之發(fā)生的不同逆性神經(jīng)損傷及神經(jīng)變性的主要原因。因此對(duì)代謝活性的早期測(cè)定能夠提示軸突，與其相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和它的非神經(jīng)元細(xì)胞體的命運(yùn)。從上述可得出，在預(yù)防損傷后神經(jīng)發(fā)生變性中，線(xiàn)粒體活性的恢復(fù)可能是關(guān)鍵性的。
由于在神經(jīng)壓碎模型中，加在神經(jīng)上的損傷是良好控制的，校準(zhǔn)過(guò)的和可重復(fù)的損傷，因而有可能將早期創(chuàng)傷后代謝缺損和通過(guò)藥物或其它治療可能將其減輕，與長(zhǎng)期的形態(tài)學(xué)的及生理學(xué)的效應(yīng)相聯(lián)系。
從前面的圖及討論可見(jiàn)，對(duì)于谷氨酸誘導(dǎo)的毒性及在神經(jīng)壓碎模型中的物理?yè)p害，顯然神經(jīng)細(xì)胞是 得到了神經(jīng)保護(hù)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)細(xì)胞受到損傷前或之后但在細(xì)胞死亡之前的時(shí)期內(nèi)，將式I的藥物施用于哺乳動(dòng)物的視神經(jīng)和/或視網(wǎng)膜，視神經(jīng)細(xì)胞得到了神經(jīng)保護(hù)。
式I其中，2-咪唑啉-2-基氨基基團(tuán)可以在喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z可在剩余的5-、6-、7-或8-位的任一位置并且是選自氫，鹵素，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基且可能是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。
定義鑒定為AGN 191103的化合物具有所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)
其化學(xué)名稱(chēng)為6-甲基-(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉。
鑒定為MK-801的神經(jīng)保護(hù)劑稱(chēng)之為地佐環(huán)平并具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
在第11版Merck索引專(zhuān)題第3392號(hào)中有附加的鑒定和描述。
人的劑量和施用本發(fā)明的方法可用于治療任何哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)。
按照本發(fā)明，哺乳動(dòng)物用藥學(xué)有效量的神經(jīng)保護(hù)劑治療一段時(shí)間，并在對(duì)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的毒性刺激沒(méi)有殺死或未永久性損傷神經(jīng)細(xì)胞的時(shí)候使用。保護(hù)劑可以口服或應(yīng)用下面描述的或本領(lǐng)域熟知的任何合適的給藥方法。
按照本發(fā)明，藥學(xué)有效劑量的保護(hù)劑可單獨(dú)給藥以治療神經(jīng)損傷或預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞死亡?；蛘撸Ｗo(hù)劑可與抗青光眼藥物順序地或同時(shí)使用，如與β-阻滯劑，α2-激動(dòng)劑，繩覃堿類(lèi)制劑如毛果蕓香鹼，碳酸酐酶抑制劑(CAI)，或其它用于維持眼內(nèi)壓(IOP)于正常水平或降低升高的IOP的藥物。保護(hù)劑最有效的給藥方式和劑量程序取決于欲治療的疾病類(lèi)型，該疾病病程和嚴(yán)重程度，先前的治療，病人的健康狀態(tài)，對(duì)藥物的反應(yīng)以及治療醫(yī)師的判斷。一般地說(shuō)，神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)該給藥的劑量為達(dá)到血清或玻璃體內(nèi)濃度為0.01nM至50nM。優(yōu)選神經(jīng)保護(hù)劑在神經(jīng)損傷前使用，但也可在損傷發(fā)生后使用，效果較差。
可以應(yīng)用保護(hù)劑，如MK-801的常規(guī)給藥方式及標(biāo)準(zhǔn)劑量程序，與其他藥物，如一種IOP降低藥，與神經(jīng)保護(hù)劑，合并給藥的最佳劑量，可用本領(lǐng)域熟知的方法決定?；谂c神經(jīng)保護(hù)劑同時(shí)給藥的藥物的劑量和病人對(duì)療程的反應(yīng)，可按具體病人調(diào)整神經(jīng)保護(hù)劑的劑量。也可將保護(hù)劑在一定時(shí)間或經(jīng)一系列治療期間給藥于病人。
不能通過(guò)血/腦屏障的試劑，如MK-801，可局部給藥，如通過(guò)眼球內(nèi)注射至玻璃體內(nèi)，或鞘內(nèi)應(yīng)用。能夠通過(guò)血/腦屏障的試劑，如AGN 191103可以全身性給藥，如口服，靜脈內(nèi)；或注射。
