專利名稱：：一類木質(zhì)素黃酮類化合物及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及具有抑制黃嘌呤氧化酶、對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用、防治老年性癡呆癥、防治由自由基損傷引起的肝細(xì)胞損傷的一類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物的制備方法及其醫(yī)藥用途。藥理學(xué)試驗(yàn)表明該類化合物具有強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物。此外，該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞即PC12細(xì)胞損傷作用，也即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以預(yù)期用于制備該類藥物的用途。另外，該類化合物還被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)效保護(hù)由自由基損傷引起的肝細(xì)胞損傷作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為預(yù)防或治療急、慢性肝損傷類疾病、保肝護(hù)肝類藥物或藥物組合物。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素黃酮類化合物是一類具備眾多藥效學(xué)活性的雜木質(zhì)素類化合物，其來(lái)源于由一分子苯丙素和一分子黃酮結(jié)合而成的一類含有C6-C3-C6-C3-C6結(jié)構(gòu)單元的天然產(chǎn)物。其代表性化合物當(dāng)屬一個(gè)由二氫黃酮醇和一分子苯丙素組成的二氫黃酮醇木質(zhì)素，即存在于菊科植物水飛薊的種子中的天然產(chǎn)物水飛薊賓。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在市場(chǎng)上其商品名為利肝隆(LegalonTM或Flavobion)。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等人，Am.J.Gastroenterol,1998,93,139—143;SailerR.等人，Drugs,200L61(14)，2035-2063)。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也較高，故關(guān)于水飛薊賓之藥效學(xué)研究最為廣泛。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局制訂的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)水飛薊素一欄中，要求含水飛薊素以水飛薊賓計(jì)算，不得少于68%。該藥作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù)作用；(二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜；(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生；(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。水飛薊賓類化合物具有確切的療效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了該藥物的市場(chǎng)。故尋找水飛薊賓類新的衍生物，包括尋找結(jié)構(gòu)上跨度更大的二氫黃酮醇木質(zhì)素類衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥，實(shí)屬必要。本發(fā)明根據(jù)此線索，設(shè)計(jì)并合成了一類具有新穎骨架結(jié)構(gòu)的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素的類似物，并以對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞之抗氧化損傷保護(hù)作用作為藥效學(xué)篩選模型對(duì)其清除由雙氧水H202引起的自由基、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效能進(jìn)行評(píng)估，以期篩選出能夠有效抑制或減緩中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡、保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥的先導(dǎo)化合物。另外，該類化合物還被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)效保護(hù)由自由基損傷引起的肝細(xì)胞損傷作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為預(yù)防或治療急、慢性肝損傷類疾病、保肝護(hù)肝類藥物。此外，痛風(fēng)病也是常見(jiàn)的多發(fā)性疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證實(shí)痛風(fēng)病的致病因素之一是黃嘌呤氧化酶(EC1.2.3.2,簡(jiǎn)稱為XO)。此酶是體內(nèi)核酸代謝的一個(gè)重要酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸和超氧陰離子，若機(jī)體不能及時(shí)清除產(chǎn)生的尿酸，使尿酸結(jié)晶鹽在關(guān)節(jié)處沉積，就會(huì)引起痛風(fēng)；產(chǎn)生過(guò)多的超氧陰離子也可引起多組織受損，因此測(cè)定化合物對(duì)XO的作用對(duì)發(fā)現(xiàn)新的XO抑制劑有重要意義。從天然產(chǎn)物以及其衍生物中篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑先導(dǎo)化合物也是開發(fā)治療痛風(fēng)病新藥的重要任務(wù)。綜上所述，本發(fā)明涉及一類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素的多種藥效學(xué)活性及其用于制備防治相關(guān)疾病藥物的用途，測(cè)試并發(fā)現(xiàn)其抑制黃嘌呤氧化酶活性，對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，從而可以預(yù)期其發(fā)展成為防治老年性癡呆癥藥物、保肝護(hù)肝藥物以及由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物或藥物組合物，由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一類具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素或其可藥用鹽5OHO式(I)其中，Ri為氫原子或甲氧基；當(dāng)R,為氫時(shí)，R2是氫原子、甲氧基或芐氧基；當(dāng)Ri為甲氧基時(shí)，R2是甲氧基。本發(fā)明的式(I)化合物為化合物I-a:(±)_2-[2，3-二氫-2~(3-甲氧基4-羥基苯基)~3~^甲基-1,4苯并二氧六環(huán)—5]—2,3—二氫—3，5,7—三羥基_4//—l-苯并吡喃+酮；化合物I-b:(±)~2-[2,3-二氫-2-(3-芐氧基+羥基苯基)~3"|圣甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3,5,7-三羥基"4//-1-苯并吡喃+酮；化合物I~c:(士)_2-[2，3-二氫-2-(3，5-二甲氧基4~^基苯基)~3~|2甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3，5,7-三羥基4//-l-苯并吡喃+酮；化合物(±>~2-[2，3-二氫-2~(4~羥基苯基)~3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基"4/f-l-苯并吡喃+酮。6本發(fā)明還提供了一種制備式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物的方法，其特征是(±)~2-(2，3-二羥基苯基)2，3-二氫-3，5，7-三羥基_4//-1—苯并吡喃_4-酮在銀鹽催化下，與取代的對(duì)羥基肉桂醇進(jìn)行偶合反應(yīng)而得；OHO其中，Ri為氫原子或甲氧基；當(dāng)&為氫時(shí)，R2是氫原子、甲氧基或芐氧基；當(dāng)&為甲氧基時(shí)，R2是甲氧基。