專利名稱：一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法
一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法
背景技術(shù)：
i^Wli^M (Paratyphus swine) X^W^^^M'^ (Swine salmonellosis), ± 要是由豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主 要通過(guò)接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。仔豬副傷寒主要是由豬霍亂沙門(mén)氏菌引起幼豬和架子豬的敗血癥和腸炎，對(duì)成年 豬多呈隱性帶菌或?yàn)樨i瘟的繼發(fā)感染菌，間或引起人類的食物中毒以及侵害其他動(dòng)物。我國(guó)應(yīng)用的仔豬副傷寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房曉文，李陽(yáng)隴，黃昌 炳，鄭明，馮文達(dá)，孫偉等.仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1979)，對(duì)仔豬有堅(jiān) 強(qiáng)免疫力，毒力穩(wěn)定、安全，在豬沙門(mén)氏菌病防控中發(fā)揮了重要作用。但仍存在以下突出問(wèn) 題1.疫苗采用普通肉湯作為培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要成分牛肉浸液的質(zhì)量受牛肉的種類、 年齡、新鮮及消化程度影響大，造成批次間不穩(wěn)定。2.疫苗采用1.5%明膠、5%蔗糖為保護(hù) 劑，組方簡(jiǎn)單，凍干存活率低，保護(hù)功能較差(尤其在較高溫度下)。目前國(guó)內(nèi)14個(gè)生產(chǎn)仔 豬副傷寒活疫苗的獸用生物制品企業(yè)，凍干存活率一般為50% 60%，需要-15°C以下保 存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌體，死亡菌體崩解產(chǎn)生的內(nèi)毒素，是產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的 因素之一，另外低溫保存給邊遠(yuǎn)地區(qū)儲(chǔ)運(yùn)和使用帶來(lái)困難。據(jù)報(bào)道，每年0. 07% 0. 的 豬接種后出現(xiàn)嘔吐、痙攣、全身發(fā)疳、死亡等癥狀。本發(fā)明的目的是研究一種合成培養(yǎng)基、耐熱保護(hù)劑及其相配套的凍干曲線，制備 一種凍干菌存率高，能在2 8°C長(zhǎng)期保存的仔豬副傷寒活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是將種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于液體培養(yǎng)基中， 37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升高情況 加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培養(yǎng)結(jié)束后立即加入經(jīng)過(guò)滅菌并預(yù)熱至37°C的凍 干保護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過(guò)程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，每頭份活菌數(shù)不 少于 3X109CFU。1生產(chǎn)菌株(1)菌株來(lái)源豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保 管和供應(yīng)。其原始菌種系豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79101株(來(lái)自蘇聯(lián)獸藥監(jiān)察所，編號(hào)為 133/8。特性該菌種肉肝胃培養(yǎng)物50X IO4CFU活菌致死小鼠，5000X IO4CFU活菌致死海豬， 1.5X IO8CFU活菌靜脈注射致死仔豬。血清型6，7:C:1，5。)經(jīng)0. 05% 1 %醋酸鉈的普 通肉湯傳500代，每間隔50代逐步提高醋酸鉈濃度，人工致弱而來(lái)。(2)菌株特性1)毒力用體重18 22g(30 35日齡)小白鼠皮下注射1 X IO8CFU活菌 (0. 2ml)，90%以上存活；豚鼠(350 400g)皮下注射15 X IO8CFU活菌，90%以上存活；家 兔(體重1.5 2. Okg)皮下注射100 X IO8CFU活菌(1ml)，100%存活；仔豬(體重15kg以
3上)靜脈注射30X IO8CFU活菌(Iml)，100%存活。2)菌株穩(wěn)定性在普通瓊脂上連傳20代，或在仔豬連通過(guò)3代，毒力不返強(qiáng)。3)免疫原性以25X IO8CFU活菌免疫家兔(體重1. 5kg)，一個(gè)月后攻擊2 4MLD(最小致死劑量)強(qiáng)毒菌，保護(hù)80%以上；以25 X IO8CFU活菌免疫仔豬(體重12kg)， 靜脈注射致死劑量強(qiáng)毒，保護(hù)60%以上(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生 物制品規(guī)程二〇〇〇版.化學(xué)工藝出版社，2000，以下稱《規(guī)程》)。2.疫苗制造及半成品檢驗(yàn)(1)生產(chǎn)用種子制備將豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)凍干菌種用普通肉湯稀釋后，接種普通瓊脂平 板，37°C培養(yǎng)18 20h，選取中等大小的典型菌落(菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略 濕潤(rùn)的光滑型)5 10個(gè)，混合接種于普通瓊脂斜面3 5支，37°C培養(yǎng)24h，經(jīng)純粹檢查合 格后作為一級(jí)種子。在2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)2個(gè)月。取一級(jí)種子按2%接種普通肉湯， 37°C培養(yǎng)24h，純粹檢查合格后，作為種子液。(2)培養(yǎng)基本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基是普通肉湯培養(yǎng)基(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó) 獸藥典二〇〇五版三部.北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006年，以下稱《中國(guó)獸藥典》)或/和合
