專利名稱：HepG2.2.15細(xì)胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用的制作方法
HepG2. 2. 15細(xì)胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于乙肝疫苗研制技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及為H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎 Ofepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒 Ofepatitis B virus, HBV)引起、危及人類健康的傳染病。目前全球有超過3. 5億HBV感染的慢性乙肝患者或攜帶者，其中我國HBV病毒攜帶者約1.2億。相當(dāng)一部分會(huì)發(fā)展成為肝硬化、甚至肝癌。目前治療慢性乙型肝炎藥物主要有干擾素及核苷(酸)類似物。由于靶點(diǎn)的限制，藥物不能有效清除病毒cccDNA，停藥后存在HBV DNA和轉(zhuǎn)氨酶水平的反彈；長期用藥可致病毒變異，產(chǎn)生耐藥性。
鑒于目前抗病毒治療效果有限，旨在打破機(jī)體免疫耐受，有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，清除乙肝病毒的治療性疫苗的研發(fā)為乙型肝炎治療提供了新思路。目前國外治療性疫苗研究主要有蛋白疫苗、核酸疫苗、T細(xì)胞表位肽疫苗等，多停留在實(shí)驗(yàn)室研究或I、II期臨床試驗(yàn)研究階段。國內(nèi)主要包括蛋白疫苗和多肽T細(xì)胞疫苗等。其中復(fù)旦大學(xué)研發(fā)的治療乙肝慢性感染以鋁鹽為佐劑的免疫復(fù)合物疫苗，目前已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)研究階段；第三軍醫(yī)大學(xué)研發(fā)的多肽疫苗已完成II期臨床。雖然治療性疫苗能誘導(dǎo)針對(duì)HBV的免疫反應(yīng)，但對(duì) HBV病毒抑制和血清學(xué)改變等總體療效并不穩(wěn)定，至今尚無治療性疫苗批準(zhǔn)上市。因此，新型治療性乙肝疫苗的研制具有重要的意義。
由于缺乏HBV肝炎小鼠模型及有效的HBV抗原交叉提呈，治療HBV慢性感染，阻斷肝細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制和表達(dá)、誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答仍是目前難題之一。Chen等構(gòu)建的HBV DNA載體pAAV/HBVl. 2x,采用尾靜脈高壓注射法在正常C57BL/6小鼠體內(nèi)，成功建立了 HBV 肝炎小鼠模型，使得HBV復(fù)制及抗原表達(dá)長達(dá)一年，該新型小鼠模型為研究HBV慢性感染的病毒學(xué)和免疫學(xué)機(jī)制提供了首要條件。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體HBV-DRilAles在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用。
根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體按如下步驟制備得到
(1) H印G2. 2. 15肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)
復(fù)蘇凍存細(xì)胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% (v/v) CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0. 25% (g/mL)胰蛋白酶消化傳代；
(2)HepG2. 2. 15肝癌細(xì)胞的處理
待步驟(1)培養(yǎng)后的細(xì)胞貼壁良好，密度適中后(所述的密度適中是以細(xì)胞單層均勻鋪滿培養(yǎng)板底部約80-90%的面積確定)，加入雷帕霉素(Rapamycin)、萬珂(Velcade) 和氯化銨(NH4CL)，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為1 OOnmo 1 /L、200nmo 1 /L和 30mmol/L，干預(yù)H印G2. 2. 15細(xì)胞16小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體HBV-DRibbles ；
(3)提取 HBV-DRibbles
將步驟(2)誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)離心得到沉淀，即為自噬小體HBV-DRilAles。
步驟(3)中，提取HBV-DRilAles具體包含如下步驟
(3a)將細(xì)胞及培養(yǎng)液倒入普通50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；
(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；
(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細(xì)胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，IOminJf 低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；
