專利名稱：：用于治療骨疾病的gdf-9/bmp-15調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及GDF-9和BMP-15調(diào)節(jié)劑在骨疾病治療中的應用，例如骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、骨軟化、骨營養(yǎng)不良和骨折。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-P)超家族的成員具有生理重要的生長調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生特性(Kingsley等人，GenesDev.8:133-146(1994);Hoodless等人，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.228:235-272(1998))。近年，大量的注意力集中在兩個TGF-P超家族成員在卵巢功能和生育力中的作用生長和分化因子-9(GDF-9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(BMP-15,也被稱為GDF-9b;McNatty等人，Reprod.128:379-386(2004);Juengel等人，HumReprod.Upd.11:144-161(2005))。GDF-9在1993年首次被描述為在卵巢中特異性表達的TGF-P超家族成員(McPherron等人,J.Biol.Chem.268:3444-3449(1993))。和TGF-P家族的其他成員類似，GDF-9編碼為由信號肽、原區(qū)域(proregion)和C-端成熟區(qū)域組成的前肽原，所述C-端成熟區(qū)域通過屬于弗林樣(furin-like)蛋白酶組中的一種胞內(nèi)蛋白酶從前體肽切割而來。GDF-9mRNA存在于卵泡發(fā)育的所有階段的卵母細胞中，并且從初級卵泡階段到排卵后均表達(McPherron和Lee，J.Biol.Chem.268:3444-3449(1993);McGrath等人，Mol.Endocrinol.9:131-136(1995);Elvin等人，Mol.Endocrinol.13:1035-1048(1999))。缺乏GDF-9的雌性小鼠由于發(fā)育的卵母細胞停滯在初級卵泡階段而不育(Dong等人，Nature383:531-535(1996);Carabatsosetal.，Dev.Biol.204:373-384(1998))。BMP-15,還稱為GDF-9b，已發(fā)現(xiàn)是編碼GDF-9同源物的X連鎖基因，并在成熟區(qū)域與GDF-9具有52。/。氨基酸同一性(Dube等人，Mol.Endocrinol.12:1809-1817(1998);Laitinen等人，Mech.Dev.78:135-140(1998))。雖然BMP-15的表達與GDF-9相同，但是，它卻不能補償在GDF-9敲除小鼠中的GDF-9缺失。缺乏BMP-15的雌性小鼠是低生育力的，表現(xiàn)為降低的每窩產(chǎn)仔數(shù)和每月窩數(shù)(Yan等人，Mol.Endocrinol.15:854-866(2001))。在綿羊中，GDF-9和BMP-15對生育力都是關(guān)鍵的(Juengel等人，Bio.Reprod.67:1777-1789(2002))。在綿羊中天然發(fā)生的BMP-15突變導致純合雌性的不育。BMP-15在女性人類生育力中也扮演著關(guān)鍵性的角色，因為BMP-15突變與婦女卵狄育不全相關(guān)(DiPasquale等人，Am.J.Hum.Genet.75:106-111(2004))。GDF-9和BMP-15在目前描述過的TGF-P家族成員中是獨特的，它們在成熟區(qū)域中缺乏七個特征性保守半胱氨酸殘基的第四個(Dube等人，Mol.Endocrinol.12:1809-1817(1998);Laitinen等人，Mech.Dev.78:135-140(1998))。第四個半胱氨酸是特別重要的，因為它負責大多數(shù)TGF-P家族成員成熟二聚體的亞基之間二硫鍵的形成。雖然GDF-9和BMP-15缺乏該半胱氨酸，并且不形成共價連接的二聚體，研究發(fā)現(xiàn)GDF-9和BMP-15均在體外可以形成同型二聚體和異型二聚體(Liao等人，J.Biol.Chem.278:3713-3719(2003);Liao等人，J.Biol.Chem.279:17391-17396(2004))。GDF-9和BMP-15的表達都主要局限在哺乳動物生長的卵泡的卵母細胞內(nèi)。與該表ii^莫式一致，在攜帶了這些基因突變的動物包括綿羊和小鼠中，以及在用GDF-9和BMP-15肽免疫的綿羊中，在卵巢以外沒有觀察到任何效果(Galloway等人，Nat.Genet.25:279-283(2000);Hanrahan等人，Biol.Reprod.121:843-852(2004);Dong等人，Nature383:531-535(1996);Yan等人，Mol.Endocrinal.15:854-866(2001);Juengel等人，Biol.Reprod.70:557-561(2004);和Elvin等人，Mol.Endocrinol.13:1018-1034(1999))。因此，這些因子被認為是具有低非卵巢副作用風險的控制生育力的吸引人的靶，包括用于開發(fā)雌性不育的新型臨床治療，用于開發(fā)女性的新型非類固醇避孕劑，和用于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中調(diào)節(jié)生育力(見例如，美國專利號6，030，617)。雖然主要分布在卵巢，在非卵巢組織中也觀察到了GDF-9和BMP-15的表達，包括垂體和睪丸(Fitzpatrick等人，Endocrinol.139:2571-2578(1998);Aalto細等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.84:2744-2750(1999);Eckery等人，Mol.Cell.Endocrinol.192:115-126(2002);Otsuka和Shimasaki，Endocrinol.143:4938-4941(2002))。然而，由于這些蛋白質(zhì)的表達主要局限于卵巢，GDF-9和BMP-15的非繁殖性功能和應用沒有得到太多關(guān)注。多種病癥與骨的缺失相關(guān)，特別是在老年人和/或閉經(jīng)后的婦女中。例如，骨質(zhì)疏松是以骨骼骨量和礦物質(zhì)密度降低，骨的結(jié)構(gòu)破壞，并且相應的骨易碎性和骨折傾向增加為特征的使人虛弱的疾病。臨床骨質(zhì)減少發(fā)生在人的骨質(zhì)疏松之前，是在美國約2500萬人口中出現(xiàn)的病癥。在整個成年生活中，通過骨形成和再吸收的成對過程，骨持續(xù)的經(jīng)歷著更新。骨的再吸收是由骨再吸收細胞，破骨細胞介導的，破骨細胞是由單核吞噬細胞形成的。取代失去的骨的新骨是由骨形成細胞，成骨細胞沉積的，成骨細胞是由間充質(zhì)基質(zhì)細胞形成的。參與改建過程的多種其他細胞類型被全身性因子(例如，激素、淋巴因子、生長因子和維生素)和局部因子(例如，細胞因子、黏附分子、淋巴因子和生長因子)嚴密的控制。骨改建過程的正確時空協(xié)調(diào)對于骨量和完整性的維持是關(guān)鍵的。多種骨退行性疾病與骨改建循環(huán)的失衡有關(guān)，導致骨量的異常缺失(骨質(zhì)減少)，包括代謝性骨疾病，例如骨質(zhì)疏松、骨增殖(骨軟化)、骨營養(yǎng)不良和佩吉特氏病(Paget，sdisease)。目前可用于骨質(zhì)疏^^治療的有兩種主要的藥物療法類型。第一種和最常用的方法是使用激素療法降低骨組織的再吸收。已知雌激素替代療法("ERT")預防進一步的惡化，從而降低骨折的可能性。然而，雌激素作為治療的使用是局限的，認為長期的雌激素療法與子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、頻繁陰道出血和血栓形成有關(guān)。由于這些嚴重的副作用，許多女性選擇避免該治療。此外，幾乎很少的男性同意使用該類療法。骨質(zhì)疏松的第二種主要的治療方法是使用二膦酸鹽，特別是阿倫膦酸鹽、利塞膦酸鹽和伊本膦酸鹽。雖然實驗顯示這些化合物持續(xù)的增加骨質(zhì)疏松患者的骨礦物質(zhì)密度，但是使用二膦酸鹽治療骨質(zhì)疏松仍然有嚴重的問題，包括對食管和上消化道的刺激(irritation)。因此，需要開發(fā)新的治療方法用于治療和預防骨疾病。發(fā)明概述GDF-9影響骨密度，包括骨皮質(zhì)和骨小梁的礦物質(zhì)密度。因此，發(fā)明提供了通過施用GDF-9的調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)GDF-9來治療或預防骨疾病的方法。發(fā)明還提供通過施用BMP-15的調(diào)節(jié)劑來治療或預防骨疾病的方法。發(fā)明還提供使用包含治療有效量的GDF-9或BMP-15調(diào)節(jié)劑的組合物來制備在哺乳動物中治療或預防骨疾病的藥物。在一個實施方案中，施用GDF-9的抑制劑治療或預防骨退^f亍性疾病。在另一實施方案中，施用BMP-15的抑制劑來治療或預防骨退行性疾病。在一些實施方案中，GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑^皮用于制備治療或預防骨退行性疾病的藥物。治療或預防的疾病包括，例如骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓癌(osteomydoma)、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障礙(aplasticbonedisorder)、骨髓癌高鉤血癥(humoralhypercalcemicmyeloma)、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。