這些療法中應(yīng)用的組合物也可以是多種形式。它們包括，例如，固體，半固體，和液體劑量形式。如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液或懸浮劑，脂質(zhì)體，栓劑，可注射和輸注溶液。組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)的可供藥用的載體。
下列非限制性的實(shí)施例描述了分析和測(cè)定。用于1)測(cè)定保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于谷氨酸誘導(dǎo)的毒性和2)在機(jī)械損傷的神經(jīng)壓碎模型中，測(cè)定神經(jīng)保護(hù)劑給予的神經(jīng)保護(hù)作用的方法。實(shí)施例1在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞興奮中毒效應(yīng)的模型中測(cè)定神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)方法低密度大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物是用Goslin和Banker的方法制備的。蓋片在瓷制架中清洗和滅菌以使它們不相互粘連(Cohen蓋玻片染色架，Thomas Scientific)蓋片(13mm)被置于染色架中，用蒸餾水沖洗(四次沖洗，每次1分鐘)以除去灰塵并轉(zhuǎn)移至濃HNO3中36小時(shí)。蓋片于蒸餾水中沖洗(四次換水，3小時(shí)以上)并用干熱滅菌(225℃過(guò)夜)將蓋片轉(zhuǎn)移至24-孔板上，每孔一個(gè)蓋片。在共培養(yǎng)時(shí)，為支撐在神經(jīng)膠質(zhì)上的蓋片，在置入蓋片前將石蠟點(diǎn)置于板上，并用uv照射(30分鐘)。將1mg/ml聚-L-賴(lài)氨酸氧溴酸鹽(PLL)(Sigma)(MW 30,000-70,000)溶解于硼酸緩沖液中(0.1M，pH8.5)，過(guò)濾，滅菌并用于覆蓋每個(gè)蓋片過(guò)夜。除去PLL，蓋片用蒸餾水沖洗(沖洗兩次，每次2小時(shí))，加入平板培養(yǎng)基〔Eagle′s MEM與Earle′s的鹽，它含有額外的葡萄糖(600mg/L)和10％馬血清〕并將板貯存于孵育器中。星形神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物制備自新生大鼠的腦，系用類(lèi)似于Levinson和Mc Carthy描述的方法，只是它們以較低的密度鋪平板接種以便它們主要含有I型星形神經(jīng)膠質(zhì)。每孔平板接種105細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物飼以平板培養(yǎng)基每周兩次并在接種后約2周達(dá)到融合后使用。使用前一天，除去平板培養(yǎng)基，加入神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(MEM含有N2補(bǔ)充物)，并繼續(xù)孵育。3×104有活力的大鼠海馬神經(jīng)(E18胚胎)被平板接種于PLL-處理的保存于平板培養(yǎng)基中的蓋片上。3-4小時(shí)后，當(dāng)大部分神經(jīng)元附著后，將蓋片轉(zhuǎn)移至含有在維持培養(yǎng)基中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的器皿中，且讓神經(jīng)元一邊面對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)，神經(jīng)膠質(zhì)支持神經(jīng)元的生存和生長(zhǎng)。為減少神經(jīng)膠質(zhì)增殖，在平板接種后2天于培養(yǎng)物中加入阿糖胞苷(1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶)(Calbiochem)(5×10M終濃度)。于培養(yǎng)第6天，用1mM谷氨酸或用谷氨酸與或者AGN-191103-0.1nM(MW＝200)或者M(jìn)K-801-10nM一起處理細(xì)胞(每種處理用2-3個(gè)蓋片)。