此外，本發(fā)明的另一目的是提供了一種式(I)所示之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽用于制備一種基于對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制的防治老年性癡呆癥藥物的用途。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了一種由式(I)所示之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物或其可藥用鹽制備基于對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制的防治老年性癡呆癥之藥物組合物，其中含有治療有效量的式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽和藥用輔料。本發(fā)明的另一目的是提供了式(I)所示之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽用于制備治療由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病等疾病之藥物的用途。本發(fā)明的又一目的是提供了一種防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物或藥物組合物，其中含有治療有效量的式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽和藥用輔料。本發(fā)明的再一目的是提供了式(I)所示之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽用于制備防治由自由基損傷引起的肝細(xì)胞損傷及急性、慢性肝損傷類疾病、保肝護(hù)肝類藥物的用途。本發(fā)明還有一目的就是提供了一種預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病的保肝護(hù)肝類藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)示的二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明涉及的式(I)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素是一類具有強(qiáng)效抗氧化活性的源于天然產(chǎn)物的衍生物，該類化合物具有抑制黃嘌呤氧化酶活性、對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷保護(hù)作用的能力、抗自由基、保護(hù)肝細(xì)胞減輕雙氧水導(dǎo)致?lián)p傷的作用，從而可預(yù)期發(fā)展成為抗痛風(fēng)病藥物、防治老年性癡呆癥藥物及保肝護(hù)肝藥物的制藥用途。該類化合物源于天然產(chǎn)物，故而對(duì)人體毒性低，具有潛在的巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明中式(I)化合物制備產(chǎn)率較高，成本低，污染小，符合節(jié)能減排、環(huán)境友好的要求，適于產(chǎn)業(yè)化。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面首先用實(shí)施例的形式說(shuō)明化合物制備的過(guò)程，實(shí)施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。其中，OMe是指甲氧基；OMOM是指甲氧甲氧基；OBn是指芐氧基。實(shí)施例1:化合物I-a即(±>_2-[2，3-二氫-2~(3-甲氧基+羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3，5,7-三羥基~4//-1-苯并吡喃4-酮的制備2,3-二羥基苯甲醛4.8克溶于30毫升丙酮，攪拌10分鐘后加入碳酸鉀17.5克，再滴加氯甲醚6毫升，加熱回流l小時(shí)，過(guò)濾，濾液濃縮得到黃色油狀物7.0克，直接用于下一步反應(yīng)。1.1起始物A的制備:81.2起始物B的制備:OMOMOMOM起始物B將2.6克的氫化鈉的40毫升DMF溶液冰水浴冷卻，于氮?dú)獗Ｗo(hù)狀態(tài)下滴加5.6克2,4,6-三羥基苯乙酮的60毫升苯和7.0毫升DMF的混合溶液，冰浴冷卻下滴加9.0毫升氯甲醚溶液，室溫下攪拌24小時(shí)。傾入100毫升10%氫氧化鈉水溶液中，乙醚提取3次，每次50毫升，飽和碳酸氫鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮，40克200-300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯4:l洗脫，得到7.0克起始物B(2,4，6-三甲氧甲氧基苯乙酮)。黃色油狀物；Rf(石油醚/3:1):0.30;核磁共振氫譜(400MHz,氘代氯仿)S2.52(單峰，3H，CH3)，3.50(單峰，9H,OCH3)，5.17(單峰，6H,OCH20)，6.52(單峰，2H，H-3,5)。1.3中間體査耳酮的制備2.8克氫氧化鉀溶入30毫升甲醇中，攪拌狀態(tài)下滴加1.4克起始物A和1.3克起始物B的混合甲醇溶液10毫升，室溫下攪拌8小時(shí)，減壓蒸除溶劑，向殘留物中加入20毫升水，醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有機(jī)層，減壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)30克200-300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯3:l洗脫，得到1.76克中間體查耳酮。黃色油狀物；Rf(石油醚/醋酸乙酯2:1):0.38;UV:(甲醇)Xmax:209，300nm。用于下一步反應(yīng)。1.4中間體環(huán)氧査耳酮的制備1.4克中間體査耳酮溶于25毫升甲醇中，加入1.6毫升2N氫氧化鉀水溶液，再加入1.6毫升30%雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入25毫升水，減壓濃縮，用醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)20克200-300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯3:l洗脫，得到l.l克中間體環(huán)氧查耳酮。黃色油狀物；Rf(石油醚/醋酸乙酯2:1):0.33;UV:(甲醇)？jnax:210,285nm。用于下一步反應(yīng)。1.5(±)~2-(2,3-二羥基苯基)2,3-二氫-3，5，7-三羥基4//-1-苯并吡喃"4~酮的中間體査耳酮中間體環(huán)氧査耳酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>1.0克中間體環(huán)氧査耳酮溶解于15毫升甲醇中，攪拌狀態(tài)下加至溶解有1.5毫升濃鹽酸的IO毫升甲醇溶液中，升溫60。C反應(yīng)半小時(shí)，撤去加熱，冷卻后減壓蒸除溶劑，向殘余物中加入50毫升水，用醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗2次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)20克200300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯3:l洗脫，得到97毫克(±)-2-(2，3-二羥基苯基)2，3-二氫-3，5，7-三羥基4//-1-苯并吡喃斗酮。黃色油狀物Rf(氯仿/甲醇=3:1):0.23;電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:303(M-l)+。1.6化合物I-a的制備向干燥的反應(yīng)瓶中投入碳酸銀0.22克，加入20毫升無(wú)水苯和5毫升無(wú)水丙酮，室溫下滴加90毫克(±)~2-(2,3-二羥基苯基)2，3-二氫-3,5,7-三羥基_4//-1-苯并吡喃^-酮的無(wú)水苯溶液5毫升和96毫克3-甲氧基-4-羥基肉桂醇的無(wú)水丙酮溶液3毫升，在55。C時(shí)保溫反應(yīng)20小時(shí)。冷至室溫后靜置，濾去不溶物，母液減壓濃縮，得黃色油狀物，經(jīng)20克200~300目硅膠柱層析，氯仿/甲醇10:l洗脫，得到22毫克化合物I-a。Rf(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11:0.5:1:1:0.1):0.27;核磁共振氫譜&NMR(400MHz,氘代丙酮)&3.84(單峰，3H,OMe),3.96(多重峰，1H，H—23a)，4.18(多重峰，1H,H—23b),4.80(多重峰，1H，H-ll)，4.96(雙峰,J=11.2Hz，1H，H-3)，5.53(多重峰，1H，H-12)，5.67(雙峰，J=11.2Hz，1H,H—2),5.85(雙峰，J=1.2Hz,1H，H—6),5.88(雙峰，J=1.2Hz,1H,H—8),6.78~6,92(多重峰，4H，H-15,18，21，22)，7.01(雙峰，J=8.0Hz，1H,H-16)，7.10(雙峰，J=8.0Hz，1H，H—14)，10.07(寬單峰，1H，OH-20)，10.50(寬單峰，1H,OH-7)，12.37(單峰，1H，5-OH);電噴霧質(zhì)譜ESI國(guó)MS:481(M-l)+。