成培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的合成培養(yǎng)基配方及配制方法如下胰酪蛋白胨 2%，酵母浸出粉3% 4 %，氯化鈉0.05%，磷酸二氫鉀 0. 0077%，磷酸氫二鈉0. 0867%，注射用水；按配方依次稱取培養(yǎng)基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氫氧化 鈉溶液調(diào)節(jié)PH值為7. 2 7. 4，116°C滅菌30min，臨用時(shí)，無(wú)菌操作加入終濃度的50% 葡萄糖溶液，混勻。(3)保護(hù)劑的配制1)保護(hù)劑的配方水溶性明膠10g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) Ig,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養(yǎng)基5g， L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。2)配制方法溶液1 在潔凈燒杯中，加入注射用水(100°C )適量，按配方依次稱取水溶性明 膠、PVP、山梨醇，加入燒杯中，邊加入邊用玻璃棒攪拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，經(jīng) 116°C 滅菌 30min。溶液2 按配方依次稱取蔗糖、199培養(yǎng)基、L-谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀 于燒杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0. 22 μ m濾膜的除菌濾器過(guò)濾除 菌。3)配苗前，在無(wú)菌條件下，將溶液1和溶液2等體積混勻，即成。(3)制苗用菌液制備將豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于液體 培養(yǎng)基(普通肉湯培養(yǎng)基或本發(fā)明提供的液體合成培養(yǎng)基)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖
4以控制PH值。培養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過(guò)滅菌處理并 預(yù)熱至37°C的耐熱保護(hù)劑懸浮，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過(guò)程中應(yīng)注意保溫振搖 均勻。凍干分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提 供的凍干曲線2(見(jiàn)圖2)進(jìn)行。(4)半成品檢驗(yàn)純粹檢驗(yàn)取菌液用普通瓊脂平板，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)純粹?；罹?jì)數(shù)取樣用普通瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行， 作為計(jì)算凍干活菌率的基數(shù)及配苗時(shí)參考。凍干后檢驗(yàn)純粹檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)純粹。頭份、活菌率的計(jì)算用普通瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按附錄《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行。以3瓶中最低菌數(shù)計(jì)算核定該批疫苗每瓶的使用頭份，同時(shí)按附注方法計(jì)算凍 干后的活菌率，以確定使用方法?；罹试?0%以上的疫苗，可用于注射或口服；低于50% 的疫苗，僅限于口服。3成品檢驗(yàn)性狀白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。純粹檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹?；罹?jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)(按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行)，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白胨水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應(yīng)存活。剩余水分測(cè)定按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)不超過(guò)4. 0%。真空度測(cè)定按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個(gè)月。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明提供的生產(chǎn)方法中采用 了合成培養(yǎng)基和耐熱凍干保護(hù)劑及其相適應(yīng)的凍干曲線一整套技術(shù)，提高豬霍亂沙門(mén)氏菌 CVCC79500株培養(yǎng)菌數(shù)，保證批次間穩(wěn)定性，減少凍干過(guò)程的損失率，降低菌體死亡和代謝 副產(chǎn)物產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)，將成品疫苗的保存溫度提高到2 8°C，有效期達(dá)到18 24個(gè)月， 并可實(shí)現(xiàn)較高溫度短期保存(37°C保存7日，活菌減少率低于20% )。


圖1 凍干曲線1示意圖。-35°C進(jìn)箱；_40°C維持約4h ；產(chǎn)品由_40°C升至-10°C， 維持IOh ；板層溫度提高到28°C，維持8h。全程約28h。圖2 凍干曲線示意圖。2 :0 5°C進(jìn)箱；以每minl°C降至_40°C或以下，維持約4h ； 板層控制-10°c，維持14 16h ；每間隔2h升溫10°C，在28°C維持6h出箱。全程約28h。本發(fā)明所使用的凍融菌存率、凍干菌存率及活菌減少率計(jì)算方法凍融菌存率(％) = 化凍后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/預(yù)凍前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*100%
凍干菌存率(％) =凍干后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/凍干前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*100%