治療或預防的疾病還包括與高血鈣、慢性腎病(包括晚期腎病)、腎透析、原發(fā)性或繼發(fā)性曱狀旁腙^L能亢進、炎癥性腸病、克羅恩氏病(Crohn'sdisease)，和長期使用皮質(zhì)類固醇或GnRH激動劑或拮抗劑相關(guān)的骨退行性疾病。本發(fā)明的方法包括向哺乳動物施用有效量的GDF-9或BMP-15抑制劑，所述抑制劑的量可有效的(1)治療或預防骨退行性疾??；(2);咸'隻骨破壞(bonedeterioration);(3)重建缺失的骨；(4)刺激新骨形成；和/或(5)維持骨(骨量和/或骨質(zhì)量)。本發(fā)明還提供包含GDF-9或BMP-15抑制劑的組合物用于制備藥物的用途，其可有效的(1)治療或預防骨退行性疾??；(2)減慢骨破壞；(3)重建缺失的骨；(4)刺激新骨形成；和/或(5)維持骨(骨量和/或骨質(zhì)量)。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑是GDF-9或BMP-15的抑制劑，包括例如抗GDF-9抗體、抗BMP-15抗體、抗GDF-9受體的抗體、抗BMP-15受體的抗體、可溶性GDF-9受體、可溶性BMP-15受體、顯性失活的GDF-9肽或顯性失活的BMP-15肽。在一些實施方案中，包括例如siRNA的抑制劑降4氐GDF-9或BMP-15的表達。本發(fā)明還提供用于評估GDF-9或BMP-15抑制劑治療骨退行性疾病的功效的檢測。還提供本發(fā)明的方法中使用的給藥方法、組合物和裝置。本發(fā)明還提供通過施用GDF-9或BMP-15的激動劑來降低骨密度的方法，以及GDF-9或BMP-15的激動劑制備用于降低骨密度的藥物的用途。可以治療的疾病包括，例如硬化性骨發(fā)育不良、骨骼骨發(fā)育不良、例如骨硬化病(osteopetrosis,osteosclerosis)和骨內(nèi)膜肥厚；卡-恩二氏病(與增加的TGF-P信號發(fā)放相關(guān))；范布切姆氏病和硬化性骨化病(sclerosteosis，導致增加的BMP信號發(fā)放)；常染色體顯性遺傳骨硬化病、I型常染色體顯性遺傳骨硬化病和Worth病。因此，本發(fā)明的方法和用途包括向哺乳動物施用有效量的GDF-9或BMP-15激動劑，來治療或預防骨發(fā)育不良病。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢將在后續(xù)描述中部分陳述，并且一部分從描述中是顯而易見的，或可以通過實施本發(fā)明進行了解。本發(fā)明的目的和優(yōu)勢將通過后附權(quán)利要求書中特別指出的組成部分和組合而實現(xiàn)并達到。需要理解的是，如所要求的那樣，前面的概括描述和此后的詳細描述僅為示例性的和解釋性的且對于本發(fā)明不是限制性的。序列的簡要描述SEQIDNO:l是人GDF-9基因的核苷斷列(另見GeneBank登錄號匪—005260)。SEQIDNO:2是人GDF-9的氨基酸序列(另見GeneBank登錄號NP—005251.1)。SEQIDNO:3是人BMP-15基因的核苷餅列(另見GeneBank登錄號NM—005448)。SEQIDNO:4是人BMP-15的絲酸序列(另見GeneBank登錄號NP_005439)。SEQIDNO:5是GDF-9肽的^tj^酸序列詳細描述本發(fā)明提供了向哺乳動物施用GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑來治療或預防骨疾病的方法。本發(fā)明的方法可用于在任何需要此類治療的哺乳動物中治療或預防骨疾病，所述哺乳動物特別包括人、靈長類、猴子、嚙齒類、綿羊、大鼠、狗、荷蘭豬、馬、牛和貓。在一些實施方案中，施用GDF-9抑制劑或BMP-15抑制劑來治療或預防骨退4亍性疾病。通過施用GDF-9抑制劑或BMP-15抑制劑來治療或預防的骨退行性疾病包括，例如骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松(例如閉經(jīng)后的、類固醇誘導的、高齡或使用甲狀腺素誘導的)、骨髓癌、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨髓癌高鈣血癥、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。治療或預防的疾病還包括與高血鉤、慢性腎病、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進、炎癥性腸病、克羅恩氏病，和長期使用皮質(zhì)類固醇、GnRH激動劑或拮抗劑，以及營養(yǎng)缺陷相關(guān)的骨退行性疾病。在其他實施方案中，施用GDF-9激動劑或BMP-15激動劑來治療或預防骨疾病，包括例如以過度骨生長或骨骼過度生長為特征的疾病，例如硬化性骨發(fā)育不良。該病被命名為"硬化性骨化病，，是進行性疾病，其特征是普遍的骨骼過度生長、巨人癥、腦神經(jīng)受壓、由于顱骨的顱蓋拓寬導致的顱內(nèi)壓升高、以及增加的骨小梁和骨皮質(zhì)的厚度和密度。疾病以過度的骨生長或骨骼過度生長為特征，包括但不限于，硬化性骨營養(yǎng)不良、骨膝骨depplasias，例如骨硬化、骨硬化病、骨內(nèi)膜肥厚；卡-恩二氏病、范布切姆氏病和硬化性骨化病、常染色體顯性遺傳骨硬化病、I型常染色體顯性遺傳骨硬化病和Worth病。參見Wesenbeck等人，Am.J.HumanGenet.72:763-771(2003)，以其引用的文獻。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防閉經(jīng)后婦女中的骨退行性疾病的方法。本發(fā)明的一個實施方案提供了治療或預防具有類固醇-誘導的骨質(zhì)疏爭>的個體中的骨退行性疾病的方法。本發(fā)明還提供了治療或預防個體中的老年骨質(zhì)疏松的方法。本發(fā)明的另一個實施方案提供了在個體中治療或預防使用甲狀腺素或使用糖皮質(zhì)素誘導的骨質(zhì)疏松的方法。本發(fā)明提供了在哺乳動物中降低生育力同時減慢骨破壞、維持骨、重建缺失的骨、或刺激新骨形成的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在女性中降低生育力并同時治療或預防骨退行性疾病的方法。本方法還提供在男性中治療或預防骨退行性疾病的方法。z厶開的方法包括向哺乳動物施用GDF-9的抑制劑或BMP-15的抑制劑，所述抑制劑的量可有效的(1)治療或預防骨退行性疾病；(2)減慢骨破壞；(3)重建缺失的骨；(4)刺激新骨形成；和/或(5)維持骨(骨量和/或骨質(zhì)量)。本發(fā)明的方法可用于治療骨小梁和骨皮質(zhì)中的微J見缺陷。骨質(zhì)量可以通過，例如評估骨微J見結(jié)構(gòu)的完整性來確定。一般的，GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑可以在至少2、4、6、8、10、12、20或40周的時期內(nèi)，或者在至少l、1.5或2年的時期內(nèi)，或者在對象終生的時期內(nèi)重復的施用。在一些實施方案中，可以施用單次推注劑量，例如通過施用如下文詳細描述的可注射的或可移植的組合物。一般的，用于本發(fā)明方法中的GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑包括GDF-9的抑制劑或BMP-15的抑制劑，可以在10-8和l(T7、10-7和l(T6、10-6和l(T5、10-5和10-4g/kg間的劑量施用。使用本領(lǐng)域已知的換算因子，在一個動物模型中實現(xiàn)的治療上有效的劑量可以轉(zhuǎn)化到另一種動物中使用，包括人(見例如，F(xiàn)reireich等人，(1966)CancerChemother.Reports,50(4):219-244)。本發(fā)明的方法中使用的調(diào)節(jié)劑的準確劑量是基于希望獲得的效果憑經(jīng)驗確定的。示范性的效果包括(a)治療或預防骨退行性疾病；(b)減慢骨破壞；(c)重建缺失的骨；(d)形成新骨生長；和/或(e)維持骨量和/或骨質(zhì)量。例如，施用調(diào)節(jié)劑的量可以有效的減慢骨破壞(例如，骨量和/或骨礦物質(zhì)密度的減少)至少10、20、30、40、50、100、200、300、400或500%的量。在本發(fā)明的一個實施方案中，調(diào)節(jié)劑能夠在不穿越卵巢血卵泡屏障的條件下對骨密度實現(xiàn)希望獲得的治療效果，所述屏障既是電荷選擇性也是尺寸選擇性的(Hess等人，Biol.Reprod.58:705-711(1998))。調(diào)節(jié)劑的此類差分效應可以是它的尺寸、它的電荷和/或它在不同組織中的相對有效濃度的函數(shù)，例如在全身性給藥之后。涉及骨破壞的結(jié)果還可以通過GDF-9和BMP-15的調(diào)節(jié)劑對于骨小梁缺失(小梁板穿孔)；(干骺端的)骨皮質(zhì)缺失；骨柏vt缺失；骨礦物質(zhì)密度下降、降低的骨礦物質(zhì)質(zhì)量、降低的骨改建、升高的血清堿性磷酸酶和酸性礴酸酶的水平；骨易碎(骨折率增加)，降低的骨折愈合的特定效果來評估。評估骨量和骨質(zhì)量的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于X-射線衍射；DXA;DEQCT;pQCT、化學分析、密度分級分離法、組織光度測定法、組織形態(tài)測定術(shù)和組織化學分析，描述在例如Lane等人,J.BoneMin.Res.18:2105-2115(2003)中。確定骨皮質(zhì)密度的一種檢測是MicroCT檢測。在pQCT測量后，可以實施microCT評估，例如，對股骨使用ScancomCT40(ScancoMedicalAG)。本發(fā)明還提供通過釣熒光素標記測量骨形成的方法。例如，在收集組織9天和2天前用釣熒光素(例如，15mg/kg，O.lml/小鼠，皮下)注射小鼠?？