專利名稱：一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡聚糖技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備可溶性酵母葡聚糖的方法。
背景技術(shù)：
酵母β -D-葡聚糖(簡(jiǎn)稱酵母β -葡聚糖或酵母葡聚糖)是一種擁有良好生理功能的免疫調(diào)節(jié)劑(非特異性免疫增強(qiáng)劑)，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗菌消炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、抗輻射、降低血脂等生理功效，但是它不溶于水和絕大多數(shù)其它溶劑，僅微溶于二甲亞砜，這嚴(yán)重限制了酵母葡聚糖的應(yīng)用。為了提高酵母葡聚糖的溶解度，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了修飾和改性研究，包括化 學(xué)方法和物理方法。主要的化學(xué)修飾法有磷酸化、羧甲基化、硫酸酯化和磺基化修飾,通過(guò)在葡聚糖上連接這些極性基團(tuán)來(lái)增加其溶解度。但是這類反應(yīng)通常都要在液態(tài)均相或非均相體系中進(jìn)行，需要消耗大量的溶劑，甚至是不安全有機(jī)溶劑以及酸、堿等，不僅成本高、污染嚴(yán)重，還可能造成安全隱患。主要的物理方法為超聲解聚和氧化降解法，通過(guò)降低葡聚糖的分子量來(lái)增加其溶解度。但是超聲解聚只能降低葡聚糖的分子量到一個(gè)極限恒定值，而氧化降解則會(huì)在葡聚糖中引入氧化劑等雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法。采用本方法制備的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，并具有優(yōu)良的免疫活性，同時(shí)本方法具有簡(jiǎn)便、快速、高效、不使用有機(jī)溶劑和強(qiáng)酸、強(qiáng)堿試劑的特點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，采用機(jī)械化學(xué)方法，在固相體系中，通過(guò)固態(tài)化學(xué)反應(yīng)對(duì)酵母葡聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾和改性。具體過(guò)程如下
(1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態(tài)小分子修飾試劑按質(zhì)量比I:f10混合好后，采用機(jī)械化學(xué)方法處理4飛Omin ；
(2)將步驟(I)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質(zhì)量比為1:5 20 ;如果產(chǎn)生沉淀，則通過(guò)離心除去不溶物，從而得到溶解液；
(3)對(duì)步驟(2)得到的溶解液進(jìn)行透析或超濾，除去多余的修飾試劑，得到酵母葡聚糖溶液。將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進(jìn)行濃縮后，可以得到酵母葡聚糖濃縮液；將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。所述機(jī)械化學(xué)方法為行星式球磨。所述固態(tài)小分子修飾試劑包括硫酸鹽、磷酸化合物或氯乙酸鹽。制得的酵母葡聚糖的化學(xué)修飾度，即磷酸基團(tuán)、硫酸基團(tuán)或羧甲基基團(tuán)的取代度為O. 4 60%。所述硫酸鹽包括且不限于硫酸銨、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鈉、硫酸鋁鉀；磷酸化合物包括且不限于磷酸鈣、次磷酸鈣、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸氫鈣、焦磷酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、酸式焦磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、聚偏磷酸鉀、多聚磷酸、多聚磷酸鈉；氯乙酸鹽包括且不限于一氯乙酸鈉、二氯乙酸鈉。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于
本發(fā)明制備方法屬于機(jī)械化學(xué)方法，機(jī)械化學(xué)是一種不同于熱化學(xué)、電化學(xué)和光化學(xué)的第四種化學(xué)活化形式，是指固體顆粒物質(zhì)在摩擦、碰撞、沖擊、剪切等機(jī)械力作用下，使晶體結(jié)構(gòu)及物化性能發(fā)生改變，把機(jī)械能高效轉(zhuǎn)化成固體物質(zhì)內(nèi)能，提高固體物質(zhì)化學(xué)活性，反應(yīng)過(guò)程只需低反應(yīng)溫度和較低的能量消耗，并且可以實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。本發(fā)明采用行星式球磨(簡(jiǎn)稱為行星磨)，在固態(tài)體系中對(duì)酵母葡聚糖進(jìn)行修飾和改性，從而達(dá)到快速、高效的酵母β-葡聚糖增溶效果，提高它們的生物活性。本發(fā)明不使用有機(jī)溶劑和強(qiáng)酸、強(qiáng)堿試劑，幾乎沒(méi)有污染，制得的酵母β -葡聚糖能夠完全溶于水，且具有優(yōu)良的免疫活性，因此有望有效地應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中，提升酵母
葡聚糖作為生物免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說(shuō)明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。以下實(shí)施例中所用酵母葡聚糖原料為上海杰康諾生物科技有限公司生產(chǎn)的酵母β _匍聚糖GNP-80。實(shí)施例I :機(jī)械化學(xué)法制備磷酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與磷酸鈣以質(zhì)量比1:1混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為900 W，處理時(shí)間為4 min;處理后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:5溶解于水后，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min，其中42%的酵母葡聚糖溶于水，58%的酵母葡聚糖不溶于水；將溶于水的溶解液用水進(jìn)行多次透析，以除去多余的磷酸化合物。透析后的酵母葡聚糖濃度為12. I mg/ml，磷酸基團(tuán)取代度為O. 4%。