孵育24小時(shí)后，用臺(tái)盼藍(lán)行細(xì)胞染色。隨機(jī)選擇培養(yǎng)物視野(每個(gè)蓋片5個(gè)視野)計(jì)數(shù)活的和死的神經(jīng)元。計(jì)算死亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例2神經(jīng)壓碎損傷和測(cè)量損傷后復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)的方法A部分。代謝測(cè)定所用動(dòng)物按照關(guān)于研究動(dòng)物的應(yīng)用的ARVO決議。雄性Sprague-Dawley(SPD)大鼠，體重300-400g用戊巴比妥鈉麻醉(腹腔內(nèi)，35mg/kg)。氣管內(nèi)插入插管以備需要時(shí)人工通氣。將動(dòng)物的頭用頭架固定于一定位置，于雙目操作顯微鏡下行側(cè)面眥切開(kāi)術(shù)且結(jié)膜被側(cè)面切開(kāi)至角膜。分離眼球收縮肌后，確定視神經(jīng)且行鈍性分離自近眼球處暴露303.5mm長(zhǎng)度。保留硬膜完整并注意不要損傷神經(jīng)。光導(dǎo)裝置架(見(jiàn)下文)的第一部分被插入視神經(jīng)下方并且將視神經(jīng)輕輕釋放入光導(dǎo)管道內(nèi)。然后將第二部分固定于一定位置，以使光導(dǎo)裝置位于距視神經(jīng)將要被損傷處的1mm視神經(jīng)表面。表面熒光光度測(cè)定-反射系數(shù)測(cè)定線(xiàn)粒體內(nèi)NADH氧化-還原狀態(tài)的監(jiān)測(cè)是基于NADH于366nm處的熒光，導(dǎo)致發(fā)射出峰強(qiáng)度在450nm的藍(lán)光，它不同于它的氧化形式，NAD+，后者缺乏此熒光。366nm激發(fā)的來(lái)源是100-W空氣冷卻的用強(qiáng)366nm濾器裝備的Coroing 5860(7-37)加9782(4-96))水銀燈。柔韌的Y形光學(xué)纖維束(光傳導(dǎo))用于傳送到達(dá)或來(lái)自視神經(jīng)的光，因此使得體內(nèi)測(cè)定在技術(shù)上可行。激發(fā)光通過(guò)激發(fā)纖維束傳送至神經(jīng)。發(fā)射自神經(jīng)的光，在傳送通過(guò)第二纖維束后，分開(kāi)為90∶10的比例量，以測(cè)定在450nm的熒光(90％)和在366nM的反射光(10％)，它是通過(guò)連接于一通道直流電熒光計(jì)-反射計(jì)的二個(gè)光電倍增管進(jìn)行的，為減小動(dòng)物間的變異，在記錄開(kāi)始時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)校正程序。實(shí)驗(yàn)中熒光和反射信號(hào)的變化按相對(duì)于校正的信號(hào)計(jì)算。此種類(lèi)型的校正，盡管不是絕對(duì)值，然而在各種動(dòng)物和不同的實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了可靠的和可重復(fù)的結(jié)果。
繼發(fā)于動(dòng)脈血壓和神經(jīng)容量改變的血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)和視神經(jīng)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的組織吸收值的改變是與反射光的改變相互關(guān)連。熒光測(cè)定值發(fā)現(xiàn)可被適當(dāng)修正為NADH氧化-還原狀態(tài)測(cè)定值，這是通過(guò)將熒光中減去反射光(366nm)(1∶1比例)以獲得修正的熒光信號(hào)。代謝測(cè)定將仍然麻醉狀態(tài)的動(dòng)物在30分鐘從上述的外科步驟復(fù)蘇，然后暴露于缺氧和多氧條件。通過(guò)讓大鼠在100％氮?dú)庵泻粑鼉煞昼娺_(dá)到缺氧狀態(tài)，之后將其返回空氣中。當(dāng)動(dòng)物未自動(dòng)恢復(fù)至正常呼吸時(shí)，通過(guò)向氣管內(nèi)吹氣兩次進(jìn)行通氣。多氧狀態(tài)是通過(guò)讓動(dòng)物在100％氧中呼吸6-10分鐘誘發(fā)的。為評(píng)價(jià)視神經(jīng)的代謝活性，在壓碎損傷前后，測(cè)定了對(duì)缺氧和多氧的反應(yīng)引起的反射光和熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化。代謝測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方案用校正的交叉作用(cross-action)鑷子，在眼和光傳導(dǎo)架之間的神經(jīng)上進(jìn)行仔細(xì)校正的適度的壓碎損傷，相應(yīng)壓力為120g 30秒鐘。B部分生理學(xué)測(cè)定記錄復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)的實(shí)驗(yàn)在去除視神經(jīng)行電生理測(cè)定之前，大鼠以70mg/kg戊巴比妥深度麻醉。自顱骨去除皮膚，自眼球分離視神經(jīng)。行次全斷頭術(shù)并用咬骨鉗打顱骨。大腦移置側(cè)面，暴露視神經(jīng)的顱內(nèi)部分。在交叉水平分離使能夠切除全部長(zhǎng)度的神經(jīng)，并將它轉(zhuǎn)移至裝有新鮮冷Krebs溶液的玻璃瓶中。Krebs溶液含有NaCl(125mM)，KCl(5mM)，KH2PO4(1.2mM)，NaHCO3(26mM)，MgSO4(0.6mM)，CaCl2(24mM)D-葡萄糖(11mM)，用95％ O2和5％ CO2通氣。