梢詮墓晒呛兔劰?，以及脊推骨收集骨組織。測量鈣熒光素標記的礦物質(zhì)化骨層之間的距離，骨樣品的組織學特征^:用于評估骨形成。本發(fā)明的其他應用包括GDF-9和/或BMP-15調(diào)節(jié)劑在包被或整合到骨移植物、基質(zhì)和貯存系統(tǒng)中，從而促進骨整合的應用。此類移植物的實例包括牙移植和關(guān)節(jié)替代移植。本發(fā)明還包括評估GDF-9或BMP-15調(diào)節(jié)劑用于骨退行性疾病治療的功效的檢測。此類檢測包含(1)在至少2、4、6或8周的時間向哺乳動物(例如，OVX大鼠)重復的施用調(diào)節(jié)劑；和(2)確定調(diào)節(jié)劑對骨的效果，其中調(diào)節(jié)劑使骨破壞(例如，骨量和/或骨質(zhì)量)減慢提示調(diào)節(jié)劑對骨退行性疾病的治療是有效的；調(diào)節(jié)劑降低的骨密度提示調(diào)節(jié)劑對硬化性骨發(fā)育不良或不適當升高骨量的疾病治療是有效的。可以理解，可以在一個或多個骨疾病的動物模型和/或人類中評估GDF-9或BMP-15調(diào)節(jié)劑，所述骨疾病包括骨退行性疾病。例如不運動(immobilization),低鈣飲食、高碼飲食、長期使用皮質(zhì)類固醇或GnRH激動劑或拮抗劑、卵巢功能停止，或衰老都可以誘導骨質(zhì)減少。例如，卵巢切除術(shù)(OVX)-誘導的骨質(zhì)減少是成熟的人閉經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動物模型。另一個普遍驗證的模型涉及皮質(zhì)類固醇給藥。此類模型包括短尾猴、狗、小鼠、兔子、雪貂、荷蘭豬、迷你豬和綿羊。對于骨質(zhì)疏松的不同動物才莫型的綜述，參見例如，Turner,Eur.CellsandMaterials1:66-81(2001)。其他的體外測試包括在培養(yǎng)物中評估對成骨細胞的效果，例如對膠原和骨鈣蛋白合成的效果，或者對堿性磷酸酶和cAMP誘導的效果。適當?shù)捏w內(nèi)和體外測試描述在，例如，美國專利號6，333，312。GDF-9和BMP-15調(diào)節(jié)劑GDF-9是以約454個氨基酸(aa)(SEQIDNO:2)的前肽原合成的，包含27個氨基酸的信號序列和292個氨基酸的前肽。預測GDF-9的成熟C-端片段長度為135個氨基酸，通過核酸序列分析確定具有非糖基化分子量為約15.6kD。GDF-9信號發(fā)放是通過I型受體ALK5(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18:653-665(2004))和II型受體BMPRII(Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002))介導的。SEQIDNO:2(GeneBank登錄號NPJ305251.1)中包含了成熟的人GDF-9的氨基^f列。人GDF-9野生型基因的序列z^開在例如，GeneBank登錄號NMJ)05260、美國專利號5,821,056;6,191,261和6,365,402，以及美國專利公開號2002/0127612和2004/0152143中。小鼠GDF-9基因的核苷酸序列見于GeneBank登錄號NM—008110;核苦酸29-1354編碼小鼠GDF-9蛋白質(zhì)(GeneBank登錄號NP—032136.1)。大鼠GDF-9基因的核苷酸序列見于GeneBank登錄號NM—021672;核苷酸1-1323編碼大鼠GDF-9蛋白質(zhì)(GeneBank登錄號NP—067704.1)。BMP-15是以約392個氨基酸(SEQIDNO:4;GeneBank登錄號NP—005439.1)的前肽原合成的，包含18個氨基酸的信號序列和249個氨基酸的前肽；核苷酸1-1179編碼SEQIDNO:4。預測BMP-15的成熟C-端片段長度為125個氨基酸，由前肽原的第268-392位氨基酸殘基組成。BMP-15信號發(fā)放是通過I型受體ALK6和II型受體BMPRII(Moore等人，J.Biol.Chem.278:304-310(2003))介導的。SEQIDNO:4中包含了成熟的人BMP-15的^JJ^f列。人BMP-15(GDF-9b)野生型基因的序列公開在例如，GeneBank登錄號NM—005448、美國專利號5，728，679和5,635,372，以及美國專利公開號2004/0092007中。小鼠的BMP-15基因的核苷酸序列見于GeneBank登錄號NM—009757;核苷酸358-1536編碼小鼠BMP-15蛋白質(zhì)(GeneBank登錄號NP—033887)。大鼠BMP-15基因的核苷酸序列見于GeneBank登錄號NM—021670;核苷酸247-1422編碼大鼠BMP-15蛋白質(zhì)(GeneBank登錄號NP—067702.1)。本文中使用的術(shù)語"GDF-9"和"BMP-15"分別指GDF-9或BMP-15的任何一種或多種同種型。該術(shù)語指GDF-9或BMP-15的全長未加工的前體形式，以及由翻譯后切割獲得的成熟的和前肽形式。術(shù)語"前肽"指從GDF-9或BMP-15前體蛋白質(zhì)的氨基端結(jié)構(gòu)域切割而來的多肽。術(shù)語"成熟的蛋白質(zhì)"指從GDF-9或BMP-15前體蛋白質(zhì)的羧基端結(jié)構(gòu)域切割而來的蛋白質(zhì)。成熟的GDF-9可以作為單體、同型二聚體或異型二聚體出現(xiàn)，例如和BMP-15—起。成熟的BMP-15可以作為單體、同型二聚體或異型二聚體出現(xiàn)。根據(jù)條件，成熟的蛋白質(zhì)可以在任何或所有這些不同形式之間建立平衡。在其生物學活性形式中，成熟的GDF-9還指"活性GDF-9"，成熟的BMP-15還指"活性BMP-15"。該術(shù)語還指GDF-9或BMP-15的任何片段或變體，其可以維持至少一部分如本文中討論的、與成熟的GDF-9或BMP-15相關(guān)的生物學活性，該術(shù)語包括經(jīng)過^f務飾的序列。本發(fā)明可以^使用從所有脊推動物物種中獲得的GDF-9和BMP-15的調(diào)節(jié)劑，所述脊推動物包括但不限于人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、綿羊、火雞、狒狒和魚。術(shù)語"GDF-9受體"和"BMP-15受體"，除非另外提示，指分別與至少一種GDF-9或BMP-15同種型結(jié)合的任何受體。GDF-9和BMP-15，及其受體的結(jié)構(gòu)和功能方面，是本領(lǐng)域普遍已知的(見例如，Chang等人，EndocrineRev.23:787-823(2002);Moore等人，Molec.Cell.Endocrinol.234:67-73(2005);Juengel等人，Hum.Reprod.Update11:144-161(2004))。A.GDF-9和BMP-15抑制劑術(shù)語"GDF-9抑制劑"及其同源詞例如"拮抗劑"、"中和"和"減量調(diào)節(jié)"指作為GDF-9生物學活性抑制劑的化合物(或它的適當?shù)男再|(zhì))。GDF-9抑制劑可以，例如結(jié)合和中和GDF-9的活性；降低GDF-9的表達水平；影響穩(wěn)定性或前體分子向活化的、成熟形式的轉(zhuǎn)化；干擾GDF-9與一種或多種受體的結(jié)合；或者可以干擾GDF-9受體的胞內(nèi)信號。術(shù)語"直接的GDF-9抑制劑，，一般指任何直接減量調(diào)節(jié)GDF-9的生物學活性的化合物。如果分子通過與GDF-9基因、GDF-9轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、GDF-9配體或GDF-9受體相互作用來減量調(diào)節(jié)活性，則它"直接減量調(diào)節(jié)"GDF-9的生物學活性。術(shù)語"中和"、"中和的"、"抑制的，，及其同源詞指相對于沒有相同抑制劑條件下的GDF-9活性，GDF-9抑制劑對GDF-9活性的降4氐?；钚缘慕档蛢?yōu)選的是至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。鑒別改變GDF-9活性的物質(zhì)的方法描述在美國專利號6,680,174中，例如改變雌性的生育力?？梢宰钄郍DF-9活性的GDF-9抑制劑可用于本發(fā)明的方法中。此類抑制劑可以與GDF-9自身相互作用?？蛇x的，抑制劑可以與GDF-9受體(例如ALK5或BMPRII)或其他的結(jié)合配偶體相互作用，例如，抑制劑可以降低或阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合和/或結(jié)合GDF-9后的受體的活性。當然，抑制劑可以同時與GDF-9和第二個因子，例如其受體相互作用。在這一方面，GDF-9抑制劑包括抗體(抗GDF-9和/或GDF-9受體)、修飾的可溶性受體、其他蛋白質(zhì)(包括結(jié)合GDF-9和/或GDF-9受體的那些)、GDF-9的修飾的形式或其片段、前肽、肽，以及所有這些抑制劑的模擬物。非蛋白質(zhì)抑制劑包括，例如，小分子和核酸。術(shù)語"GDF-9活性"指與活化GDF-9蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種生理學上的生長調(diào)節(jié)或形態(tài)發(fā)生活性。在體內(nèi)和體外測量GDF-9活性的檢測是本領(lǐng)域已知的。