實(shí)施例2:化合物I-b即(±>~2-[2，3-二氫-2~<3-芐氧基4一圣基苯基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3,5，7-三羥基~4//-1-苯并吡喃^"酮的制備10按照實(shí)施例1中所述合成方法，由(±)~2-(2,3-二羥基苯基)2，3-二氫-3,5，7-三羥基"4//—1—苯并吡喃~4~酮與3—節(jié)氧基+羥基肉桂醇進(jìn)行偶合反應(yīng)，最終得到36毫克化合物I-b。Rf(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11:0.5:1:1:0.1):0.29;電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:557(M-l)+。實(shí)施例3:化合物I-c即(±)~2-[2,3-二氫-2~(3，5-二甲氧基+羥基苯基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基4//-1-苯并吡喃4-酮的制備按照實(shí)施例1中所述合成方法，由(±)~2-(2,3-二羥基苯基)2,3-二氫-3,5,7-三羥基~4//-1-苯并吡喃~4-酮與3,5-二甲氧基~4-羥基肉桂醇進(jìn)行偶合反應(yīng)，最終得到26毫克化合物I"C。Rf(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11:0.5:1:1:0.1):0.24;電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:511(M-1)+。實(shí)施例4:化合物14即(±)~2-[2,3-二氫-2~(4~羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3,5,7-三羥基4//-1-苯并吡喃4-酮的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>按照實(shí)施例1中所述合成方法，由(±)"2-(2,3-二羥基苯基)2，3-二氫-3，5,7-三羥基4W-1—苯并吡喃~4~酮與4一5基肉桂醇進(jìn)行偶合反應(yīng)，最終得到18毫克化合物I"d。Rf(氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11:0.5:1:1:0.1):0.15;電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:451(M-l)+。本發(fā)明中所涉及之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物及其可藥用鹽具有多種重要的生理活性，經(jīng)本發(fā)明人完成的藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)該類化合物具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以預(yù)期作為治療痛風(fēng)類疾病的藥物。此外，該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以用于制備保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥物的用途。此外，本發(fā)明人將該系列B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物對(duì)過(guò)氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細(xì)胞損傷體外模型進(jìn)行了肝細(xì)胞損傷保護(hù)活性篩選。該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。本發(fā)明又對(duì)該類化合物抗氧自由基活性進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基的活性。以上活性表明該類化合物可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。本發(fā)明中的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，可用于治療痛風(fēng)類疾病。此外，該類化合物還可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到防止自由基氧化損傷腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物或藥物組合物，可以用于保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥等疾病。上述各類藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的其他保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥物聯(lián)合使用，得到抗老年性癡呆藥物組合物。同樣，本發(fā)明所涉及的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療痛風(fēng)病藥物如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇等聯(lián)合使用，制備得到具有治療痛風(fēng)病的藥物組合物，用于痛風(fēng)病的臨床治療。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中的式(I)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有保護(hù)肝細(xì)胞急慢性損傷活性從而可以用于防治肝臟疾病的藥物或藥物組合物。上述各類藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的肝臟保護(hù)及肝病治療藥物藥物如聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、水飛薊賓葡甲胺、齊墩果酸、二氯乙酸二異丙胺、原卩卜啉鈉(protoporphyrindisodium)、馬洛替酯(malotilate)、熊去氧膽酸等聯(lián)合使用，制備得到具有保護(hù)肝臟活性的藥物組合物，可用于治療或輔助治療急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝及中毒性肝損傷等疾病。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中所述劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑和外用搽劑，以及各種緩釋、控釋劑型或納米制劑都可以根據(jù)現(xiàn)己公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)經(jīng)由常規(guī)制備而得，在這些公知知識(shí)和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物或其可藥用鹽的藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實(shí)施例的形式列舉本發(fā)明涉及的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)、體外清除超氧化自由基的活性試驗(yàn)、對(duì)過(guò)氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細(xì)胞損傷體外模型的肝細(xì)胞損傷保護(hù)活性試驗(yàn)、以及對(duì)雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)之結(jié)果，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制備防治相關(guān)疾病藥物的依據(jù)。藥理相關(guān)實(shí)施例給出了本發(fā)明制備出之化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說(shuō)明，本發(fā)明列舉的這些實(shí)施例均是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例5.化合物I-d對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)5.