活菌減少率(%) =耐老化試驗(yàn)前每頭份(或每ml)活菌數(shù)一耐老化試驗(yàn)后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/耐老化試驗(yàn)前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*l00%實(shí)施例1將豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于本發(fā) 明所提供的合成培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過(guò)程中根 據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌的40%葡萄糖以控制pH值。培 養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過(guò)滅菌并預(yù)熱至37°C的本發(fā)明 提供的耐熱凍干保護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過(guò)程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，并 迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提供的凍干曲線2(見(jiàn)圖 2)進(jìn)行，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X109CFU。實(shí)施例2將豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于普通 肉湯培養(yǎng)基(《中國(guó)獸藥典》記載的配方)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過(guò)程中 根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培 養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過(guò)滅菌并預(yù)熱至37°C的耐熱保 護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過(guò)程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，并迅速進(jìn)行冷凍真空 干燥，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提供的凍干曲線2(見(jiàn)圖2)進(jìn)行，每頭份含 活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。實(shí)施例3成品檢驗(yàn)性狀白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。純粹檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹?；罹?jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)(按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行)，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白胨水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應(yīng)存活。剩余水分測(cè)定按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)不超過(guò)4. 0%。真空度測(cè)定按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個(gè)月。實(shí)施例4耐熱保護(hù)劑配方及凍干曲線的篩選通過(guò)10種保護(hù)劑基質(zhì)的“凍融”試驗(yàn)和“凍干”試驗(yàn)，初步明確了各種保護(hù)劑基質(zhì) 的適用濃度，谷氨酸鈉(0.5%、2%)、蔗糖(5%、7.5%)凍融試驗(yàn)菌存率最高；1.5%明膠5%蔗糖保護(hù)劑中加入0.5% 199培養(yǎng)基或0.5%谷氨酸鈉可明顯提高凍干菌存率(均達(dá) 71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍干菌存率達(dá)75%。1. 5%明膠、5%蔗糖中添 加0. 5% 2%谷氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使疫苗37°C保存7日的活菌減少率 分別為46 %、47 %和43 %、48 %，而明膠蔗糖對(duì)照為65 %。據(jù)此設(shè)計(jì)了 4種耐熱保護(hù)劑配方 1、2、3和4，與豬霍亂沙門(mén)氏菌菌液等量混合，分別用凍干曲線1、2進(jìn)行凍干，結(jié)果表明耐熱 保護(hù)劑配方1及凍干曲線2凍干效果最好。為了提高目前我國(guó)仔豬副傷寒活疫苗的菌存率，并方便疫苗的保存及運(yùn)輸，我們 進(jìn)行了該疫苗耐熱保護(hù)劑研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)(2006. 8. 29凍干，0. 3ml/支)，由中國(guó)獸醫(yī)藥 品監(jiān)察所提供。1. 2仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基(批號(hào)0102)由本發(fā)明人提供及配制。1. 3保護(hù)劑基質(zhì)水溶性明膠(批號(hào)115K0144)購(gòu)自Sigma公司；PVP購(gòu)自BASF公司；199培養(yǎng)基 (批號(hào)282288)購(gòu)自GIBCO公司；甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀、磷 酸氫二鉀均為分析純，進(jìn)口分裝，購(gòu)自北京拜爾迪生物公司。1. 4 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門(mén)氏菌制苗用菌液制備種子液按《規(guī)程》進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6個(gè)， 置37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min，收集所有的沉淀菌體，用 200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩沖液(附錄1)懸浮，充分混勻后，作為制苗用菌液。2. 2凍融試驗(yàn)2. 2. 1保護(hù)劑配制2. 2. 1. 1大分子保護(hù)劑配制稱取明膠6g及PVP12g，分別用注射用水定容至100ml，配制成6%明膠及12% PVP 貯液，2MNa0H調(diào)整pH值至7. 