一些更常用的生物檢測的實例包括下列(1)在卵泡細胞中孕酮、前列腺素E2的合成(美國專利號6,680,174;Elvin等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA97:10288-10293(2000));(2)GDF-9誘導的基因表達的誘導作用，包括乙酰透明質(zhì)酸合成酶、環(huán)加氧酶2(COX2)、類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、黃體生成素(LH)受體、激活蛋白/抑制素p、促濾泡素抑制素和gremlin(美國專利號6,680,174;EMn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10288-10293(2000));(3)大鼠卵巢卵泡細胞增殖的誘導(Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002);Liao等人，J.Biol.Chem.279:17391-17396(2004));(4)小鼠卵丘細胞的黏液化和增大(Buccione等人，Dev.Biol.138:16-25(19卯)；Salustri等人，Dev.Biol.138:26-32(19卯)；Elvin等人，Mol.Endocrinol.13:1035-1048(1999));(5)在P19癌細胞中融合至熒光素酶報道基因的CAGA啟動子的誘導(Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18:653-665(2004));(6)對間充質(zhì)干細胞向全能成骨細胞分化的影響(Jaiswal等人，J.Cell.Biochem.64:295-312(1997));(7)受體結(jié)合檢測(Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002));(8)Smads蛋白質(zhì)的磷酸化作用(Mazerbourg等人，Mol.EndocrinoU8:653曙665(2004));和(9)受體磷酸化作用(Boyle等人，MethodsEnzymol.201B:110-149(1991);Luo等人，MethodsEnzymol.201:149-152(1991);Wrana等人，Mol.Cell.Biol.14:944-950(1994);Weiser，等人，EMBOJ.14:2199-2208(1995))。術(shù)語"BMP-15抑制劑"及其同源詞例如"拮抗劑"、"中和"和"減量調(diào)節(jié)"指作為BMP-15生物學活性抑制劑的化合物(或它的適當?shù)男再|(zhì))。BMP-15抑制劑可以，例如結(jié)合和中和BMP-15的活性；降低BMP-15的表達水平；影響穩(wěn)定性或前體分子向活化的、成熟形式的轉(zhuǎn)化；干擾BMP-15與一種或多種受體的結(jié)合；或者可以干擾BMP-15受體的胞內(nèi)信號發(fā)放。術(shù)語"直接的BMP-15抑制劑"一般指任何直接減量調(diào)節(jié)BMP-15生物學活性的化合物。如果分子通過與BMP-15基因、BMP-15轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、BMP-15配體或BMP-15受體相互作用來減量調(diào)節(jié)活性，則它"直接減量調(diào)節(jié)"BMP-15的生物學活性。術(shù)語"中和"、"中和的"、"抑制的"及其同源詞指相對于沒有相同抑制劑條件下的BMP-15活性，BMP-15抑制劑對BMP-15活性的降^f氐?；钚缘慕礮f氐優(yōu)選的是至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高?？梢宰钄郆MP-15活性的BMP-15抑制劑可用于本發(fā)明的方法中。此類抑制劑可以與BMP-15自身相互作用。可選的，抑制劑可以與BMP-15受體(例如ALK6或BMPRI1)或其他的結(jié)合配偶體相互作用，例如，抑制劑可以降^(氐或阻斷BMP-15與其受體的結(jié)合和/或結(jié)合BMP-15后的受體的活性。當然，抑制劑可以同時與BMP-15和第二個因子，例如其受體相互作用。在這一方面，BMP-15抑制劑包括抗體(抗BMP-15和/或BMP-15受體)、修飾的可溶性受體、其他蛋白質(zhì)(包括結(jié)合BMP-15和/或BMP-15受體的那些)、BMP-15的修飾的形式或其片段、前肽、肽，以及所有這些抑制劑的模擬物。非蛋白質(zhì)抑制劑包括，例如，小分子和核酸。術(shù)語"BMP-15活性"指與活化BMP-15蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種生理學上的生長調(diào)節(jié)或形態(tài)發(fā)生活性。在體內(nèi)和體外測量BMP-15活性的檢測是本領(lǐng)域已知的。一些更常用的生物檢測的實例包括下列(1)大鼠卵巢卵泡細胞增殖的誘導(Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002);Liao等人，J.Biol.Chem.279:17391-17396(2004));(2)對卵泡細胞kit配體表達的豫導(Otsuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:8060-8065(2002));(3)抑制促卵泡激素(FSH)受體表達(Otsuka等人，J.Biol.Chem.276:11387-11392(2001));(4)抑制FSH-誘導的孕酮合成(Otsuka等人，J.Biol.Chem.275:39523-39528(2000));(5)抑制卵泡細胞中的FSH-誘導的類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、P450側(cè)鏈切割酶(P450sec)、3卩-羥類固醇脫氬酶(3卩-HSD)、LH受體的表達，以及抑制素/激活蛋白亞基(a、卩A和(5B)的表達(Moore等人，Mol.Cell.Endocrinol.234:67-73(2005));(6)對間充質(zhì)干細胞向全能成骨細胞分化的影響(Jaiswal等人，J.Cell.Biochem.64:295-312(1997));(7)受體結(jié)合檢測(Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002));(8)Smads蛋白質(zhì)的磷酸化作用(Mazerbourg等人，Mol.EndocrinoU8:653-665(2004));和(9)受體磷酸化作用(Boyle等人，MethodsEnzymol.201B:110-149(1991);Luo等人，MethodsEnzymol.201:149-152(1991);Wrana等人，Mol.Cell.Biol.14:944-950(1994);Weiser，等人，EMBOJ.14:2199-2208(1995))。GDF-9和BMP-15抑制劑任選是糖基化的、加入聚乙二醇的或連接另一個非蛋白質(zhì)多聚物?？梢孕揎桮DF-9或BMP-15的抑制劑使其具有改變的糖基化模式(即，與原始的或天然的糖基化模式不同)。如本文中使用的，"改變的"意指與原始的抑制劑相比，具有一種或多種碳水化合物部分被添加或刪除，和/或具有一種或多種糖基化位點#皮添加或刪除?？梢酝ㄟ^改變氨基酸序列來含有本領(lǐng)域普遍已知的糖基化位點共同序列，從而實現(xiàn)向抑制劑添加糖基化位點。另一種增加碳水化合物部分數(shù)目的方式是將糖基與抑制劑的氨基酸殘基化學連接或酶促連接。這些方法描述在WO87/05330，和Aplin等人"Crit.Rev.Biochem.22:259-306(1981)中。可以通過化學的或酶促的實現(xiàn)去除受體上出現(xiàn)的任何碳水化合物部分，如Sojar等人，Arch.Biochem.Biophys.259:52-57(1987);Edge等人，Anal.Biochem.118:131-137(1981);和Thotakura等人，Meth.Enzymol.138:350-359(1987)中描述的?；蚬δ苄缘臉撕灅擞?。可檢測的標簽包括放射性標簽例如125I、131I或"Tc,其可以使用本領(lǐng)域已知的常用化學方法連接至抑制劑上。標簽還包括酶標簽例如辣根過氧物酶或堿性磷酸酶。標簽還包括化學部分例如生物素，其可以通過結(jié)合特殊關(guān)聯(lián)的可檢測部分，例如標記的抗生物素蛋白，來檢測。1.抗體抑制GDF-9活性的抗體可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的方法還可使用抑制BMP-15活性的抗體。本文中使用的術(shù)語"抗體"意指免疫球蛋白或其部分，并且包括包含抗原結(jié)合位點的任意多肽，不論其來源、源頭物種、生產(chǎn)方法和特征。作為非限制性實例，術(shù)語"抗體"包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊和雞的抗體。該術(shù)語包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、人源化抗體、駱駝源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體，和CDR-移植的抗體。出于本發(fā)明的目的，除非另外陳述，它還包括抗體片段例如Fab、F(ab，)2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH(也被稱為納米體)，和其他保留抗原結(jié)合功能的抗體片段。例如，可以通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，Nature256:495-499(1975))、重組DNA方法(美國專利號4,816,567)或4吏用抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)(Clackson等人，Nature352;624-628(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.222;581-597(1991))來制備抗體。