專利名稱：醌類化合物及其制備方法與抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化合物領(lǐng)域，具體涉及一類源于真菌的具有抗腫瘤活性的醌類化合物及其制備方法，以及它們?cè)谥苽淇鼓[瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1929年從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來源，絕大多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來源于真菌和細(xì)菌，真菌的代謝產(chǎn)物還有其他的藥用價(jià)值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑等。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋微生物種類繁多，來源廣泛，篩選獲得率高，根據(jù)John教授在2005年《Natural Product Reports》的報(bào)道，2003年發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物新化合物中，海洋微生物是主要來源之一(另外包括海綿和腔腸動(dòng)物)。海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產(chǎn)物。
植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的組織中，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，在進(jìn)化過程中與宿主建立了和諧的共生關(guān)系，據(jù)保守的估計(jì)內(nèi)生真菌的種類繁多，大約有1.5×106種，由于數(shù)量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態(tài)關(guān)系，使這類真菌成為潛在的具有產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物的來源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的醌類化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述醌類化合物的制備方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述醌類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下簡(jiǎn)稱真菌1403)的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離得到三種結(jié)構(gòu)相似的化合物，該三種化合物的結(jié)構(gòu)分別如下列式E、式F、式G和所示(以下分別簡(jiǎn)稱為化合物E、F和G)
本發(fā)明所用的真菌1403已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCC NOM201018，保藏日為2001年4月23日。
本發(fā)明化合物E、F和G可從真菌1403的發(fā)酵培養(yǎng)液中提取分離得到，制備方法的具體步驟如下a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5-15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；
c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.真菌#1403培養(yǎng)液過濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；e.培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到F。收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，不斷重結(jié)晶得到化合物G。
本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明，化合物E、F和G均能有效抑制腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)，可用于制備抗腫瘤藥物，可以是藥物上可接受的任意一種劑型。
與現(xiàn)有抗腫瘤藥物相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的醌類化合物來源于海洋真菌，海洋真菌種類繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡(jiǎn)單，使得醌類化合物來源豐富、成本低廉；醌類化合物抗腫瘤活性高，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 化合物E、F與G的分離制備方法a.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.真菌#1403培養(yǎng)液過濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫。
e.培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到E、F與G。浸泡的菌體得到的浸膏經(jīng)過柱層析；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，不斷重結(jié)晶得到化合物H。
化合物E的試驗(yàn)數(shù)據(jù)紅色粒狀晶體，mp 222-225℃。FABMS m/z 321[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.20(1H，s)，12.67(1H，s)，6.43(1H，s)，4.71(1H，dd，2.5，5.0)，4.38(1H，d，2.5)，3.92(3H，s)，3.62(1H，m)，1.19(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc 184.3(C)，183.0(C)，175.9(C)，161.7(C)，160.3(C)，138.8(C)，136.4(C)，109.4(CH)，109.0(C)，106.8(C)，70.1(CH)，68.8(C)，56.8(CH3)，35.5(CH2)，29.9(CH2)，25.2(CH3)。
化合物F的試驗(yàn)數(shù)據(jù)橙紅色固體，mp 249-253℃，F(xiàn)ABMS m/z 301[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.39(1H，s)，13.37(1H，s)，11.01(1H，s)，7.87(1H，s)，7.48(1H，s)，6.76(1H，s)，3.92(3H，s)，2.20(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc185.8(C)，184.0(C)，162.0(C)，159.9(C)，157.5(C)，149.2(C)，133.6(C)，131.8(C)，129.5(CH)，124.4(C)，111.6(C)，110.9(CH)，106.4(CH)，105.5(C)，56.1(CH3)，16.1(CH3)。
化合物G的試驗(yàn)數(shù)據(jù)灰色粉末.mp235-237℃.1H NMR(DMSO，300MHz)dH12.351(s，1H，5-OH)，8.448(S，1H，8-OH)，6.486，(S，1H，6-CH)，5.000(d，1H，J＝5.7Hz，9-OH)，4.73(brd，1H，J＝5.7，12.0Hz，9-CH)，4.002(s，1H，2-OH)，3.87(s，3H，15-CH3)，3.82(Brd，j＝2.1，8.4，10Hz，4-CH)，3.0(dd，1H，J＝8.4，5.7Hz，3-CH)，2.74(1H，dd，J＝12，10Hz，14-CH)，2.11，(brd，J＝12，12Hz，13-CH)，1.70(1H，t，J＝13.0Hz，1-CHa)，1.53(1H，dd，J＝13.0，3.6Hz，1-CHb)，1.17(S，3H，16-CH3)；13C NMR(DMSO，300MHz)dc205.80(C-10)，157.85(C-5)，155.85(C-12)，135.69(C-7)，129.29(C-12)，107.40C-11)，98.86(C-6)，78.10(C-3)，70.57(C-4)，70.39(C-2)，61.77(C-9)，55.98(C-15)，47.13(C-14)，37.05(C-1)，27.100(C-16)。
化合物E的試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例2 MTT還原法檢測(cè)化合物E、F和G抗腫瘤活性試驗(yàn)1.材料1.1四脞鹽(MTT)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)終濃度5mg/mL，過濾除菌，分裝后4℃避光保存。
1.2靶細(xì)胞的制備HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)a.從液氮罐中取出人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的凍存管，迅速置入37℃水浴中，不停搖動(dòng)使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；b.加全培養(yǎng)液至10mL，1000rmp離心5s，棄上清；c.重復(fù)以上操作一次；d.以全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃培養(yǎng)；e.觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，分瓶。
1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)a.選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，全培養(yǎng)終止，移入離心管中，加全培至10mL；b.取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計(jì)數(shù)四大格的細(xì)胞總數(shù)、除以4，乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細(xì)胞數(shù)；c.調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/mL；1.4化合物E、F和G的配制分別取一定量的化合物E、F和G加入到全培中，調(diào)整濃度為500μg/mL，超聲乳化，過濾除菌，4℃保存。
2.試驗(yàn)方法a.96孔板各孔加入HepG2細(xì)胞100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培養(yǎng)4hr。
b.加入不同濃度受試對(duì)象100μL，對(duì)照加全培100μL，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。
c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4hr。
d.去除培養(yǎng)液。每孔加入DMSO100μL，輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解。
e.酶聯(lián)免疫儀570nm下測(cè)定每孔OD值。
f.計(jì)算抑制率腫瘤細(xì)胞殺傷率％＝[(對(duì)照組測(cè)定的平均OD值-加藥組測(cè)定的平均OD值)/對(duì)照組測(cè)定的平均OD值]×100％g.以抑制率對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，求得IC50值以lgc為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得IC50值3.試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果顯示化合物E、F和G均能有效抑制HepG2細(xì)胞株生長(zhǎng)。其中，E和F的IC50值分別為10.5μg/ml和3.5μg/ml。
權(quán)利要求
1.下述結(jié)構(gòu)式E、F和G的醌類化合物
2.權(quán)利要求1所述醌類化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；(3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；(4)真菌#1403培養(yǎng)液過濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；(5)培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到F；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，多次重結(jié)晶得到化合物G。
3.權(quán)利要求1所述醌類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了醌類化合物及其制備方法與抗腫瘤應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的醌類化合物。海洋真菌種類繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡(jiǎn)單，使得醌類化合物來源豐富、成本低廉；醌類化合物抗腫瘤活性高，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1762961SQ200510037139
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者佘志剛, 林永成, 黃華容, 夏雪奎, 蔡小玲, 周世寧, 關(guān)利平 申請(qǐng)人:中山大學(xué)