(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；
(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體HBV-DRibbles,將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于-20°C，備用。
腫瘤細(xì)胞來源的自噬小體(DRitDbles)是交叉提呈腫瘤抗原的有效載體，能有效誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答。提取自藥物處理的H印G2. 2. 15細(xì)胞(轉(zhuǎn)HBV全序DNA的人肝癌細(xì)胞，不僅可以產(chǎn)生腫瘤抗原，也可以產(chǎn)生HBV抗原)的自噬小體，可募集更多的HBV 抗原成分，即HBV-DRitDbles ；以HBV-DRitDbles疫苗誘導(dǎo)DC細(xì)胞的交叉遞呈，以期更有效地激發(fā)針對(duì)HBV特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，清除HBV病毒感染的肝細(xì)胞。
有益效果本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)HBV-DRitDbles作為一種新型交叉提呈的抗原載體， 免疫小鼠能產(chǎn)生HBV特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒復(fù)制，有效清除HBV感染的肝細(xì)胞，效果優(yōu)于只有單純保護(hù)作用的重組HBsAg疫苗。本發(fā)明首次以 HBV-DRibbles疫苗誘導(dǎo)DC細(xì)胞的交叉遞呈，更有效地激發(fā)針對(duì)HBV特異性的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答，清除HBV病毒感染的肝細(xì)胞。為乙型肝炎的治療提供新的思路。


圖1為電鏡觀察DRibbles的形態(tài)X 10000。
圖 2 為 DRibble 中 LC3 含量的變化。其中，1. +DMEM ；2. +Velcade ；3. +Rapamycin, 4. +Ve1cade+Rapamycin 5. +Velcade+Rapamycin+NH4C1。
圖3為不同藥物單獨(dú)處理H印G2. 2. 15細(xì)胞對(duì)HBV-DRilAles中HBV抗原含量的影響。
圖4為萬珂、雷帕霉素和氯化銨聯(lián)合作用H印G2. 2. 15細(xì)胞對(duì)HBV-DRilAles中 HBsAg、HBeAg含量的影響。
圖5為HBV-HBV-DRilAles疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答。
圖6. HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
圖7. Q-PCR法檢測(cè)疫苗免疫HBV感染模型小鼠血清中HBV-DNA拷貝數(shù)。
圖8.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)疫苗免疫HBV感染模型小鼠的HBcAg陽性肝細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1 :H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體HBV-DRilAles的制備。
1. H印G2. 2. 15肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)
復(fù)蘇凍存細(xì)胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% (v/v) CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0. 25% 胰蛋白酶消化傳代。
2. H印G2. 2. 15肝癌細(xì)胞的處理
待細(xì)胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素lOOnmol/L、萬珂200nmol/L、氯化銨 30mmol/L組合，干預(yù)H印G2. 2. 15細(xì)胞16小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體HBV-DRibbles。
3.提取 HBV-DRibbles
藥物處理細(xì)胞16小時(shí)后，收獲細(xì)胞，經(jīng)離心提取上清中的DRibbles。具體步驟如下
1)將細(xì)胞及培養(yǎng)液倒入普通50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；
2)將步驟1)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；
3)將步驟1)離心后的沉淀的細(xì)胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；
4)將步驟2)和步驟3)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；