神經(jīng)保存在此溶液中，在其中電活性將至少3-4小時(shí)保持穩(wěn)定。1小時(shí)恢復(fù)后，將神經(jīng)于37℃浸入Krebs溶液中。在矩壓碎損傷的遠(yuǎn)端神經(jīng)處獲得電生理記錄，由于神經(jīng)太小，不允許在壓碎的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。然后將神經(jīng)末端連接于浸在浴液中的兩個(gè)吸入Ag-AgCl電極。經(jīng)近端的電極應(yīng)用刺激脈沖并經(jīng)遠(yuǎn)端電極記錄動(dòng)作電位。Grass SD9刺激器用作電刺激(2V，50μs)。信號(hào)被傳遞至Medelec PA63前置放大器并由此到Medelec MS7肌電圖儀和AA7T放大器。溶液，刺激器和放大器有共同的基座。8個(gè)平均的CAPs的最大波幅用波拉羅伊德(Polaroid)照相機(jī)記錄和照像。剩余的神經(jīng)(未損傷的)用于測(cè)定正常神經(jīng)的參考值并校正用以壓碎的鑷子。視覺(jué)激發(fā)性電位(VEP)反應(yīng)的記錄損傷的用藥物治療的大鼠于損傷后2周檢查，評(píng)價(jià)其功能恢復(fù)。在此組實(shí)驗(yàn)中，從初級(jí)視覺(jué)腦皮質(zhì)記錄了對(duì)光刺激反應(yīng)引起的縱行電位圖形。電位被來(lái)源于視網(wǎng)膜的光激發(fā)并延著存活的軸突傳播到達(dá)它們的最終目標(biāo)，視覺(jué)皮質(zhì)。只有那些在初級(jí)及次級(jí)變性過(guò)程中存活下來(lái)的軸突能夠傳導(dǎo)動(dòng)作電位。對(duì)治療的及未治療的動(dòng)物的場(chǎng)電位圖形的比較分析，將揭示治療對(duì)軸突存活的作用。
將麻醉的大鼠(Rumpon，Ketalar)置于一小的動(dòng)物sterotaxic儀器中。暴露顱骨后，用圓柱形鉆頭鉆兩個(gè)孔，并保持硬膜完整以減小皮質(zhì)損傷。一個(gè)孔，鉆于鼻骨上方，用作參考點(diǎn)。第二個(gè)孔在OC1區(qū)域，坐標(biāo)為前顱#8mm，側(cè)面#3mm。連接于螺絲釘?shù)慕鹩|針被用作電極，它被擰緊在孔中并用丙烯酸粘接劑膠粘于顱骨。場(chǎng)電位用頻閃儀刺激激發(fā)，平均每分鐘90掃描。通過(guò)應(yīng)用Lab View數(shù)據(jù)收集和處理系統(tǒng)分析閃光-激發(fā)性電位。場(chǎng)電位被數(shù)字化并貯存行脫機(jī)分析。C部分檢測(cè)神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)的藥物效果的測(cè)定第一組的實(shí)驗(yàn)包括代謝測(cè)定。每種藥物以7種不同的濃度腹腔內(nèi)注射。每組藥物在一組8只動(dòng)物中檢測(cè)，同時(shí)有8只對(duì)照(損傷的動(dòng)物預(yù)緩沖賦形劑處理)。在各個(gè)例中，于損傷前，損傷后0.5小時(shí)和以后的4-6小時(shí)的每一小時(shí)進(jìn)行線(xiàn)上的代謝測(cè)定。獲得的數(shù)據(jù)用ANOVA分析。長(zhǎng)期效果的測(cè)定。生理學(xué)活性CAPS損傷后即刻將待檢測(cè)的藥物注射于10只動(dòng)物，并用賦形劑注射10只對(duì)照動(dòng)物。二周后每個(gè)神經(jīng)的CAPs被體外記錄，用吸入電極。對(duì)側(cè)的一邊用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果表明被檢測(cè)的藥物是否對(duì)挽救剩余的軸突和/或延緩變性具有任何電位效應(yīng)。陽(yáng)性結(jié)果將導(dǎo)致繼續(xù)對(duì)各個(gè)有前途藥物測(cè)定最佳劑量。VEP效應(yīng)于兩組年齡-和性別-匹配的首次用作實(shí)驗(yàn)的SPD大鼠的皮質(zhì)內(nèi)植入電極。植入后即刻，當(dāng)光線(xiàn)閃爍于右眼而左眼被覆蓋時(shí)，左側(cè)記錄VEP效應(yīng)。然后在視神經(jīng)上進(jìn)行仔細(xì)控制的壓碎損傷，并將預(yù)先已確定的最佳劑量的藥物立即施用。對(duì)照動(dòng)物以相同的方法處理，只是施用賦形劑而不是藥物。每只動(dòng)物的VEP效應(yīng)于手術(shù)后1天，1周、2周和4周記錄。
雖然本發(fā)明已通過(guò)各種具體實(shí)施例和實(shí)施方案進(jìn)行描述，應(yīng)理解到本發(fā)明不限于此，而只應(yīng)通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)的范圍的闡述來(lái)解釋。