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品5丄1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得。合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。5丄2實(shí)驗(yàn)試劑5.1.2.1吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate,PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、黃嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；5.1.2.2TritonX-100購(gòu)自Gibco公司；5丄2.3陽(yáng)性對(duì)照藥物別嘌醇，泰州美通藥業(yè)有限公司；5丄2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東試劑公司)。5丄3儀器5.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；5丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；5.1.3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；5丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS小60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；5.1.3.5除菌過(guò)濾器Sterifil500型，Millipore公司；5丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；5丄3.7玻璃勻漿器國(guó)產(chǎn)。5.2實(shí)驗(yàn)方法5.2.1取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預(yù)冷的磷酸緩沖液(100mM，pH8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸緩沖液l:l(w/v)稀釋后在冰上直接勻漿，于-20"C保存，用前用磷酸緩沖液(1:7)稀釋，4t:條件下離心(8000rpm/10分鐘)，取上清液作為酶原。5.2.2化合物I-d對(duì)XO的抑制作用測(cè)定采用酶聯(lián)免疫ELISA法。樣品孔中加入底物黃嘌呤(0.1毫克/毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物I-d用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為40微克/毫升、20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基蘭四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入TritonX-100(0.4%，10微升)，在37°C中水浴保溫2小時(shí)，于550nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定?；衔颕"d對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。14黃嘌呤氧化酶抑制率(％)二[(OD織管一OD空白管)一(OD樣品管一OD樣品空白管)]/(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)乂100%。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物I~d在40微克/毫升時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率為62.68%，其半數(shù)抑制濃度IC5(T5.63xlO-SM(摩爾濃度，也即摩爾/升)；陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇40微克/毫升時(shí)抑制率為89.2%，半數(shù)抑制濃度IC5o=3.34xlO'5M。5.4結(jié)論化合物I-d對(duì)黃嘌呤氧化酶有強(qiáng)效的抑制活性，其抑制活性與陽(yáng)性藥物別嘌醇接近，二者之半數(shù)抑制濃度在同一數(shù)量級(jí)，說(shuō)明此類式(I)所示之B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物具有進(jìn)一步發(fā)展成為療效確切的黃嘌呤酶抑制劑的潛能。實(shí)施例6.化合物I~c對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)6.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品同實(shí)施例5。6.2實(shí)驗(yàn)方法6.2.1取SD大鼠，如實(shí)施例5方法制備酶原。6.2.2化合物I-c對(duì)XO的抑制作用測(cè)定采用酶聯(lián)免疫ELISA法。實(shí)際操作方法同實(shí)施例5?；衔飳?duì)黃嘌呤氧化酶抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。黃噪呤氧化酶抑制率(％)二[(OD標(biāo)準(zhǔn)管一OD空白管)一(OD樣品管一OD樣品空白管)]/(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)xlO(P/006.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表一。表一化合物I"C及陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用樣品抑制率(％)(40微克/毫升)半數(shù)抑制濃度IC5oI"C50.727.58xl(T5M別嘌醇89.23.34x10-5M6.4結(jié)論化合物I~c同樣表現(xiàn)出對(duì)黃嘌呤氧化酶有十分顯著的抑制活性，且其抑制活性呈量效關(guān)系。說(shuō)明此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物確實(shí)具有進(jìn)一步發(fā)展成為療效確切的黃嘌呤酶抑制劑的潛能。氧壓是由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生和清除自由基之間的失調(diào)所引起的，可誘發(fā)多種疾病。氧壓可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如中風(fēng)，帕金森氏病，阿爾茨海默病。另外它還跟其它疾病的病理途徑有關(guān)，如心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此尋找新的抗氧化劑成為治療由氧壓引起的各種疾病的有效途徑。本發(fā)明用體外清除陰離子超氧化自由基的活性試驗(yàn)、體外清除二苯基苦基苯肼自由基(U-diphenyl-2-piciylhydrazyl，DPPH)的活性試驗(yàn)、測(cè)定化合物對(duì)雙氧水H202所致PC12(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用等試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明涉及的化合物的抗氧化活性。下面分別用藥理實(shí)施例予以說(shuō)明。實(shí)施例7化合物I-a對(duì)雙氧水11202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用7.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品7丄1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。7丄2實(shí)驗(yàn)試劑7.1.2.1雙氧水(hydrogenperoxide,H202)、石肖基四氮唑蘭(nitrobluetetmzolium,NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；7丄2.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。7.1.2.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；7.1.2.43國(guó)(4，5-dimethylthiazol-2誦yl)-2,5畫diphenyltetrazoliumbromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司；7丄2.5小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；7丄2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；7丄2.7其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。