5)棄步驟4)得到的上清，沉淀主要成分即為自噬小體HBV-DRilAles。將沉淀用約ImlPBS重懸后分裝，凍存于-20°C，備用(避免反復(fù)凍融)。
實(shí)施例2 透射電子顯微鏡鑒定HBV-DRibbles的形態(tài)。
將提取好的HBV-DRitDbles高速離心使其壓縮緊密，棄上清，沉淀用2. 5% (ν/ν)戊二醛固定，送電鏡室進(jìn)行處理，上鏡觀察HBV-DRitDbles的形態(tài)。如圖1所示電鏡下可見含膜結(jié)構(gòu)的小體，平均直徑約為200-300nm(箭頭所指)，證實(shí)有效募集了肝癌細(xì)胞的自噬小體。
實(shí)施例3 =HBV-DRibbles總蛋白含量測(cè)定(Bradford法)。
1)完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取25 μ 1用PBS稀釋至100 μ 1 ；
2)將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μ 1分別加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足到 20μ 1 ；
3)提前將待測(cè)DRibbles反復(fù)凍融，離心取上清，加適量體積樣本到96孔板中，加 PBS補(bǔ)足到20 μ 1 ；
4)各孔加入200 μ 1 G250染色液，室溫放置3_5分鐘；
5)用酶標(biāo)儀測(cè)定595nm，或560_610匪之間其它波長的吸光度；
6)用軟件ElisaCalc繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。
每次提取蛋白濃度不完全相同，大約為1_3μ g/μ 1。
實(shí)施例4 =Western blot檢測(cè)HBV-DRibbles中自噬標(biāo)記蛋白一LC3的表達(dá)。
1)制備分離膠和濃縮膠
A分離膠(15%)制備:
ddH200.8 ml
30%Arc1.75 ml
1.5M Tris-Hcl (pH8.8)0.9ml
10%SDS35 ul
10%APS35 ul
TEMED1.5ul
總體積3.5ml。8濃縮膠(5%)的制備
ddH201.05ml
30%Arc0.25ml
1.0M Tris-Hcl(pH6.8)0.19ml
lO%SDS15 ul
lO%APS15 ul
TEMED1.5 ul
總體積1.5ml。2) SDS-PAGE 電泳
待濃縮膠凝固后，用去離子水沖洗梳孔。取反復(fù)凍融后離心所得的上清，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整上樣量，細(xì)胞裂解物每孔約12μ 1，加入5XSDS樣品加樣緩沖液3μ 1混勻， 100°C煮沸5min，12000rpm離心5分鐘后棄沉渣取上清準(zhǔn)備上樣。并加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)， 在上、下槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，開始電泳，恒壓80V，待樣本進(jìn)入分離膠后，加大電壓至120V，待溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠板底部時(shí)終止電泳。
3)轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜開始前約半小時(shí)，將轉(zhuǎn)移裝置浸泡于預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中，待電泳結(jié)束后，取下膠板，根據(jù)目的蛋白分子量切下相應(yīng)大小的膠，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，根據(jù)膠的大小剪出適當(dāng)大小的PVDF膜，浸泡于甲醇溶液中，待膜浸透后移至轉(zhuǎn)移緩沖液中繼續(xù)浸泡20分鐘， 制備“三明治”。恒流250mA電轉(zhuǎn)移60min。
4)封閉
用0. 05% TBST浸泡洗滌PVDF膜5min后，置于含3%牛血清白蛋白TBST中室溫慢搖封閉1小時(shí)
5) 一抗孵育
TBSTl 1000稀釋抗-HBsAg單克隆抗體，4°C過夜。次日TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動(dòng)幅度120轉(zhuǎn)/分鐘
6) 二抗孵育及顯影
TBST 1 5000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫，搖床孵育1小時(shí)；TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動(dòng)幅度120轉(zhuǎn)/分鐘；以ECL超敏發(fā)光底物曝光顯影。
如圖2所示5組HBV-DRitDbles中均檢測(cè)到自噬特征性標(biāo)記物L(fēng)C3-II的表達(dá)， 第5組的LC3 — II顯著高于其他4組。提示自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素雖促進(jìn)了自噬小體的生成，但由于自噬小體與溶酶體融合的降解途徑未被阻斷，自噬小體的降解未受抑制，因而 HBV-DRibbles中自噬小體的總量無明顯增加；而采用NH4Cl處理細(xì)胞抑制了溶酶體的酸化，阻止了溶酶體對(duì)自噬小體的降解，因而從NH4Cl處理組募集到的HBV-DRitDbles富含自噬小體。推測(cè)采用萬珂、雷帕霉素及NH4Cl處理H印G2. 2. 15細(xì)胞可以更有效地募集自噬小體。