對于其他不同的抗體產(chǎn)生才支術(shù)，見Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow等人編著，ColdSpringHarborLaboratory,1988。術(shù)語"抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域"指抗體分子的部分，其包含與部分或全部抗原特異性結(jié)合或互補的區(qū)域。當抗原較大時，抗體可以只結(jié)合抗原的特定區(qū)域。"表位"或"抗原決定簇"是抗原分子的一部分，其負責與抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性相互作用?？梢酝ㄟ^一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域提供抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂的Fd抗體片段)?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(Vj和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。來自駱駝和美洲駝(Camelidae,camelids)的抗體包含獨特的抗體種類，只由重鏈形成，沒有輕鏈。此類抗體的抗原結(jié)合位點是一個單結(jié)構(gòu)域，被稱為V冊。其被命名為"駱駝源化抗體"或"納米體"。見例如美國專利號5,800,988、美國專利號6,005,079、國際申請?zhí)朩O94/04678，和國際申請?zhí)朩O94/25591，其引入本文作為參考。術(shù)語"抗體庫"指遺傳上不同的核苷酸集合，例如，來自編碼表達的免疫球蛋白序列的全部或部分的DNA序列。序列是通過例如H鏈的V、D和J區(qū)，以及例如L鏈的V和J區(qū)的體內(nèi)重排產(chǎn)生的?？蛇x的，序列可以通過體外刺激和對重排發(fā)生反應而從細胞系產(chǎn)生?？蛇x的，通過核苷酸合成、隨機突變和如美國專利號5,565,332中公開的其他方法，可以通過組合例如非重排的V區(qū)和D與J區(qū)來獲得部分或全部序列。術(shù)語"特異性相互作用"或"特異性結(jié)合"或諸如此類，意指兩個分子形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復合體。該術(shù)語還可用于例如特異性針對特定表位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所W位由多種抗原攜帶，在此情況下，攜帶抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體將能夠結(jié)合多種攜帶了該表位的抗原。因此，抗體可以特異性的結(jié)合例如GDF-9和BMP-15，只要它與兩種分子都攜帶的表位結(jié)合。特異性的結(jié)合是以高親和力以及低至中等的接受力(capcacity)為特征的。非特異性的結(jié)合通常具有低親和力以及中等至高的接受力。典型的，當親和力常數(shù)Ka大于106M"時，或優(yōu)選的大于108M"時，認為結(jié)合是特異的。如果必須，可以通過改變結(jié)合條件在基本不影響特異結(jié)合的條件下降低非特異性結(jié)合。此類條件是本領(lǐng)域已知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)可以選擇適當?shù)腗。通常用抗體的濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結(jié)合的時間、無關(guān)分子的濃度(例如，血清白蛋白、牛奶酪蛋白)等定義條件。短語"基本上如所示"意指相關(guān)的CDR、Vh或VL結(jié)構(gòu)域與本文中所示的序列的特定區(qū)域是相同或者高度相似的。例如，此類替代包括CDR序列(Hl、H2、H3、Ll、L2或L3)中任意5個氬基酸中的1個或2個。術(shù)語"分離的"指分子基本上游離于其天然環(huán)境。例如，分離的蛋白術(shù)語指制品，其中分離的蛋白質(zhì)是基本上純的、可以作為治療組合物施用，或者至少70%至80%(w/w)純，更優(yōu)選的，至少80%-卯％(w/w)純，甚至更優(yōu)選的，90%-95%純；和，最優(yōu)選的，至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)純。A)抗GDF-9或BMP-15的抗體才艮據(jù)上述方法，可以開發(fā)特異性的結(jié)合GDF-9蛋白質(zhì)自身的抗體。如果這些抗體抑制GDF-9的活性，例如如果它們阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，則它們在本發(fā)明的方法中是有效的。在本發(fā)明中最有效的抗體將具有與GDF-9/GDF-9受體復合體中的GDF-9特異性結(jié)合的性質(zhì)。此類抗體能夠以高親和力結(jié)合成熟的GDF-9，并且可以結(jié)合成熟蛋白質(zhì)的單體形式、同型二聚體形式，和/或異型二聚體形式，例如BMP-15的實例。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了抗GDF-9的抗體，并被認為可用于本發(fā)明，例如，美國專利號6,191，261中闡明的。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了用于GDF-9的中和化抗體，并且考慮將其用于本發(fā)明。mAb-GDF9-53是特異性的抗人GDF-9中和化單克隆抗體(Gilchrist等人，Biol.Reprod.71:732-739(2004))。該抗體的免疫的肽是合成的32個氨基酸的肽，對應于接近人GDF-9的C端的肽序列。表位定位揭示了mAb-GDF9-53識別短的4aa的肽序列，EPGD，其大致位于所免疫的肽的中段。比對來自一些脊推動物物種的C-端GDF-9和BMP-15氨基酸序列提示，EPDG序列在物種之間是高度保守的，但是與BMP-15的相應區(qū)域只有較低水平的相似性。mAb-GDF9-53對重組的小鼠GDF-9表現(xiàn)出強的免疫親和力，而對BMP-15則表現(xiàn)出極低的交叉反應性。Gilchrist等人描述的其他具有中和活性的抗人GDF-9抗體包括mAb-GDF9-22、mAb-GDF9-19、mAb-GDF9-37。根據(jù)上述方法，還可以開發(fā)特異性結(jié)合BMP-15自身的抗體。如果它們抑制BMP-15的活性，例如阻斷BMP-15與自身受體的結(jié)合，則這些抗體在本發(fā)明中將是有效的。本發(fā)明中最有效的抗體具有特異性結(jié)合BMP-15/BMP-15受體復合體中的BMP-15的性質(zhì)。此類抗體能夠高親和力的結(jié)合成熟BMP-15，并可以結(jié)合單體、同型二聚體，和/或異型二聚體(例如與GDF-9結(jié)合的)形式的成熟蛋白質(zhì)?？笲MP-15抗體是本領(lǐng)域中已經(jīng)描述的并可考慮在本發(fā)明中使用，例如，美國專利公開號2004/0267003和2004/0092007中闡明的。B)抗GDF-9受體或BMP-15受體的抗體根據(jù)上述方法，還可以開發(fā)結(jié)合GDF-9受體的抗體。如果它們阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，或者如果它們阻斷受體在結(jié)合GDF-9后的活性，則這些抗體在本發(fā)明中將是有效的?？梢蚤_發(fā)抗整個受體蛋白質(zhì)的抗體，或者僅僅抗胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。可以開發(fā)抗ALK5(GeneBank登錄號NP—004603)、ALK5變體、BMPRII(GeneBank登錄號NP一001195)、BMPRH變體，以及GDF-9的其他受體的抗體。例如，可以從R和DSystems(Minneapolis,MN)獲得小鼠ALK5的多克隆和單克隆(克隆141229)抗體，從R和DSystems獲得小鼠、人BMPRII的多克隆和單克隆(克隆73805)抗體。類似的，還可以開發(fā)結(jié)合BMP-15受體的抗體。如果它們阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，或者如果它們阻斷受體在結(jié)合BMP-15后的活性，則這些抗體在本發(fā)明中將是有效的?？梢蚤_發(fā)抗整個受體蛋白質(zhì)的抗體，或者僅僅抗胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。可以開發(fā)抗ALK6(GeneBank登錄號NP—001194)、ALK6變體、BMPRII(GeneBank登錄號:NP一001195)、BMPRII變體，以及BMP-15的其他受體的抗體。例如，可以從R和DSystems(Minneapolis,MN)獲得小鼠ALK6的多克隆抗體，以^A的重組ALK-6/Fc嵌合抗體和小鼠的重組ALK-6/Fc嵌合抗體(R和DSystems(Minneapolis,MN))，人/小鼠ALK-6單克隆抗體(clone88614;R和DSystems,Minneapolis,MN))。2.修飾的可溶性受體本發(fā)明可以使用GDF-9的修飾的可溶性受體。可溶性受體可以包含GDF-9受體胞外結(jié)構(gòu)域(還被稱為胞外結(jié)構(gòu)域)的全部或部分，所述GDF-9受體例如ALK5或BMPRI1。ALK5受體的#^酸序列，包括對胞外結(jié)構(gòu)域、受體的特定片段和變體的描述，其都在GeneBank登錄號NP—004603中闡明。在一個實施方案中，可溶性受體可以包含BMPRII的全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域，其既是GDF-9的受體，也是BMP-15的受體。