7丄3儀器7丄3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；7丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；7.1.3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；7丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS小60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；7丄3.5除菌過(guò)濾器Sterifil500型，Millipore公司；7丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；7丄3.7C02細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國(guó)公司；7丄3.8倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。7.2實(shí)驗(yàn)原理H202是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來(lái)作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型。本實(shí)驗(yàn)用MTT法測(cè)細(xì)胞的存活率，如果待測(cè)化合物有清除由H202引起的自由基、保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的作用，則其OD值數(shù)據(jù)高，也即細(xì)胞存活率高，反之說(shuō)明細(xì)胞存活率低。本發(fā)明采用了對(duì)唐希燦所報(bào)道的方法(XiaoqiuXiao等，A^wosc/丄欲e。1999,275:73-76.)加以改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定本發(fā)明所制備得到的化合物對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。7.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37。C、5%(:02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。7.4實(shí)驗(yàn)方法7.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定首先用改良的MTT法測(cè)定了待測(cè)化合物對(duì)PC12細(xì)胞增殖的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至8000個(gè)/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后，分別將新配的待測(cè)樣品的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中待測(cè)樣品的最終濃度分別為16、8和4微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理鹽水溶液，繼續(xù)在37。C，5%C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去原液，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD溶劑對(duì)照—OD樣品)/OD溶劑對(duì)照x100%。7.4.2化合物I-a對(duì)&02所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定17PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37。C，50%<302潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。用倒置顯微鏡觀觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，分別將新配的化合物I-a的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H202(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用水飛薊賓為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照藥物。7.4.3試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表二。表二化合物I-a及對(duì)照品對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用樣品測(cè)試濃度(微克/毫升)細(xì)胞存活率空白對(duì)照—16.32%(不加藥)一15.20%15.50%水飛薊賓3218.78%1616.22%815.96%化合物I-a3224.50%1622.42%818.32%槲皮素3252.82%1647.99%845.47%7.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，I-a具有確切的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有確切的抗氧化損傷保護(hù)作用。在同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素弱，但活性高于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品水飛薊素，說(shuō)明此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物對(duì)于腦神經(jīng)細(xì)胞具有優(yōu)于水飛薊賓的抗氧化損傷保護(hù)作用，屬于具有一定效果的保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。測(cè)定化合物對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理。故該化合物表現(xiàn)出對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物對(duì)老年性癡呆癥的治療有積極作用。實(shí)施例8化合物I~c對(duì)雙氧水&02所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用8.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品同實(shí)施例7。8.2實(shí)驗(yàn)原理同實(shí)施例7。8.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°(:、5%(:02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。8.4實(shí)驗(yàn)方法8.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定同實(shí)施例7。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD溶艦照—OD縣)/OD溶艦照xl00o/o。8.4.2化合物I~c對(duì)&02所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定測(cè)定方法同實(shí)施例7。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，分別將新配的化合物I"C的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H202(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照藥物。8.4.3試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表三。表三化合物I~c及對(duì)照品對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用樣品測(cè)試濃度(微克/毫升)細(xì)胞存活率空白對(duì)照—16.32%(不加藥)一15.20%15.50%水飛薊賓3218.78%1616.22%815.96%化合物I"C3224.50%191622.62%_§_21.77%槲皮素3252.82%845.47%8.