2，116°C滅菌30min。然后各取5ml用等量滅菌pH7. 2磷酸鉀 緩沖液稀釋成3%明膠及6% PVP。2. 2. 1. 2小分子保護(hù)劑配制稱取甘露醇10g、山梨醇10g、蔗糖15g、海藻糖15g、谷氨酸鈉15g和199培養(yǎng)基 2g，分別用pH 7. 2磷酸鉀緩沖液(磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解于IOOOml注 射用水中，116°C滅菌30min，pH值為7. 2)定容至100ml，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。然后按上 法用滅菌PH 7. 2磷酸鉀緩沖液稀釋成使用濃度。2. 2. 2 凍融分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液Iml與22種單基質(zhì)保護(hù)劑等量混合后(保護(hù)劑終濃度 如表1所示)，先置2 8°C 20min，后置_40°C冷凍保存4h。同時(shí)設(shè)不含保護(hù)劑基質(zhì)的磷 酸鉀緩沖液作對(duì)照。將各凍存菌液融化后，連同凍融前及對(duì)照樣品按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行活 菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算凍干菌存率。2. 3凍干試驗(yàn)
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2. 3. 1保護(hù)劑配制按2. 2. 1項(xiàng)進(jìn)行。2. 3. 2凍干分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液IOml與14種保護(hù)劑等量混合后(保護(hù)劑終 濃度如表2所示)，定量分裝(2ml/瓶)，按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行凍干。同時(shí)設(shè)1. 5%明 膠5%蔗糖作對(duì)照。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。2. 4耐熱保護(hù)劑配方及凍干曲線優(yōu)化2. 4. 1保護(hù)劑配制依據(jù)凍融和凍干試驗(yàn)結(jié)果，將能夠提高凍干菌存率及疫苗耐老 化性能的保護(hù)劑基質(zhì)，設(shè)計(jì)成4組耐熱保護(hù)劑(分別標(biāo)記為配方1、2、3和4)，其配方及配制 方法見(jiàn)附錄3。2. 4. 2凍干分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液50ml與4組保護(hù)劑等量混合后，定量分裝 (2ml/瓶)，按凍干曲線1及凍干曲線2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保 存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。通過(guò)比較結(jié)果選擇最佳耐熱保護(hù)劑和凍干曲線。2.結(jié)果2. 1凍融試驗(yàn)凍融試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1凍融試驗(yàn)中活菌計(jì)數(shù)及菌存率結(jié)果 注凍融菌存率計(jì)算方法按本發(fā)明提供的計(jì)算方法計(jì)算(下同)。表1結(jié)果顯示，在10種單基質(zhì)中，谷氨酸鈉(0. 5%、2% )、蔗糖(5%、7. 5% )菌 存率最高，可達(dá)60%以上；海藻糖(5% )、甘露醇(5% )、明膠(1.5%、3% )、199培養(yǎng)基 (0. 5% )次之，菌存率達(dá)50% 60%。
2. 2凍干試驗(yàn)樣品凍干前后及耐老化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2樣品凍干前后及耐老化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 注凍干后樣品及耐老化試驗(yàn)樣品用生理鹽水恢復(fù)至原量后進(jìn)行檢測(cè)，其凍干菌 存率及活菌減少率按本發(fā)明提供的計(jì)算方法計(jì)算(下同)。表2結(jié)果顯示，1. 5%明膠5%蔗糖保護(hù)劑中加入0. 5% 199培養(yǎng)基或0. 5%谷氨酸 鈉可明顯提高凍干菌存率(均達(dá)71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍干菌存率 達(dá)75 %。1. 5 %明膠、5 %蔗糖中添加0. 5 %、2 %谷氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使 疫苗37°C保存7日的活菌減少率分別為43%、48%。另外PVP (0. 1%)、199培養(yǎng)基(0.5%) 也有一定提高菌存率及耐老化作用。2. 3耐熱保護(hù)劑及凍干曲線優(yōu)化不同保護(hù)劑配方及凍干曲線的凍干結(jié)果見(jiàn)表3。表3不同保護(hù)劑配方及凍干曲線的凍干結(jié)果(活菌數(shù)108CFU/ml) 表3結(jié)果顯示，采用耐熱保護(hù)劑配方1與凍干曲線2凍干豬霍亂沙門(mén)氏菌 (CVCC79500株)效果最好，凍干后不結(jié)晶，凍干菌存率達(dá)86. 9% ；37°C保存7日不萎縮，活 菌減少率為15.0%。明顯優(yōu)于明膠蔗糖對(duì)照(其凍干菌存率為63.0%與55. ；37°C保 存7日后活菌減少率為71. 7%與68. 8% )。3小結(jié)與討論3. 1采用耐熱保護(hù)劑配方1與凍干曲線2凍干豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)效
果良好。3. 2某些單保護(hù)劑基質(zhì)(如0. 5%和2%谷氨酸鈉、5%和7. 5%蔗糖、5%海藻糖、 5%甘露醇、1. 5%和3%明膠、0. 5% 199培養(yǎng)基)可以提高豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500 株)在“凍結(jié)-解凍”的活性恢復(fù)率，可能是由于它們含有的糖醇羥基、或某些氨基酸成 分和菌膜表面的氨基基團(tuán)發(fā)生類似水合反應(yīng)，形成范德華表面張力，減少了冰晶對(duì)菌體 損傷° Scott (Scott, W. J. , In Recent Resear in Freezing and Drying. 1960,188 202. ) > Cho and Obayashi(Cho, CandObayashi, Y. , Bulletion of the World Health Orgination. 1956，14 :657.)曾報(bào)導(dǎo)使用谷氨酸鈉，在冷凍干燥過(guò)程中對(duì)病毒囊膜起到同 樣作用。3. 3在明膠大分子中添加少量PVP，可以更好的發(fā)揮保護(hù)劑與填充劑作用，因?yàn)?PVP可以抑制凍干過(guò)程中系統(tǒng)PH值降低(華澤釗.冷凍干燥新技術(shù).北京科學(xué)出版社， 2006. 1.)。3. 4該耐熱保護(hù)劑中大分子物質(zhì)主要形成耐熱框架，形成間接的隔熱層；小分子 物質(zhì)主要與菌體形成懸液，起直接作用。實(shí)施例5凍干保護(hù)劑使用方法