BMPRII的氨基酸序列，包括胞外結(jié)構(gòu)域、受體的特定片段和變體的描述都在GeneBank登錄號NP—001195中闡明。抑制GDF-9的BMPRII胞外結(jié)構(gòu)域-Fc融合蛋白在Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002)中闡明。在另一實施方案中，本發(fā)明可以使用修飾的BMP-15可溶性受體?？扇苄允荏w可以包含BMP-15受體例如ALK6或BMPRII的全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域。ALK6受體的氨基酸序列，包括胞外結(jié)構(gòu)域、受體的特定片段和變體的描述都在例如GeneBank登錄號NP—001194中闡明。ALK6胞外結(jié)構(gòu)域-Fc融合蛋白在Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002)中胞外結(jié)構(gòu)域?？扇苄允荏w可以重組產(chǎn)生、或通過化學或酴&切割完整受體來產(chǎn)生。本發(fā)明的修飾的可溶性受體在血流中結(jié)合GDF-9和/或BMP-15,降低GDF-9和/或BMP-15結(jié)合其體內(nèi)天然受體的能力。在此方法中，這些修飾的可溶性受體抑制GDF-9和/或BMP-15的活性。A)受體融合溶性受體更穩(wěn)定。增加的穩(wěn)定性對治療是有利的，因為它們可以以更少的劑量或更低的頻率間隔進行給藥。與至少一部分免疫球蛋白融合，例如與抗體的恒定區(qū)融合，可選的免疫球蛋白的Fc片段融合，可以增加修飾的可溶性受體或本發(fā)明的其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(參見，例如Spiekermann等人，J.Exp.Med.196:303-310(2002))3.其他蛋白質(zhì)本發(fā)明的方法中還可以使用其他抑制GDF-9活性的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可以與GDF-9本身相互作用，抑制它的活性，或者與其受體結(jié)合?？蛇x的，抑制劑可以與GDF-9受體(例如ALK5或BMPIIR)相互作用，如果它們阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，或者如果它們在與GDF-9結(jié)合后阻斷受體的活性，則其在組合物或方法中是有效的。當然，抑制劑可以同時與GDF-9及其受體相互作用。本發(fā)明的方法還可以使用抑制BMP-15活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)通過與BMP-15自身和/或其受體相互作用來抑制BMP-15的活性。A)與GDF-9或BMP-15結(jié)合的蛋白質(zhì)本發(fā)明的方法中可以使用與GDF-9結(jié)合并抑制它的活性的蛋白質(zhì)，包括與其受體結(jié)合的蛋白質(zhì)。除了一些已知的蛋白質(zhì)，還可以使用上述篩選技術(shù)、ALK5或BMPIIR結(jié)合檢測，或者報道基因檢測來分離其他的蛋白質(zhì)?？梢院Y選蛋白質(zhì)的樣品，以及蛋白質(zhì)文庫。本發(fā)明的方法還可以使用結(jié)合BMP-15并抑制它的活性的蛋白質(zhì)。(1)GDF-9和BMP-15前肽GDF-9前肽可以作為GDF-9的抑制劑使用。為了增加天然存在的GDF-9前肽的體內(nèi)半衰期，本發(fā)明的前肽抑制劑可以經(jīng)過修飾和/或穩(wěn)定化，從而改善藥物動力學性質(zhì)，例如循環(huán)半衰期(Massague，J.，Ann.Rev.CellBiol"6:597-641(19卯)；Jiang,等人，BBRC315:525-531(2004);Gregory等人，J.Biol.Chem.280:27970-27980(2005))。在一個實施方案中，BMP-15前肽可以作為BMP-15的抑制劑4吏用。為了增加天然存在的BMP-15前肽的體內(nèi)半衰期，本發(fā)明的BMP-15前肽抑制劑可以經(jīng)過l奮飾和/或穩(wěn)定化，從而改善藥物動力學性質(zhì)，例如循環(huán)半衰期。此類經(jīng)修飾的前肽包括包含前肽和IgG分子的Fc區(qū)(作為穩(wěn)定化蛋白質(zhì))的融合蛋白。這些抑制劑可以包含GDF-9或BMP-15前肽，或所述前肽的片段或變體，所述片段或變體仍保留前肽的一種或多種生物學活性。本發(fā)明中使用的前肽可以是合成產(chǎn)生的、來自天然存在(天然的)的GDF-9或BMP-15前肽，或者使用遺傳工程領(lǐng)域普遍已知的各種任意的試劑、宿主細胞和方法重組產(chǎn)生。在一個實施方案中，^f務飾的前肽包含與IgG分子或其片段共價相連的人前肽。前肽可以與IgG分子的Fc區(qū)直接相連，或者通過接頭肽與IgG分子的Fc區(qū)相連(Jiang等人，BBRC315:525-531(2004);Gregory等人，J.Biol.Chem.280:27970-27980(2005))。在WO02/068650中描述了其他穩(wěn)定化的修飾策略，該申請完整引入本文作為參考。(2)顯性失活的GDF-9和BMP-15蛋白質(zhì)BMP-15變體蛋白質(zhì)可以在本發(fā)明的方法中作為抑制劑使用。天然存在的BMP-15變體，Y235C-BMP-15,在BMP-15的前(pro)區(qū)攜帶了非保守取代，并且在體內(nèi)和體外對野生型BMP-15的活性都具有顯性失活效應(DiPasquale等人，Am.J.Hum.Genet.75:106-111(2004))。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明還考慮GDF-9變體蛋白質(zhì)(包括顯性失活的蛋白質(zhì))的使用。(3)促濾泡素抑制素和含有促濾泡素抑制素-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)促濾泡素抑制素結(jié)合BMP-15,并且可用作BMP-15的抑制劑(Otsuka等人，Biochem.Bi叩hys.Res.Commun.289:961-966(2001))。因此，本發(fā)明提供了包含至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，以調(diào)節(jié)BMP-15活性的水平，并可以用于治療與BMP-15水平或活性的調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病。在本發(fā)明的組合物和方法中可以使用促濾泡素抑制素和含有促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(在美國專利公開號2003/0162714和2003/0180306中描述的)。含有至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合和抑制GDF-9。具有至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的實例包括但不限于促濾泡素抑制素、促濾泡素抑制素樣相關(guān)基因(FLRG)、FRP(flik、tsc36)、集聚蛋白、骨粘連蛋白(SPARC、BM40)、hevin(SC1、mast9、QR1)、IGFBP7(mac25)和U19878。GASP1和GASP2是含有至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的其他實例。酸結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)構(gòu)域，其特征是富含半胱氨酸的重復。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域一般包含65-90個氨基酸區(qū)域，含有10個保守的半胱氨酸殘基以及與Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域相似的區(qū)域。通常，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸殘基間的環(huán)區(qū)具有序列變異性，但是某些保守性也是明顯的。第4個和第5個半胱氨酸間的環(huán)通常小，僅含有1個或2個氨基酸。第7個和第8個半胱氨酸間的環(huán)通常最為高度保守，含有共有序列(G，A)-(S,N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)，后面是(T，S)-Y基序。第9個和第10個半V、I或L)的基序。含有促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)將包含至少(但可能超過)一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域。本術(shù)語還指此類蛋白質(zhì)的任意變體(包括片段；帶有取代、添加或缺失突變的蛋白質(zhì)；和融合蛋白)，包括已經(jīng)對M酸序列進行保守性或非保守性改變修飾序列，其中所示的變體保持了與天然蛋白質(zhì)相關(guān)的已知生物學活性，尤其是與BMP-15結(jié)合活性有關(guān)的那些生物學活性。這些蛋白質(zhì)可以自任意來源(天然來源或合成來源)衍生。蛋白質(zhì)可以是人蛋白質(zhì)或自動物來源，包括牛、雞、鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒和魚衍生的蛋白質(zhì)?？梢允褂枚喾N方法分離包含至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域、可以結(jié)合BMP-15的蛋白質(zhì)。