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，I-c具有明確的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，其對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)能力同樣強(qiáng)于對(duì)照品水飛薊賓。但在同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素弱，說(shuō)明此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物屬于具有一定效果的保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。實(shí)施例9化合物I~d對(duì)雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn)9.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品同實(shí)施例7。9.2實(shí)驗(yàn)原理同實(shí)施例7。9.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37。C、5%(302細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。9.4實(shí)驗(yàn)方法9.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定同實(shí)施例7。9.4.2化合物I-d對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定測(cè)定方法同實(shí)施例7。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，分別將新配的化合物I"d的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H202(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照藥物。9.4.3試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表四。表四化合物I~d及對(duì)照品對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>水飛薊賓3218.78%1616,22%815.96%rum'izji"1624.82%822.72%槲皮素3252.82%1647,99%845.47%9.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，I"d具有較強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，但在同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力雖仍比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素弱，然而比對(duì)照品水飛薊賓強(qiáng)；且高濃度下其PC12細(xì)胞存活率與水飛薊賓相比高出96e/。。更充分地說(shuō)明此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物屬于具有確切強(qiáng)度的保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。實(shí)施例10化合物I-a體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗(yàn)10.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品10丄1實(shí)驗(yàn)試劑lO丄l.l吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate，PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；10丄1.2陽(yáng)性對(duì)照藥物Vc購(gòu)自杭州賽諾非民生藥業(yè)有限公司；10丄1.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。10丄1.4NADH(還原型輔酶I)和3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5國(guó)diphenyltetrazoliumbromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司；10丄1.5其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。10丄2儀器10.1.2.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；10丄2.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；10丄2.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；10丄2.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；10.1.2.5除菌過(guò)濾器Sterifil500型，Millipore公司；10丄2.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。10.2實(shí)驗(yàn)方法10.2.1化合物I-a清除超氧陰離子自由基能力的檢測(cè)乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(phenazinemethosulfate-NADH)系統(tǒng)，用四唑氮藍(lán)(nitrobluetetmzolium)還原方法檢定。10.2.2用3毫升含有78微摩爾/升的NADH、50微摩爾/升四唑氮藍(lán)和10微摩爾/升吩嗪-N甲硫酸鹽在pH值為8.0的16毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對(duì)不同濃度的I-a檢測(cè)其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍(lán)反應(yīng)生成物的顏色用分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)，采用水飛薊賓作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，維生素C即Vc被用作陽(yáng)性對(duì)照藥物。10.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表五。表五樣品測(cè)試濃度(微克/毫升)對(duì)超氧陰離子自由基清除率化合物I-a4066.80%水飛薊賓4038.29%Vc4053.24%10.4結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-a具有強(qiáng)效的超氧陰離子自由基清除作用。在同一濃度下，其清除能力遠(yuǎn)超出對(duì)照組水飛薊賓，并且其對(duì)超氧陰離子自由基的半數(shù)清除濃度IC5o值為25.3微克/毫升，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物Vc(Vc對(duì)超氧陰離子自由基的半數(shù)清除濃度IC5o值為45.0微克/毫升)。故而說(shuō)明化合物I-a屬于強(qiáng)效清除超氧陰離子自由基的抗氧化物質(zhì)，預(yù)示著其在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病藥物中的用途。實(shí)施例ll化合物I"d體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗(yàn)11.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品同實(shí)施例10。11.2實(shí)驗(yàn)方法11.2.1化合物14清除超氧陰離子自由基能力的檢測(cè)乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽22一NADH(phenazinemethosulfate-NADH)系統(tǒng)，用四唑氮藍(lán)(nitrobluetetrazolium)還原方法檢定。