實(shí)施例5 =HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg表達(dá)量的檢測(cè)(相對(duì)定量)。
按“乙型肝炎HBsAg、HBeAg診斷試劑盒”說明書操作。
1)提前將待測(cè)HBV-DRitDbles反復(fù)凍融，離心取上清；
2)酶標(biāo)條每孔加入待測(cè)標(biāo)本50 μ 1，設(shè)陰、陽性對(duì)照各2孔，每孔加入陰性對(duì)照 (或陽性對(duì)照)各50 μ 1，并設(shè)空白對(duì)照1孔；
3)每孔加入酶結(jié)合物50 μ 1 (空白對(duì)照孔除外)，充分混勻，封板，置37°C孵育30 分鐘；手工洗板棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干；
4)每孔加顯色劑A液、B液各50 μ 1，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘；每孔加入終止液50微升，混勻；
5)酶標(biāo)儀波長450nm(參考波長630nm)測(cè)定各孔OD值。
結(jié)果
A.圖3顯示不同藥物單獨(dú)處理H印G2. 2. 15細(xì)胞對(duì)HBV-DRilAles中HBV抗原含量的影響。
1)萬珂對(duì)HBV-DRibbles中HBV抗原含量的影響
對(duì)生長密度適中、貼壁良好的H印G2. 2. 15細(xì)胞加入萬珂(濃度分別為60、200、 600nM)處理M小時(shí)，提取培養(yǎng)上清中的HBV-DRilAles并采用ELISA法檢測(cè)其中HBsAg 和HBeAg含量。結(jié)果顯示200nM的萬珂能顯著提高HBV-DRibbles中的HBsAg含量(p = 0.0113)，同時(shí)顯著提高HBV-DRilAles中的HBeAg含量(p = 0.0082)。提示蛋白酶體抑制劑萬珂能提高HBV-DRitDbles中HBV抗原含量。
2)雷帕霉素對(duì)HBV-DRilAles中抗原含量的影響
對(duì)生長密度適中，貼壁良好的H印G2. 2. 15細(xì)胞加入濃度分別為30ηΜ、ΙΟΟηΜ、 300nM的雷帕霉素誘導(dǎo)M小時(shí)后，提取培養(yǎng)上清中的HBV-DRilAles，ELISA法檢測(cè)HBV-DRilAles中HBsAg和HBeAg含量。結(jié)果顯示IOOnM的雷帕霉素均明顯增加 HBV-DRibbles 中 HBsAg 含量和 HBeAg 含量(p = 0. 0452、ρ = 0. 0134)。提示自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠提高HBV-DRitDbles中HBV抗原的含量。
3)氯化銨對(duì)HBV-DRilAles中抗原含量的影響
對(duì)生長密度適中、貼壁良好的H印G2. 2. 15細(xì)胞加入濃度分別為3、10、30(mM)的氯化銨處理24小時(shí)后提取培養(yǎng)上清中的HBV-DRilAles，ELISA法檢測(cè)HBV-DRilAles中 HBsAg和HBeAg含量。結(jié)果顯示30mM的氯化銨對(duì)HBV-DRilAles中的HBsAg含量沒有明顯的影響，但增加了 HBV-DRitDbles中的HBeAg含量(p = 0. 0028)。提示氯化銨能夠提高 HBV-DRibbles 中 HBeAg 的含量。
B.圖4顯示三種藥物聯(lián)合作用H印G2. 2. 15細(xì)胞對(duì)HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg 含量的影響。
為進(jìn)一步觀察3種自噬相關(guān)藥物萬珂、雷帕霉素和氯化銨聯(lián)合處理H印G2. 2. 15 細(xì)胞對(duì)HBV-DRitDbles內(nèi)HBV抗原含量的影響，將3種藥物按上述最佳作用濃度聯(lián)合處理 HepG2. 2. 15細(xì)胞24小時(shí)，ELISA檢測(cè)HBV-DRibbles中的HBsAg和HBeAg。結(jié)果顯示與未處理的對(duì)照組相比，3種藥物聯(lián)合作用細(xì)胞可顯著提高HBV-DRitDbles中HBsAg和HBeAg 含量(p = 0. 0004、p = 0. 0007)。提示3種藥物聯(lián)合作用H印G2. 2. 15細(xì)胞，有效提高了 HBV-DRibbles 中 HBV 抗原含量。
實(shí)施例6 =HBV-DRibbles中HBsAg含量測(cè)定(絕對(duì)定量)。
步驟同實(shí)施例5。
不同之處在于
1)于加樣同時(shí)加倍比稀釋的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，50 μ 1/孔。
2)酶標(biāo)儀檢測(cè)后用軟件ElisaCalc繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 HBsAg濃度。
每次提取結(jié)果不完全相同，HBsAg含量約Ι-aiig/ μ 1。
實(shí)施例7 =HBV-DRibbles疫苗淋巴結(jié)免疫小鼠。
1)將小鼠置于小型動(dòng)物麻醉機(jī)中，異氟烷全身吸入式麻醉；
2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠剪開腹部皮膚勿傷及腹膜，暴露兩側(cè)腹股溝位置的皮下淋巴結(jié)；