例如，可以采用利用BMP-15的親和層析。此外，可以利用對cDNA文庫的低嚴格性篩選和使用針對促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的探針的簡并PCR技術(shù)。因為可獲得更多基因組數(shù)據(jù)，可以將使用眾多序列語和分析程序如MotifSearch(GeneticsComputerGroup,Madison,Wl)、ProfileSearch(GCG)和BLAST(NCBI)的相似性搜索用來發(fā)現(xiàn)與已知促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域具有顯著同源性的新蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，該蛋白質(zhì)包含與成熟的BMP-15或其片段特異性結(jié)合的至少一個促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域，不論所述蛋白質(zhì)是單體形式、活性二聚體形式，或作為BMP-15潛伏復合體的部分，所述結(jié)合具有0.001和100nM之間的親和力，或者0.01和10nM之間的親和力，或者O.l和1nM之間的親和力。B)結(jié)合GDF-9或BMP-15受體的蛋白質(zhì)結(jié)合GDF-9受體(例如ALK5或BMPIIR)并且抑制GDF-9與受體結(jié)合或受體本身活性的蛋白質(zhì)可在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用。相似的，結(jié)合BMP-15受體(例如ALK6或BMPIIR)并且抑制BMP-15與受體結(jié)合或受體本身活性的蛋白質(zhì)可在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用?？梢允褂蒙鲜龅暮Y選技術(shù)和檢測或者報道基因檢測來分離此類蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，受體結(jié)合蛋白是抗體?？梢院Y選蛋白質(zhì)的樣品，以及蛋白質(zhì)文庫。C)與任何結(jié)合蛋白融合可以通過與另一個蛋白質(zhì)或另一個蛋白質(zhì)的部分融合，使任何結(jié)合GDF-9、BMP-15、GDF-9受體或BMP-15受體的蛋白質(zhì)的融合蛋白更加穩(wěn)定。增加的穩(wěn)定性對治療是有利的，因為它們可以以更低劑量或更低頻率間隔給藥。與免疫球蛋白的至少一部分融合，例如恒定區(qū)，可選的免疫球蛋白的Fc片段，可以增加這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。此類融合蛋白的制備是本領(lǐng)域普遍已知的，并且可以方便的實施(見例如，Spiekermann等人,J.Exp.Med.，196:303-310(2002))。D)GDF-9和BMP-15免疫肽本文中使用的術(shù)語"疫苗"指誘導保護性免疫應答的組合物或化合物，所述保護性免疫應答包括抗體應答或者細胞應答。例如，GDF-9"疫苗"誘導拮抗GDF-9功能的免疫應答。在美國專利號6，030，617中描述了GDF-9疫苗。作為疫苗使用的GDF-9和BMP-15免疫原可以是同源的GDF-9或BMP-15蛋白質(zhì)，其通過引入一個或一些外源的、免疫顯性的和非種系選擇性T細胞表位來修飾，同時基本上保留了蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)；見例如，WO01/05820,其引入本文作為參考。GDF-9和BMP-15肽已經(jīng)在短期和長期免疫中向羊施用過(Juengel等人，Biol.Reprod.70:557-561(2003);Juengel等人，Biol.Reprod.67:1777-1789(2002);McNatty等人，Reprod.128:37卯386(2004))。4.GDF-9和BMP-15抑制劑的模擬物本發(fā)明的方法中可以使用GDF-9抑制劑的模擬物。這些GDF-9抑制劑的任何合成性才莫擬物，尤其是具有改善的體外特性如具有較長半衰期或更不易受消化系統(tǒng)降解的那些的模擬物是有用的?？笹DF-9抗體、抗GDF-9受體的抗體、修飾的可溶性受體和受體融合蛋白、以及結(jié)合GDF-9的其他蛋白質(zhì)例如GDF-9前肽、突變的GDF-9前肽、促濾泡素抑制素和含有促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，及其Fc融合蛋白的模擬物都可以在本發(fā)明中使用。如果這些;f莫擬物阻斷GDF-9的活性，即如果它們阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，則這些模擬物在本發(fā)明的方法中是有效的。在本發(fā)明中最有效的模擬物具有特異性結(jié)合GDF-9或GDF-9/GDF-9受體復合體的性質(zhì)。此類模擬物能夠以高親和性結(jié)合成熟GDF-9，并可以結(jié)合單體形式、活性二聚體形式或作為GDF-9潛伏復合體部分的成熟蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法中有效的模擬物可以抑制GDF-9的體外和體內(nèi)活性，例如，通過抑制ALK5或BMPIIR結(jié)合以及報道基因檢測來證明。此外，公開的模擬物可以抑制與骨骼肌量和骨密度的負調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-9活性。本發(fā)明的方法中還可以使用BMP-15的模擬物。這些BMP-15抑制劑的任何合成性模擬物，尤其是具有改善的體外特性如具有較長半衰期或更不易受消化系統(tǒng)降解的那些的模擬物是有用的?？笲MP-15抗體、抗BMP-15受體的抗體、修飾的可溶性受體和受體融合蛋白、以及結(jié)合BMP-15的其他蛋白質(zhì)例如BMP-15前肽、突變的BMP-15前肽、促濾泡素抑制素和含有促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，及其Fc融合蛋白的模擬物都可以在本發(fā)明中使用。如果這些模擬物阻斷BMP-15的活性，即如果它們阻斷BMP-15與其受體的結(jié)合，則這些模擬物在本發(fā)明的方法中是有效的。在本發(fā)明中最有效的模擬物具有特異性結(jié)合BMP-15或BMP-15/BMP-15受體復合體的性質(zhì)。此類模擬物能夠以高親和性結(jié)合成熟BMP-15，并且可以結(jié)合單體形式、活性二聚體形式或作為BMP-15潛伏復合體部分的成熟蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法中有效的才莫擬物可以抑制BMP-15的體外和體內(nèi)活性，例如，通過抑制ALK6或BMPIIR結(jié)合以及報道基因檢測來證明。此外，BMP-15公開的模擬物可以抑制與骨骼肌量和骨密度的負調(diào)節(jié)相關(guān)的BMP-15活性。5.非蛋白質(zhì)抑制劑在本發(fā)明的方法中還可以使用的非蛋白質(zhì)抑制劑包括，例如小分子和核酸。A)小分子在本發(fā)明的方法中可以使用的GDF-9和BMP-15抑制劑包括小分子。小分子包括合成的和純化的天然存在的GDF-9和BMP-15抑制劑。小分子可以是模擬物或促分泌素。鑒別特異性靶向目標蛋白質(zhì)例如GDF-9或BMP-15的小分子的方法是本領(lǐng)域普遍已知的?？梢允褂萌魏紊鲜龅腉DF-9功能檢測在小分子和/或肽文庫中篩選GDF-9的抑制作用，所述檢測包括但不限于CAGA-焚光素酶、MSXII-熒光素酶或BRE-焚光素酶在COS-7、CV-1、A204或卵泡細胞中的表達?？梢栽贕DF-9與其受體(包括例如可溶性受體)的竟爭性放射配體結(jié)合檢測中篩選小分子和/或肽文庫。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測的利用，例如放大發(fā)光最大同源性檢測(還已知為"AlphaScreen"，PerkinElmer，Boston,MA)也被用于鑒別合適的小分子抑制劑。在該實施方案中，GDF-9肽或BMP-15肽與第一"供體，，微珠群偶聯(lián)，用于鑒別與第二"受體"微珠群偶聯(lián)的群體中的相互作用分子。與GDF-9或BMP-15相互作用的肽還可以用于篩選檢測。在此類檢測中使用的一種GDF-9肽是SQLKWDNWIVAPHRYNPRYCKGDC(SEQIDNO:5)。其他基于FRET檢測的實例包括時間解析FRET(例如，PerkinElmer的LANCE系統(tǒng)，Boston,MA)，用于篩選配體二聚化的抑制劑或鑒別與定義的GDF-9或BMP-15肽相互作用的小分子。在另一個實施方案中，還可以使用Biacore系統(tǒng)技術(shù)(BiacoreInternationalAB，Uppsala,Sweden)實時分析小分子或肽與GDF-9或BMP-15的相互作用。本發(fā)明還考慮其他篩選檢測的使用，例如，二次和三次檢測，以進一步鑒別此類分子對骨細胞分化和功能的影響，以及對骨密度的影響，例如使用上文詳細描述的檢測。B)核酸術(shù)語"多核苦酸"、"寡核苷酸"和"核酸"指脫氧核糖核酸(DNA)并且根據(jù)需要指核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。應當理解，該術(shù)語包括核苦酸類似物以及單鏈或雙鏈多核苷酸(例如siRNA)。多核苷酸的實例包括但不限于質(zhì)粒DNA或其片段、病毒DNA或RNA、RNAi等。術(shù)語"質(zhì)粒DNA"指呈環(huán)狀的雙鏈DNA。術(shù)語"siRNA"和"RNAi"指具有誘導mRNA降解的能力因而4吏基因表達"沉默"的雙鏈RNA核酸?？梢宰钄郍DF-9活性的核酸可用于本發(fā)明。