11.2.2用3毫升含有78微摩爾/升的NADH、50微摩爾/升四唑氮藍(lán)和10微摩爾/升吩嗪-N甲硫酸鹽在pH信為8.0的16毫摩爾/升Tris-HC1緩沖液中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對(duì)不同濃度的I-d檢測(cè)其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍(lán)反應(yīng)生成物的顏色用分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)，采用水飛薊賓作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，維生素C即Vc被用作陽(yáng)性對(duì)照藥物。11.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表六。表六<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>11.4結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-d同樣具有強(qiáng)效的超氧陰離子自由基清除作用。在同一濃度下，其清除能力仍強(qiáng)于水飛薊賓及陽(yáng)性對(duì)照藥物Vc。其對(duì)超氧陰離子自由基的半數(shù)清除濃度ICso值為21.3微克/毫升，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物Vc(Vc對(duì)超氧陰離子自由基的半數(shù)清除濃度ICso值為45.0微克/毫升)。故而說(shuō)明化合物I"d也屬于強(qiáng)效清除超氧陰離子自由基的抗氧化物質(zhì)，預(yù)示著其及此類二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物或其可藥用鹽在制備防治急慢性肝損傷類疾病藥物中的用途。實(shí)施例12化合物I-c體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗(yàn)12.1試驗(yàn)原理DPPH是一種在體外可以穩(wěn)定存在的芳基自由基，廣泛用于評(píng)估化合物的抗氧化活性，化合物清除DPPH自由基能力反映了該化合物對(duì)具有芳基、穩(wěn)定或非酶依賴性質(zhì)的自由基的清除能力。DPPH易溶于甲醇，溶液呈深紫色，在517nm處有最大吸收，若該自由基被待測(cè)化合物捕獲，則在517nm處的吸光度就會(huì)下降，吸光度降低越多，其清除DPPH自由基的能力也越強(qiáng)。12.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品12.2.1實(shí)驗(yàn)試劑12.2.1.1吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate,PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；12.2.1.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。12.2.1.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；12.2.1.4NADH(還原型輔酶I)和3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5畫diphenyltetrazoliumbromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司；12.2丄5其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。12.2.2儀器12.2.2.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；12.2.2.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；12.2.2.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；12.2.2.4超純水系統(tǒng)UPWS小60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；12.2.2.5除菌過(guò)濾器Sterifi1500型，Millipore公司；12.2.2.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。12.3實(shí)驗(yàn)方法12.3.1DPPH(1.0毫摩爾/升)試劑配制稱取DPPH4.0毫克溶于10毫升甲醇中，4。C儲(chǔ)存。12.3.2化合物清除DPPH自由基的檢測(cè)在250微升反應(yīng)體系中含有各種不同濃度的化合物I"C25微升，DPPH(0.4毫克/毫升)的甲醇溶液40微升及甲醇溶液185微升，37-C水浴反應(yīng)30分鐘后，在517nm處測(cè)定吸光度。水飛薊賓作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，DPPH的甲醇液和槲皮素分別作為陰性、陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表七。表七<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>12.4結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-c具有較為強(qiáng)效的DPPH自由基清除作用，然其對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除濃度TCse值為31.2微克/毫升，弱干陽(yáng)性對(duì)照藥物槲皮素(槲皮素對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除濃度ICso值為11.60微克/毫升)。然其在同一濃度下清除DPPH自由基的能力是水飛薊賓的5倍，故而說(shuō)明該類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物屬于強(qiáng)效清除DPPH自由基的抗氧化物質(zhì)。該結(jié)論也預(yù)示了此類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物在制備防治急慢性肝損傷類疾病藥物中的用途。實(shí)施例13化合物I-c對(duì)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞雙氧水損傷模型的保護(hù)作用試驗(yàn)13.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品13丄1SD大鼠新生乳鼠(5日齡內(nèi))試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得。合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。乳鼠(5日齡內(nèi))自育。13丄2實(shí)驗(yàn)試劑13.1.2,1雙氧水(hydrogenperoxide,H202)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium，NBT)、菲咯嗪(ferrozine)、胰島素購(gòu)自Sigma公司；13丄2.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);13.1.2.3Tris堿，RPMI1640培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；13.1.2.43-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)、胰酶(Trypsin1:250)購(gòu)自Amresco公司；13丄2.5小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；13丄2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；13丄2.7其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。13丄3儀器13.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；13丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠;13丄3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；13丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；2513.1.3.5除菌過(guò)濾器Sterifi1500型，Millipore公司；13.1.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；13.1.3.7C02細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國(guó)公司；13丄3.8倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。