3)然后每側(cè)分別注射40 μ g/20 μ 1 HBV-DRibbles ；對(duì)照組每側(cè)注射HBsiVg重組疫苗 40 μ g/20 μ 1 ；
4) 2周后分別皮下注射加強(qiáng)免疫HBsAg重組疫苗免疫000 μ g/200 μ 1/只)和 HBV-DRibbles免疫(400 μ g/200 μ 1/只)，2周后重復(fù)加強(qiáng)1次；
5)5周后小鼠眼眶采血300μ 1/只，室溫放置2小時(shí)后，4°C過夜，6000rpm離心10分鐘分離收獲血清。
實(shí)施例8 =ELISA檢測(cè)血清中HBs-IgG抗體的產(chǎn)生。
按“乙型肝炎表面抗體診斷試劑盒”說明書操作
1)提前將待測(cè)HBV-DRitDbles反復(fù)凍融，離心取上清；
2)酶標(biāo)條每孔加入待測(cè)標(biāo)本50 μ 1，設(shè)陰、陽性對(duì)照各2孔，每孔加入陰性對(duì)照 (或陽性對(duì)照)各50 μ 1，并設(shè)空白對(duì)照1孔；
3)每孔加入酶結(jié)合物50 μ 1 (空白對(duì)照孔除外)，充分混勻，封板，置37°C孵育30 分鐘；手工洗板棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干；
4)每孔加顯色劑A液、B液各50 μ 1，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘；每孔加入終止液50微升，混勻；
5)酶標(biāo)儀波長450nm(參考波長630nm)測(cè)定各孔OD值。8
圖5結(jié)果顯示HBV-DRilAles免疫組的小鼠抗HBs IgG的A450nm值大約在0. 42 左右，HBsAg重組疫苗免疫組小鼠抗HBs IgG的A450nm值大約為0. 18，HBV-DRibbles免疫誘導(dǎo)抗HBs IgG水平顯著高于HBsAg重組疫苗(p = 0. 03)。提示=HBV-DRilAles誘導(dǎo)的體液免疫效果優(yōu)于重組HBsAg組。
實(shí)施例9 =ELISA法檢測(cè)HBV抗原再刺激HBsAg特異性脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN- γ含量
按實(shí)施例7中DRibbles及HBsAg重組疫苗免疫小鼠，待小鼠血清中抗HBs抗體檢測(cè)陽性時(shí)，處死小鼠，取脾臟及淋巴結(jié)細(xì)胞。步驟如下
(1)每組處死3只小鼠，75%乙醇浸泡5min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌取脾及淋巴結(jié)， 放入冷Hanks液中漂洗2次；
(2)用無菌磨砂玻片將脾臟及淋巴結(jié)碾碎并濾過200目無菌不銹鋼網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，置50ml離心管中離心1500rpm，離心IOmin ；
(3)棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液溫和混勻，靜置5min，1500rpm，離心IOmin ；
(4)棄上清，再用Hanks液漂洗1次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含10%小牛血清的RPIM1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 106/ml ；
(5)設(shè) HBcAg、HBsAg 刺激組(其中 HBcAg 設(shè) 500ng/ml，50ng/ml，Ong/ml、HBsAg 設(shè) 100ng/ml,30ng/ml,0ng/ml三個(gè)濃度)，與淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)于M孔板中；
(6)收集72小時(shí)的培養(yǎng)上清，ELISA法檢測(cè)上清中IFN- γ含量。
結(jié)果見實(shí)施例10。
實(shí)施例10 培養(yǎng)上清中IFN- γ含量檢測(cè)。
按e-Bioscience ELISA試劑盒說明書操作。
1)包被捕獲抗體10Ρμ1，4度過夜；
2)棄去孔中液體，洗滌5次；
3)每孔加入稀釋液20Ρμ1，封閉，室溫孵育1小時(shí)；
4)棄去孔中液體，洗滌5次；
5)每孔加入ΙΟΡμΙ倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本每孔加ΙΟΡμΙ，封板，室溫孵育2小時(shí)；
6)棄去孔中液體，洗滌5次；
7)每孔加入ΙΟΡμΙ檢測(cè)抗體，封板，室溫孵育1小時(shí)；
8)棄去孔中液體，洗滌5次；
9)每孔加入100)4 HRP標(biāo)記親和素，封板，室溫孵育半小時(shí)；
10)棄去孔中液體，洗滌7次；
11)每孔加入ΙΟΡμΙ顯色液，室溫孵育15分鐘；
12)每孔加入50 μ 1終止液；測(cè)定450nm波長處吸光數(shù)。
圖6結(jié)果顯示重組HBsiVg疫苗免疫小鼠可產(chǎn)生針對(duì)HBsiVg的細(xì)胞應(yīng)答，而與重組 HBsAg疫苗相比，HBV-DRitDbles免疫小鼠不僅產(chǎn)生了針對(duì)HBsAg的細(xì)胞與應(yīng)答，還產(chǎn)生了高水平的針對(duì)HBdg抗原的細(xì)胞應(yīng)答，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ < 0. 001)。提示富含抗原的HBV-DRitDbles比重組HBsAg疫苗更能有效刺激效應(yīng)T細(xì)胞、干擾素的分泌，誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實(shí)施例11 乙型肝炎小鼠模型的建立。