用耐熱保護(hù)劑將離心后菌體重懸浮成不同菌液濃度進(jìn)行配苗，結(jié)果，菌液濃度 100. 3X IO8 312X108CFU/ml，凍干菌存率達(dá)75. 7% 89. 8%，37°C保存7日后活菌減少 率為13% 18%，優(yōu)于其它濃度范圍。耐熱保護(hù)劑與菌液感作時(shí)間試驗(yàn)表明，2 8°C作 用24h，凍干菌存率達(dá)85. 3% 93. 1%，高于其它作用時(shí)間。7ml西林瓶疫苗分裝量3ml或 4ml，其凍干菌存率與2ml基本一致，而且耐老化試驗(yàn)中活菌減少率比2ml下降3 8個(gè)百 分點(diǎn)。為了明確耐熱保護(hù)劑在使用中相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行了配苗比例、保護(hù)劑感作時(shí)間以及 苗液分裝量比較試驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。1.2普通瓊脂(批號(hào)20090102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)20090102)、20%鋁膠生 理鹽水(批號(hào)20090102)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組供應(yīng)。1. 3仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基、仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑，由本發(fā)明人配制。1. 4 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門(mén)氏菌制苗用菌液制備種子液按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000版)》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》[1]) 進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6個(gè)，置37°C、200r/min振蕩培養(yǎng) 12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min，收集所有的沉淀菌體，用200ml滅菌磷酸鉀緩沖液(稱 取磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解于IOOOml注射用水中，116°C滅菌30min，pH值 為7. 2)懸浮，充分混勻后，作為制苗用菌液。2. 2耐熱保護(hù)劑的配苗試驗(yàn)用適量預(yù)熱至37°C的耐熱保護(hù)劑懸浮制苗用菌液成3組不同濃度第1組菌液濃 度約 700 X IO8 900X 108CFU/ml ；第 2 組菌液濃度約 300 X IO8 400 X 108CFU/ml ；第 3 組 菌液濃度約100 X IO8 200 X 108CFU/ml。然后定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍干曲 線2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后，以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)共 進(jìn)行3次。2. 3耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間的試驗(yàn)用耐熱保護(hù)劑將沉淀將制苗用菌液懸浮成200 X IO8 300X 108CFU/ml，置2 8°C感作0、24、48h，然后定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍干曲線2進(jìn)行凍干。分別取 凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)共進(jìn)行3次。2. 4耐熱保護(hù)劑活疫苗分裝量的比較試驗(yàn)將2. 3項(xiàng)3次試驗(yàn)半成品，分別以2ml、3ml、4ml量分裝，各分裝70瓶，按凍干曲線 2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。3 結(jié)果3. 1耐熱保護(hù)劑配苗比例試驗(yàn)不同菌液濃度凍干比較結(jié)果見(jiàn)表4表4不同菌液濃度凍干比較結(jié)果 表4結(jié)果顯示，菌液濃度在100 X IO8 300 X 108CFU/ml，凍干菌存率高，而37°C保 存7日耐老化結(jié)果基本一致。因《規(guī)程》要求每頭份不少于3X109CFU/ml，考慮到疫苗的頭 份數(shù)，因而適宜菌液濃度為200 X IO8 400 X 108CFU/ml。3. 2耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。表5保護(hù)劑與菌液感作時(shí)間比較試驗(yàn) 表5結(jié)果顯示，保護(hù)劑與菌液在2 8°C感作24h，凍干菌存率高于其它時(shí)間；而 37°C保存7日耐老化試驗(yàn)結(jié)果基本一致。3.3耐熱保護(hù)劑活疫苗分裝量比較試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。表6疫苗分裝量比較試驗(yàn) 表6結(jié)果顯示，7ml西林瓶疫苗裝量3ml或4ml，其凍干菌存率與2ml基本一致，且 置37°C保存7日的活菌減少率相對(duì)降低3 8個(gè)百分點(diǎn)。4結(jié)論與討論4. 1配苗比例是影響耐熱保護(hù)劑作用的重要因素，菌液濃度高，保護(hù)劑分子有效保 護(hù)菌體的資源相對(duì)不足。通過(guò)比較試驗(yàn)，確定適宜配苗濃度為200X IO8 400X 108CFU/ml。4. 2適當(dāng)延長(zhǎng)耐熱保護(hù)劑與菌液混合作用時(shí)間，有利于保護(hù)劑分子充分滲入菌體 內(nèi)，提高菌體的抗凍能力。但若細(xì)菌暴露在空氣中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，某些菌體體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化 氫蓄積對(duì)菌體有毒害作用，造成死亡。耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間結(jié)果表明，當(dāng)菌體與保護(hù) 劑2 8°C作用24h，其凍干菌存率最高，為85. 3% 93. 1 %，而耐老化試驗(yàn)結(jié)果基本一致 (活菌減少率達(dá)10% 20% )。4. 3充分利用西林瓶的空間，提高疫苗分裝量，是降低成本，提高疫苗頭份數(shù)的重 要手段，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在7ml西林瓶中分裝量達(dá)3 4ml，其凍干菌存率與2ml分裝量基本 一致，而其耐老化結(jié)果中活菌減少率相對(duì)降低3 8個(gè)百分點(diǎn)，主要由于瓶中菌液的高度增 加，凍干過(guò)程中延長(zhǎng)了冷凍時(shí)間、升華時(shí)間以及解析干燥時(shí)間。實(shí)施例6耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用試驗(yàn)采用篩選出耐熱保護(hù)劑1及凍干曲線2試制仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)3批。凍干后疫苗不結(jié)晶，37°C保存7日不萎縮，其純粹、活菌計(jì)數(shù)、安全性、 剩余水分和真空度均符合規(guī)定。凍干前活菌計(jì)數(shù)分別為5. 2X IO9CFU/頭份、6. 2X IO9CFU/ 頭份和5. 6X IO9CFU/頭份；凍干后活菌計(jì)數(shù)分別為4. 52X IO9CFU/頭份、5. 22X IO9CFU/頭 份和4. 76 X IO9CFU/頭份，凍干菌存率分別為87%、84%和85% ；置37°C保存7日，活菌計(jì) 數(shù)分別為3. 84 X IO9CFU/頭份、4. 36 X IO9CFU/頭份和4. OOX IO9CFU/頭份，活菌減少率分別 為15%、16.3%和15.9%，用37°C保存7日的耐熱保護(hù)劑活疫苗免疫兔，30日后攻毒均可 保護(hù)4/5 5/5，對(duì)照5/5死亡。運(yùn)用優(yōu)化的耐熱保護(hù)劑和凍干曲線試生產(chǎn)3批仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)，參照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基及耐熱保護(hù)劑，本發(fā)明人配制及提供。
1.2 菌種生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)；檢驗(yàn)用菌種為豬霍亂沙門(mén)氏菌 (CVCC79102株)，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。1.3培養(yǎng)基普通瓊脂(批號(hào)0102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)0102)、20%鋁膠生理鹽水(批 號(hào)0102)、純粹檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)、酪胨瓊脂(G.A)和葡萄糖蛋白胨湯(G.P) (批號(hào)0102)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組供應(yīng)。1.4 動(dòng)物小鼠ICR系，30 35日齡、體重18 22g，清潔級(jí)；大耳白兔體重1. 5 2. 0kg， 普通級(jí)；由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組采購(gòu)并提供。1. 5 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。1. 6 水分測(cè)定儀，METTLER TOLEDO。1. 7真空度測(cè)定儀，76-1型高頻電火花真空度測(cè)定儀。2 方法2.1菌液制備及配苗種子液按《規(guī)程》[1]進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6 個(gè)，置37°C、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500轉(zhuǎn)/分離心20min，棄去培養(yǎng)液，菌體沉 淀?yè)Q以250ml耐熱保護(hù)劑懸浮混勻，取樣進(jìn)行半成品檢驗(yàn)(活菌計(jì)數(shù)及純粹檢驗(yàn))，懸浮菌 液置2 8°C保存24h。2. 2 凍干待半成品檢驗(yàn)合格，定量分裝(3ml/瓶)。按凍干曲線2進(jìn)行凍干。試生產(chǎn)3批仔 豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(CVCC79500株)。2. 3 檢驗(yàn)2. 3. 1按《規(guī)程》進(jìn)行性狀、純粹、活菌計(jì)數(shù)、安全性、剩余水分和真空度等檢驗(yàn)。2. 3. 2耐老化試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫苗，每批隨機(jī)抽取疫苗8瓶，其中3瓶分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)， 以其平均數(shù)作為耐老化試驗(yàn)前的活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另5瓶置37°C保存7日，任取其中3瓶，分別 按上述方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。然后計(jì)算疫苗的活菌減少率。2. 3. 3效力試驗(yàn)從37°C保存7日的3批疫苗中，每批隨機(jī)抽取疫苗5瓶，按瓶簽注明頭份，注射組 用20%鋁膠生理鹽水混合稀釋成1頭份/ml ；灌服組用生理鹽水混合稀釋成1頭份/2ml ； 大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射和經(jīng)口灌服體重1. 5 2. OKg家兔各5只，1頭份/只，30日后，連同條 件相同的不接種對(duì)照兔5只，各皮下注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門(mén)氏 菌(CVCC79102株)菌液1. Oml (含3MLD的活菌)，觀察30日，記錄存活情況。3 結(jié)果3. 1菌液制備結(jié)果見(jiàn)表7。表7菌液制備及半成品檢驗(yàn)結(jié)果
3.2疫苗檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8、表9、表10。