13.2實(shí)驗(yàn)方法13.2.1新生SD大鼠原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)無(wú)菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日齡內(nèi))肝臟，剪碎，用0.25%的胰蛋白酶消化，制成肝細(xì)胞懸液。將肝細(xì)胞懸液收集在錐形瓶中，用200目雙層尼龍過(guò)濾，再用清洗液清洗，離心3次，以培養(yǎng)液重懸，即可得到大部分為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的懸液。13.2.2樣品對(duì)SD大鼠原代肝細(xì)胞的毒性檢測(cè)(MTT法)用RPMI1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%小牛血清，105U/升青霉素，100U/升鏈霉素10毫克/升胰島素)稀釋純化的肝細(xì)胞懸液，每毫升含1.0x106個(gè)肝細(xì)胞。將上述肝細(xì)胞懸液加入96孔(每孔0.1毫升)培養(yǎng)板中，置5%(302培養(yǎng)箱中，在37'C下培養(yǎng)12小時(shí)后，吸棄上清，加入0.6微摩爾/升的H202。作用1小時(shí)后，分別加入高、中、低3種不同濃度的I-c樣品試驗(yàn)藥液，每一濃度至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)溶劑和陽(yáng)性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，吸棄上清，收集肝細(xì)胞樣品，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀計(jì)算保護(hù)率和增生指數(shù)。13.3試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表八。表八.SD新生大鼠原代肝細(xì)胞雙氧水損傷模型的保護(hù)作用樣品編號(hào)濃度(微克/毫升)保護(hù)率槲皮素10043.65026.5107.814.710023.55022.91012.418.813.4結(jié)論26試驗(yàn)結(jié)果表明化合物I-C具有較強(qiáng)的保護(hù)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞免受雙氧水損傷模型的能力，即對(duì)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。在中濃度(50微克/毫升)下，其對(duì)細(xì)胞抗氧化損傷能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素略低，然而在低濃度時(shí)，其對(duì)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞的抗氧化保護(hù)能力高于槲皮素。結(jié)論該類B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素類化合物屬于具有顯效保護(hù)細(xì)胞抗氧化功效之物質(zhì)。提示其具有保肝護(hù)肝以及預(yù)期用于制備防治急慢性肝損傷類疾病藥物中的作用。在上述說(shuō)明書闡述本發(fā)明時(shí)，同時(shí)提供了實(shí)施例和藥理相關(guān)實(shí)施例的目的是舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)際操作過(guò)程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。權(quán)利要求1.一類具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)二氧六環(huán)的二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物或其可藥用鹽式(I)其中，R1為氫原子或甲氧基；當(dāng)R1為氫時(shí)，R2是氫原子、甲氧基或芐氧基；當(dāng)R1為甲氧基時(shí)，R2是甲氧基。2.根據(jù)權(quán)利要求l的式(I)化合物，它們是化合物I-a:(±)_2-[2，3-二氫-2-(3-甲氧基~4~羥基苯基)~3~^甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4//-1-苯并吡喃~4-酮；化合物I-b:(±)_2-[2,3-二氫-2-(3-節(jié)氧基+羥基苯基)~3~|5甲基-1,4苯并二氧六環(huán)—5]—2，3-二氫—3，5,7—三羥基_4//-1—苯并吡喃_4~酮；化合物I"C:(±)_2-[2，3-二氫-2-(3,5-二甲氧基~4~|圣基苯基)~34圣甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3,5,7-三羥基4//-1-苯并吡喃+酮；化合物I-d:(±)_2-[2，3-二氫-2-(4~羥基苯基卜3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3,5，7-三羥基"4//-1-苯并吡喃4-酮。3.—種制備式(I)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)二氧六環(huán)型二氫黃酮醇木質(zhì)素化合物的方法，其特征是(±)"2-(2，3-二羥基苯基)2,3-二氫-3,5,7-三羥基4//-1-苯并吡喃+酮在銀鹽催化下，與取代的對(duì)羥基肉桂醇進(jìn)行偶合反應(yīng)而得；其中A和R2的定義與式(I)中的相同。4.式(I)化合物或其可藥用鹽在制備氧自由基清除劑藥物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物用途，其特征在于式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)型二氫黃酮醇木質(zhì)素或其可藥用鹽在制備防治由超氧陰離子自由基引發(fā)之炎癥、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化癥藥物中的應(yīng)用。6.式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)型二氫黃酮醇木質(zhì)素或其可藥用鹽在制備防治腦細(xì)胞組織氧化或腦神經(jīng)氧化所致疾病藥物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物用途，其特征在于式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)型二氫黃酮醇木質(zhì)素或其可藥用鹽在制備防治老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用。8.式(I)化合物或其可藥用鹽在制備防治療急慢性肝損傷的保肝護(hù)肝類藥物中的應(yīng)用。9.式(I)化合物或其可藥用鹽在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑藥物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物用途，其特征在于式(I)所示的B環(huán)二氧六環(huán)型二氫黃酮醇木質(zhì)素或其可藥用鹽在制備治療痛風(fēng)病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一類木質(zhì)素黃酮類化合物及其制備方法和藥物用途，具體而言，本發(fā)明涉及一類B環(huán)二氧六環(huán)的木質(zhì)素黃酮類化合物的制備方法及其用于制備抗氧化劑藥物的用途。該類化合物具有強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病的藥物。該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，可以預(yù)期發(fā)展成為防治老年性癡呆癥的藥物。本發(fā)明的化合物還具有體外抗自由基、保護(hù)肝細(xì)胞減輕雙氧水導(dǎo)致?lián)p傷的作用，因此可以預(yù)期成為治療由自由基引起的各種疾病之藥物尤其是防治肝臟損傷類藥物用途。文檔編號(hào)A61K31/357GK101508693SQ20091009581公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年2月2日優(yōu)先權(quán)日2009年2月2日發(fā)明者馮玉冰,巫秀美,蘇曾,李校堃,楊雷香,峰汪,王曉雨,佳瞿,昱趙,黃可新,龔景旭申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院;李校堃