實(shí)施例2 :機(jī)械化學(xué)法制備硫酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與硫酸鈉以質(zhì)量比1:6混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為900 W，處理時(shí)間為12 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:5溶解于水后，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min，其中36%的酵母葡聚糖溶于水，64%的酵母葡聚糖不溶于水；將溶于水的溶解液用水進(jìn)行多次透析，以除去多余的硫酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為8. 8 mg/ml，硫酸基團(tuán)取代度為I. 9%。實(shí)施例3 :機(jī)械化學(xué)法制備硫酸化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖與硫酸銨以質(zhì)量比1:6混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為1200 W，處理時(shí)間為16 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:20溶解于水中，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min后沒(méi)有沉淀；將溶解液用水進(jìn)行多次透析，以除去多余的硫酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為6. O mg/ml,硫酸基團(tuán)取代度為6. 6%。將透析后的酵母葡聚糖經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，再稀釋至合適濃度后進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，濃度為50 g/ml時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為117. 7%，濃度為200 g/ml時(shí)增殖率為196. 6%，說(shuō)明硫酸化酵母葡聚糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有刺激增殖作用。實(shí)施例4 :機(jī)械化學(xué)法制備磷酸化酵母葡聚糖方案2酵母葡聚糖與焦磷酸鈉以質(zhì)量比1:6混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為1200 W，處理時(shí)間為20 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:20溶解于水中，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min后沒(méi)有沉淀；將溶解液用水進(jìn)行多次透析，以除去多余的磷酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為20. 6 mg/ml，磷酸基團(tuán)取代度為1.4%。將透析后的酵母葡聚糖經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，再稀釋至合適濃度后進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，濃度為50 g/ml時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為121. 8%，濃度為200 g/ml時(shí)增殖率為123. 8%，說(shuō)明磷酸化酵母葡聚糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有刺激增殖作用。實(shí)施例5 :機(jī)械化學(xué)法制備羧甲基化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與一氯乙酸鈉試劑以質(zhì)量比1:4混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為1200 W，處理時(shí)間為16 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:20溶解于水中，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min后沒(méi)有沉淀；將溶解液用水進(jìn)行多次透 析，以除去多余的小分子鹽類。透析后的酵母葡聚糖濃度為24. 8 mg/ml，羧甲基取代度為2. 0%。將透析后的酵母葡聚糖經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，再稀釋至合適濃度后進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，濃度為50 g/ml時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為120. 4%，濃度為200 g/ml時(shí)增殖率為215. 0%，說(shuō)明羧甲基化酵母葡聚糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有刺激增殖作用。實(shí)施例6 :機(jī)械化學(xué)法制備羧甲基化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖與二氯乙酸鈉試劑以質(zhì)量比1:10混合均勻后，采用行星磨進(jìn)行機(jī)械化學(xué)處理，功率為1200 W，處理時(shí)間為60 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以質(zhì)量比1:10溶解于水中，使用離心機(jī)在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心20 min后沒(méi)有沉淀；將溶解液用水進(jìn)行多次透析，以除去多余的小分子鹽類。透析后的酵母葡聚糖濃度為7. 6 mg/ml，羧甲基取代度為59. 8%。上述實(shí)施例中，磷酸基團(tuán)取代度、硫酸基團(tuán)取代度、羧甲基基團(tuán)取代度統(tǒng)稱為化學(xué)修飾度。酵母葡聚糖濃度的測(cè)定采用測(cè)定植物糖濃度的蒽酮法。磷酸基團(tuán)取代度的測(cè)定采用定磷法測(cè)定磷酸化酵母葡聚糖中磷酸基團(tuán)的摩爾濃度，磷酸化酵母葡聚糖的磷酸基團(tuán)摩爾濃度與它的葡萄糖基團(tuán)摩爾濃度之比即為磷酸基團(tuán)取代度。硫酸基團(tuán)取代度的測(cè)定采用濁度法測(cè)定硫酸化酵母葡聚糖中硫酸基團(tuán)的當(dāng)量濃度，硫酸化酵母葡聚糖的硫酸基團(tuán)當(dāng)量濃度與它的葡萄糖基團(tuán)摩爾濃度之比即為硫酸基團(tuán)取代度。硫酸基團(tuán)的當(dāng)量濃度測(cè)定用3%三氯乙酸將硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基釋放出來(lái)，與鋇離子在明膠中形成渾濁，于波長(zhǎng)500nm下測(cè)定濁度，以硫酸鉀作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基團(tuán)含量。羧甲基取代度的測(cè)定化學(xué)絡(luò)合滴定法。取I mL羧甲基化酵母葡聚糖溶液，力口50 mL 水，20 mL NH4Cl 緩沖溶液，再用 O. I mol/L HCl 或 O. I mol/L NaOH 將溶液 pH 調(diào)至7. 