表8仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果(一) 表9仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果(二) 表8、9結(jié)果顯示，3批仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗純粹，性狀、剩余水分、真空 度、安全檢驗(yàn)符合《規(guī)程》要求。表10疫苗凍干前后活菌數(shù)及耐老化試驗(yàn)結(jié)果 表10結(jié)果顯示，3批耐熱活疫苗凍干菌存率達(dá)80%以上(分別為87%、84%及 85% ) ；37 保存7日，活菌減少率低于20% (分別為15%、16. 3%及15. 9% )。
3. 3效力試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。表11 3批耐熱保護(hù)劑疫苗家兔效力檢驗(yàn)結(jié)果 表11中顯示，3批耐熱保護(hù)劑活疫苗37°C保存7日后，以1頭份口服及肌肉注射 免疫家兔攻毒均可保護(hù)4/5 5/5，效力確實(shí)。4 結(jié)論耐熱凍干保護(hù)劑1和凍干曲線2，適用于仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)的生產(chǎn)。實(shí)施例7耐熱保護(hù)劑保存期試驗(yàn)將3批耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存0日、10日、20日、30日和40日，分別制備凍干 疫苗，測(cè)定其凍干菌存率及凍干后置37°C保存7日耐老化試驗(yàn)的活菌減少率。結(jié)果保存40 日的耐熱保護(hù)劑制備的疫苗凍干菌存率為83. 7% 87. 5%，置37°C保存7日耐老化試驗(yàn)活 菌減少率為12.6% 17. 1%，與新鮮配制的保護(hù)劑(制備的疫苗凍干菌存率達(dá)82. 9% 87. 0%，37°C保存7日耐老化試驗(yàn)活菌減少率為15. 0% 16. 3% )結(jié)果基本一致。為確保 效果，耐熱保護(hù)劑2 8°C有效期定為30日。1 材料1. 1耐熱保護(hù)劑3批，批號(hào)分別為0101、0115、0210，由本發(fā)明人提供及配制。1. 2生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、
保管和供應(yīng)。1. 3 凍干機(jī)，Edwards 公司 Lyofle X 2. 0。1.4普通瓊脂(批號(hào)0102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)0102)由本發(fā)明人制備供應(yīng)。2 方法2. 1耐熱保護(hù)劑保存溫度及時(shí)間將本發(fā)明人按本法制備的3批配制好耐熱保護(hù)劑，批號(hào)分別為01、02、03，每批 1000ml，置2 8°C保存40日，并在0日、10日、20日、30日及40日等時(shí)間階段分別取樣 50ml。2. 2菌液制備、配苗及凍干
2. 2. 1種子液按《規(guī)程》方法進(jìn)行制備。然后按2%接種500ml合成培養(yǎng)基三角瓶 6個(gè)(裝量250ml/瓶)，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min后，菌 體沉淀用200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩沖液懸浮混勻，作為菌液。2. 2. 2將50ml耐熱保護(hù)劑樣品，各加入50ml抗原液，充分混勻后，定量分裝(3ml/ 瓶)，按凍干曲線2進(jìn)行凍干。2. 3活菌計(jì)數(shù)分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。3 結(jié)果3批耐熱保護(hù)劑的保存期試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。表12耐熱保護(hù)劑的保存期試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，3批耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存40日凍干菌存率為83. 7% 87. 5%， 置37°C保存7日活菌減少率為12. 6% 17. 1 %，與保存前的結(jié)果基本一致(凍干菌存率為 82. 9% 87% ；活菌減少率為15% 16. 3% )。4 結(jié)論因耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存40日與保存前的凍干菌存率、活菌減少率結(jié)果基本 一致。為確保效果，將耐熱保護(hù)劑2 8 有效期定為30日。實(shí)施例8與同類產(chǎn)品的比較研究報(bào)告仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(01、02和03)與常規(guī)仔豬副傷寒活疫苗(0205、 0306和0912)，進(jìn)行凍干菌存率、37°C保存7日耐老化試驗(yàn)、安全和效力試驗(yàn)比較。結(jié)果 3批耐熱保護(hù)劑活疫苗凍干菌存率分別為87 %、84 %和85 %，而常規(guī)疫苗為52 %、57 %和 60% ；37°C保存7日耐老化試驗(yàn)，耐熱保護(hù)劑活疫苗活菌減少率為15%、16%和18%，而常 規(guī)疫苗為75%、67%和73%;安全試驗(yàn)中，常規(guī)疫苗1 2日內(nèi)分別有1/5、2/5和1/5頭出現(xiàn)體溫升高、減食等過(guò)敏癥狀，然后自行恢復(fù)，耐熱保護(hù)劑活疫苗均無(wú)不良反應(yīng)，而口服免 疫兩者均無(wú)不良反應(yīng)；效力試驗(yàn)中，兩者攻毒保護(hù)結(jié)果基本一致。1 材料1.1 疫苗仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(CVCC79500株)，批號(hào)分別為01、02和03，均為15