采用尾靜脈高壓注射法注射C57BL/6小鼠，IOyg pAAV/HBVl. 2質(zhì)粒，于5_8s注射完成，注射劑量為小鼠體重8%。
實(shí)施例12 =HBV-DRibbles疫苗治療HBV感染小鼠模型。
HBV-DRibbles和重組HBsAg疫苗免疫C57BL/6小鼠(同步驟7)，待血清HBs-IgG 抗體檢測(cè)陽性后，尾靜脈高壓注射法注射IOyg pAAV/HBVl. 2質(zhì)粒，于質(zhì)粒注射后第1、2、 4、6周，定期眼眶靜脈采血，收集血清樣本。同時(shí)設(shè)立重組HBsAg免疫小鼠對(duì)照組。ELISA 法檢測(cè)HBV抗原、熒光定量PCR法檢測(cè)HBV-DNA拷貝數(shù)、末次采血時(shí)處死小鼠，取肝臟， 4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)HBcAg陽性肝細(xì)胞數(shù)。以探討 HBV-DRibbles疫苗對(duì)HBV感染的小鼠模型的治療作用，并與重組HBsAg比較。
實(shí)施例13 Q-PCR檢測(cè)小鼠血清中的HBV-DNA拷貝數(shù)。
按乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒說明書操作。核酸提取
1)吸取100 μ 1樣品處理液A于0. 5ml離心管中。
2)加入100 μ 1被測(cè)樣本
3)蓋上管蓋，震蕩混勻，13000rpm離心10分鐘
4)吸棄上清
5)再加入25 μ 1樣品處理液B
權(quán)利要求
1.H印G2. 2. 15細(xì)胞自噬小體HBV-DRilDbles在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的IfepG2.2. 15細(xì)胞自噬小體按如下步驟制備得到(1)H印G2.2. 15肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)復(fù)蘇凍存細(xì)胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在37°C、5% (v/v)CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0. 25%胰蛋白酶消化傳代；(2)HepG2.2. 15肝癌細(xì)胞的處理待步驟(1)培養(yǎng)后的細(xì)胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干預(yù)H印G2. 2. 15 細(xì)胞16小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體HBV-DRibbles ；(3)提取HBV-DRibbles 將步驟⑵誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)離心得到沉淀，即為自噬小體HBV-DRilAles。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中，提取HBV-DRitDbles具體包含如下步驟(3a)將細(xì)胞及培養(yǎng)液倒入50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細(xì)胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm高速離心 30min，4°C ；(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體HBV-DRilAles，將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于_20°C，備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了HepG2.2.15細(xì)胞自噬小體HBV-DRibbles在制備HBV治療性疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)HBV-DRibbles作為一種新型交叉提呈的抗原載體，免疫小鼠能產(chǎn)生HBV特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒復(fù)制，有效清除HBV感染的肝細(xì)胞，效果優(yōu)于只有單純保護(hù)作用的重組HBsAg疫苗。本發(fā)明首次以HBV-DRibbles疫苗誘導(dǎo)DC細(xì)胞的交叉遞呈，更有效地激發(fā)針對(duì)HBV特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，清除HBV病毒感染的肝細(xì)胞。為乙型肝炎的治療提供新的思路。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102499983SQ20111043777
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者曹萌, 王立新, 薛萌 申請(qǐng)人:東南大學(xué)