5 8. O。轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加入50 mL CuSO4溶液，搖勻，放置15 min。稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取濾液100 mL，用紫脲酸銨作指示劑，用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。相同條件下測(cè)硫酸銅溶液空白。羧甲基取代度為162A/(8100-80A)，其中A=C(Ki) X2X0. 162+W，C為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，K為CuSO4空白用去EDTA的體積，K為樣品用去EDTA的體積，W為樣品中葡聚糖的質(zhì)量。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的檢測(cè)(1)小鼠淋巴細(xì)胞的制備將小鼠頸椎脫臼處死，取脾臟，用PBS沖洗:Γ4次。將脾臟磨碎后過(guò)100目篩，過(guò)篩后的混懸液以400 rpm離心6min。吸去上清液,沉淀中按每只小鼠I. 5 mL的量加入氯化銨紅細(xì)胞裂解液,反復(fù)沖打,靜置10 min后,加PBS至50 mL,然后以400 rpm離心6 min,吸去上清液,加PBS緩沖液沖洗并離心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)基混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并稀釋成2 X IO6個(gè)/mL細(xì)胞液備用。(2)細(xì)胞培養(yǎng)將2X IO6個(gè)/mL淋巴細(xì)胞懸浮液加至96孔板中，每孔加180 μ L，同時(shí)加入20 μ L樣品液，以20 μ L PBS和20 μ L 60 μ g/mL的PHA溶液分別作陰、陽(yáng)性對(duì)照。于37°C、含5%的CO2條件下培養(yǎng)3d。(3)淋巴細(xì)胞增殖率的測(cè)定在上述細(xì)胞培養(yǎng)的96孔板中，每孔分別加入20 μ I 5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，將96孔板于2000 rpm離心6 min,小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μ I 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD57tlnm處測(cè)量各孔的吸光值。 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。增殖率(％) = (0D570sample/0D570_tMl) X 100%。以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例。可以理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于采用機(jī)械化學(xué)方法，在固相體系中，通過(guò)固態(tài)化學(xué)反應(yīng)對(duì)酵母葡聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾和改性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于具體過(guò)程如下 (1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態(tài)小分子修飾試劑按質(zhì)量比I:f 10混合好后，采用機(jī)械化學(xué)方法處理4飛Omin ； (2)將步驟(I)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質(zhì)量比為1:5 20 ;如果產(chǎn)生沉淀，則通過(guò)離心除去不溶物，從而得到溶解液； (3)對(duì)步驟(2)得到的溶解液進(jìn)行透析或超濾，除去多余的修飾試劑，得到酵母葡聚糖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進(jìn)行濃縮后，可以得到酵母葡聚糖濃縮液；將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述機(jī)械化學(xué)方法為行星式球磨。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述固態(tài)小分子修飾試劑包括硫酸鹽、磷酸化合物或氯こ酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于制得的酵母葡聚糖的化學(xué)修飾度，即磷酸基團(tuán)、硫酸基團(tuán)或羧甲基基團(tuán)的取代度為O. 4飛0%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述硫酸鹽包括且不限于硫酸銨、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鈉、硫酸鋁鉀； 磷酸化合物包括且不限干磷酸鈣、次磷酸鈣、磷酸氫ニ銨、磷酸ニ氫銨、磷酸氫鈣、焦磷酸鈣、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀、酸式焦磷酸鈉、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、聚偏磷酸鉀、多聚磷酸、多聚磷酸鈉； 氯こ酸鹽包括且不限于ー氯こ酸鈉、ニ氯こ酸鈉。
全文摘要
一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，采用機(jī)械化學(xué)方法，在固相體系中，通過(guò)固態(tài)化學(xué)反應(yīng)對(duì)酵母葡聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾和改性，具體過(guò)程(1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態(tài)小分子修飾試劑按質(zhì)量比1:1~10混合好后，采用機(jī)械化學(xué)方法處理4~60min；(2)將步驟(1)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質(zhì)量比為1:5~20；如果產(chǎn)生沉淀，則通過(guò)離心除去不溶物，從而得到溶解液；(3)對(duì)步驟(2)得到的溶解液進(jìn)行透析或超濾，除去多余的修飾試劑即可。采用本方法制備的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，具有優(yōu)良的免疫活性，本方法具有簡(jiǎn)便、快速、高效、不使用有機(jī)溶劑和強(qiáng)酸、強(qiáng)堿試劑的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P37/02GK102838688SQ201210336178
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者史鋒, 李永富, 石紀(jì)奎 申請(qǐng)人:江南大學(xué)