頭份/瓶，由北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司實(shí)驗(yàn)室制備。仔豬副傷寒活疫苗(以下簡(jiǎn)稱“常規(guī)疫苗”)，批號(hào)分別為0205、0306和0912，均為 15頭份/瓶，由吉林正業(yè)塵物制品有限公司提供。1. 2檢驗(yàn)用豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79102株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和提供。1. 3仔豬30日齡、體重12kg以上、斷乳，普通級(jí)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 組采購(gòu)和提供。2 方法2. 1凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)分別按各自《規(guī)程》制備仔豬副傷寒常規(guī)疫苗3批(01、02和03)和仔豬副傷寒耐 熱保護(hù)劑活疫苗3批(0205、0306和0912)。各取凍干前和后、37°C保存7日樣品按現(xiàn)行《中 國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。2. 2安全檢驗(yàn)取耐熱保護(hù)劑活疫苗和常規(guī)疫苗各3批，每批10瓶，按瓶簽注明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至2頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至2頭份/ml，耳后淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭。同時(shí)設(shè)5頭不免疫仔豬對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察21日，記錄仔豬的采食、飲水和體溫情況。2. 3效力檢驗(yàn)取耐熱保護(hù)劑活疫苗和常規(guī)疫苗各3批，每批10瓶，按瓶簽注明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至1頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至1頭份/ml，耳后淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭；同時(shí)設(shè)立5頭不免疫仔豬對(duì)照。在免疫后30日，各靜脈注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培 養(yǎng)2代的豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79102株)菌液2. Oml (含IMLD活菌)。隔離飼養(yǎng)，觀察21 日，記錄仔豬的存活情況。3 結(jié)果3. 1凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表13表13 3批實(shí)驗(yàn)室制品與常規(guī)疫苗的凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)比較結(jié)果 *表中凍干后及耐老化試驗(yàn)樣品用生理鹽水恢復(fù)至原量后進(jìn)行檢測(cè)，凍干菌存率 及活菌減少率計(jì)算按本發(fā)明提供的方法進(jìn)行。表13顯示，耐熱保護(hù)劑活疫苗的凍干菌存率為84% 87% ；常規(guī)疫苗為52% 60% ；37 保存7日，耐熱保護(hù)劑活疫苗的活菌減少率為15% 18% ；常規(guī)疫苗為67% 75%。3. 2安全檢驗(yàn) 表14顯示，耐熱保護(hù)劑活疫苗以2頭份肌肉接種仔豬，其采食、飲水、體溫均正常。
19 表15顯示，3批耐熱保護(hù)劑活疫苗與常規(guī)疫苗以1頭份口服及肌肉注射免疫仔豬， 攻毒均可保護(hù)4/5 5/5，無(wú)顯著差異。4 結(jié)論通過(guò)比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)耐熱保護(hù)劑活疫苗與已有的仔豬副傷寒活疫苗相比，凍干菌 存率高(達(dá)84% 87% ) ；37°C保存7日的活菌減少率低(達(dá)15% 18% )；其過(guò)敏反應(yīng) 低；兩者效力檢驗(yàn)結(jié)果一致。
而常規(guī)疫苗肌肉注射后1 2日部分豬出現(xiàn)體溫升高、減食等過(guò)敏癥狀，但可自行恢復(fù)；口 服免疫豬，兩者結(jié)果一致，均無(wú)不良反應(yīng)。3. 3效力檢驗(yàn)表15 3批耐熱保護(hù)劑疫苗與常規(guī)疫苗的效力檢驗(yàn)結(jié)果
護(hù)況 保情
觀間} 毒時(shí)日 攻察<
攻毒途徑弓劑量
觀間} 疫時(shí)H 免察C
疫量 免劑
疫徑 免途
豬數(shù)量 (頭)
批號(hào)
權(quán)利要求
一種仔豬副傷寒活疫苗，其特征是該疫苗含有豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79500株及水溶性明膠、PVP、山梨醇、蔗糖、199培養(yǎng)基、L 谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀組成的耐熱凍干保護(hù)劑。
2.一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是將種子液按培養(yǎng)基總量的 2% 接種于普通肉湯或本發(fā)明提供的液體合成培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng) 過(guò)程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH 值；培養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過(guò)滅菌并預(yù)熱至37°C的耐 熱凍干保護(hù)劑，充分混勻，分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而成，每頭份活菌數(shù)不少于3X 109CFU。
3.按照權(quán)利要求1和2所述的仔豬副傷寒活疫苗及其生產(chǎn)方法，其特征是其中所使用 耐熱凍干保護(hù)劑的最佳配方是水溶性明膠10g，PVP lg,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養(yǎng)基 5g, L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明提供的生產(chǎn)方法中采用了合成培養(yǎng)基和耐熱凍干保護(hù)劑及其相適應(yīng)的凍干曲線一整套技術(shù)，提高豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79500株培養(yǎng)菌數(shù)，保證批次間穩(wěn)定性，減少凍干過(guò)程的損失率，降低菌體死亡和代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)，將成品疫苗的保存溫度提高到2～8℃，有效期達(dá)到18～24個(gè)月，并可實(shí)現(xiàn)較高溫度短期保存(37℃保存7日，活菌減少率低于20％)。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101912608SQ20101025459
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者劉延亭, 孫曄, 朱良全, 王棟 申請(qǐng)人:北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司