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜或視神經(jīng)細(xì)胞的方法，該哺乳動(dòng)物的所說(shuō)的神經(jīng)細(xì)胞正遭受有害的作用或經(jīng)受有害作用的危險(xiǎn)，該方法包括向所述動(dòng)物施用有效劑量的式I的化合物以抑制或防止神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，
式I其中2-咪唑啉-2-基氨基基團(tuán)位于喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z位于剩余的5-、6-、7-或8-位的任一位置，并且選自氫、鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基并且可以是氫、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，或其可供藥用的鹽和其混合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中有害的作用是青光眼的眼內(nèi)壓升高。
3.權(quán)利要求1的方法，其中有害的作用是與青光眼有關(guān)的局部缺血。
4.權(quán)利要求1的方法，其中有害的作用是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
5.權(quán)利要求1的方法，其中有害的作用是非青光眼性局部缺血。
6.權(quán)利要求1的方法，其中有害的作用的性質(zhì)是微血管病變并且是選自下列疾病的癥狀，所述疾病包括結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，主動(dòng)脈炎綜合癥和全身性紅斑狼瘡。
7.權(quán)利要求1的方法，其中用口服給藥將化合物給哺乳動(dòng)物全身用藥。
8.權(quán)利要求7的方法，其中施用的化合物的劑量是5-15mg/kg。
9.權(quán)利要求1的方法，其中應(yīng)用在眼中的球內(nèi)注射將化合物提供給哺乳動(dòng)物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中應(yīng)用非經(jīng)腸道給藥將化合物全身應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。
11.權(quán)利要求1的方法，其中應(yīng)用肌內(nèi)注射將化合物全身應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物于喹喔啉環(huán)的6-位有2-咪唑啉-2-基氨基，y和z均是氫和位于7-位和8-位，和x位于喹喔啉環(huán)的5-位上。
13.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
14.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
15.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
其中x如權(quán)利要求1所定義，且有害的作用是眼內(nèi)壓升高。
16.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是與青光眼有關(guān)的局部缺血。
17.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
18.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是非青光眼性的局部缺血。
19.權(quán)利要求1的方法，其中式I的化合物是
其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用的性質(zhì)是微血管病變并且選自下組疾病，所述疾病是結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞血管炎，主動(dòng)脈炎綜合癥和全身性紅斑狼瘡。
全文摘要
公開(kāi)了一種方法,按照此方法在視神經(jīng)細(xì)胞損傷前或損傷后但在細(xì)胞死亡前的期間,通過(guò)給哺乳動(dòng)物的視神經(jīng)和/或視網(wǎng)膜施用式Ⅰ的藥物,對(duì)視神經(jīng)細(xì)胞起到神經(jīng)保護(hù)作用。其中2－咪唑啉－2－基氨基基團(tuán)可以在喹喔啉母核的5－或6－位;x、y和z可以在剩余5－、6－、7－或8－位的任何位置并且選自氫、鹵素、低級(jí)烷基,低級(jí)烷氧基或三氟甲基;并且R是在喹喔啉母核的2－或3－位的任意取代基并且可以是氫,低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。
文檔編號(hào)A61K31/498GK1197391SQ96196328
公開(kāi)日1998年10月28日 申請(qǐng)日期1996年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月28日
發(fā)明者L·A·維勒, E·沃德穆塞, R·K·黎 申請(qǐng)人:阿勒根