此類抑制劑可以編碼與GDF-9本身相互作用的蛋白質(zhì)?？蛇x的，此類抑制劑可以編碼與GDF-9受體(例如ALK5或BMPIIR)相互作用的蛋白質(zhì)，如果其編碼的蛋白質(zhì)阻斷GDF-9與其受體的結(jié)合，或者如果在結(jié)合GDF-9后阻斷受體的活性，則在本發(fā)明中是有效的。當然，抑制劑可以編碼同時與GDF-9及其受體相互作用的蛋白質(zhì)?？梢?吏用此類核酸以侵東達本發(fā)明的GDF-9抑制劑。相似的，可以阻斷BMP-15活性的核酸可用于本發(fā)明。此類抑制劑可以編碼與BMP-15本身相互作用的蛋白質(zhì)?？蛇x的，此類抑制劑可以編碼與BMP-15受體(例如ALK5或BMPIIR)相互作用的蛋白質(zhì)，如果其編碼的蛋白質(zhì)阻斷BMP-15與其受體的結(jié)合，或者如果在結(jié)合BMP-15后阻斷受體的活性，則在本發(fā)明中是有效的。當然，抑制劑可以編碼同時與BMP-15及其受體相互作用的蛋白質(zhì)?？梢允褂么祟惡怂嵋员惚磉_本發(fā)明的BMP-15抑制劑。本發(fā)明的方法涵蓋了使用RNA干擾("RNAi")降低GDF-9或GDF-9受體例如ALK5或BMPIIR的表達。通過引入核酸分子，例如合成的短干擾RNA("siRNA")或RNA干擾試劑，可以起始RNAi,從而抑制或沉默靶基因的表達。見例如，美國專利公開號2003/0153519和2003/01674901，以及美國專利號6，506，559，和6,573,099。本文中使用的"RNA干擾試劑"是任何通過RNA干擾來干擾或抑制靶基因或基因組序列表達的試劑。此類RNA干擾試劑包括但不限于，包括與靶基因和粑基因組序列同源的RNA分子在內(nèi)的核酸分子或其片段、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾或小發(fā)夾(shRNA)和通過RNA干擾來干擾或抑制耙基因表達的小分子。如本文中使用的，"靶基因表達的抑制"包括靶基因或者由靶基因編碼的蛋白質(zhì)在表達或蛋白質(zhì)活性或水平上的任何降低。與沒有被RNA干擾試劑靶向的耙基因的表達，或者由該靶基因編碼的蛋白質(zhì)的活性或水平相比，降低可以是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更多。SiRNA可以是化學合成的，可以是通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，或者可以是在宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生的。一般的，siRNA長度為至少15-50個核苷酸，例如，長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一個實施方案中，siRNA是長度為約15至約40個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)，例如，約15至約28個核苷酸長度，包括約19、20、21或22個核苷酸長度，并可以在每條鏈含有長度為約O、1、2、3、4、5或6個核苷酸的3，和/或5，overhand。在一個實施方案中，siRNA可以通過轉(zhuǎn)錄沉默抑制靶基因。優(yōu)選的，siRNA能夠通過靼信使RNA的降解或特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)來促進RNA干擾。在本發(fā)明的方法中可用的siRNA還包括小發(fā)夾RNA(shRNA)。ShRNA由短(例如，約19至約25個核苷酸)反義鏈組成，后接約5至約9個核苷酸的核苷酸環(huán)，以及類似的正義鏈?？蛇x的，正義鏈可以在核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)之前，反義鏈可以在其之后。這些shRNA可以包含在質(zhì)粒和病毒載體中。本發(fā)明的siRNA分子的靼向區(qū)域可以選自給定的耙序列。例如，核苷酸序列可以從起始密碼子下游的約25-100個核苷酸開始。核苷酸序列可以含有5，或3，非翻譯區(qū)，以及靠近起始密碼子的區(qū)域。設(shè)計和制備siRNA分子的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，包括多種選擇序列作為RNAi試劑的規(guī)則(見例如，Boese等人，MethodsEnzymol.392:73-96(2005))?？梢允褂脴藴始夹g(shù)產(chǎn)生siRNA，如在Hannon，(2002)Nature,418:244-251(2002);McMaiius等人，(2002)Nat.Reviews,3:737-747(2002);Heasman,(2002)Dev.Biol"243:209-214(2002);Stein，(2001)J.Clin.Invest,108:641-644(2001);以及Zamore，(2001)Nat.Struct.Biol"8(9):746-750(2001)中描述的。優(yōu)選的siRNA是5-引物磷酸化的?？梢允褂胹iRNA抑制劑耙向GDF-9、GDF-9受體(包括ALK5和BMPIIR)、BMP-15或BMP-15受體(包括ALK6和BMPIIR)。在Mazerbourg等人，Mol.Endocrinol.18:653-665(2004)中闡明了ALK5的siRNA序列，其與GDF-9作用的劑量依賴性抑制有關(guān)。可以使用反義寡核苷酸降低GDF-9、GDF-9受體、BMP-15或BMP-15受體的表達。本文中使用的"反義"指能夠通過序列互補與mRNA的編碼和/或非編碼區(qū)雜交，從而干擾從mRNA的翻譯的核酸。反義核酸可以使用才示)偉才支術(shù)產(chǎn)生,i口在AntisenseDrugTechnology:Principles,Strategies,andApplications,第一版，Crooke,MarcelDekker編著(2001)中描述的。在Vitt等人，Biol.Reprod.67:473-480(2002)中闡明了BMPIIR反義寡核苷酸的序列?？梢詫⒑怂嵩趶拇蠹s1ng/kg至大約20mg/kg的劑量施用，這取決于癥狀嚴重性和疾病i^艮。適宜的有效劑量通過進行治療的臨床醫(yī)生從如下范圍選擇大約1fig/kg至大約20mg/kg、大約1ng/kg至大約10mg/kg、大約1ng/kg至大約1mg/kg、大約10ng/kg至大約1mg/kg、大約10jig/kg至大約100ng/kg、大約100ng/kg至大約1mg/kg以及大約500jig/kg至大約lmg/kg。核酸抑制劑可以通it^部、口服、靜脈內(nèi)、皿內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮的方法施用。核酸可以從其天然環(huán)境，以基本純的形式或均一形式得到、分離和/或純化。用于在多種不同宿主細胞內(nèi)克隆和表達多肽的系統(tǒng)眾所周知。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域內(nèi)可獲得的用于表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞和眾多其它細胞。常用的細菌宿主是大腸桿菌(E.coli)。對于適合從核酸產(chǎn)生蛋白質(zhì)的其他細胞見GeneExpressionSystems,Fernandez等編輯，AcademicPress(1999)?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的栽體，其包含包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列在內(nèi)的適宜調(diào)節(jié)序列、選擇基因或標志基因以及根據(jù)需要的其他序列。根據(jù)需要載體可以是質(zhì)粒或病毒栽體，例如嗟菌體或嗟粒。對于其他細節(jié)，參見例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,Sambrook等,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。眾多用于操作核酸，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測序、將DNA導入細胞和基因表達以及蛋白質(zhì)分析的已知技術(shù)和方案在CurrentProtocolsinMolecularBiology,編者Ausubel等，第二版，JohnWiley&Sons(1992)中詳細描述。可以將核酸與編碼另外多肽序列，例如作為標志或報道分子起作用的序列的其他序列融合。標志或報告分子的實例包括內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基糖苷砩酸轉(zhuǎn)移酶(負責新霉素(G"W抗性)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(編碼p-半乳糖苷酶)、黃噪呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)、螢光素酶和本領(lǐng)域內(nèi)眾多其他標志或報告分子。II.藥物組合物和給藥方法施用藥物組合物的方法是本領(lǐng)域已知的。"給藥"不限于任何特定的遞送系統(tǒng)，并可以包括而不限于，腸胃外的(包括皮下、靜脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、髓內(nèi)或腹腔內(nèi)注射)、直腸的、局部的、經(jīng)皮的或口服的(例如，以膠嚢、懸浮液或片劑的形式)。向個體給藥可以以單一劑量或以持續(xù)或間隔的重復給藥的方式發(fā)生，并且以多種生理可接受的鹽形式中的任一種形式，和/或具有可藥用載體和/或添加劑作為藥物組合物的一部分(如上述)?？梢詫DF-9和BMP-15的調(diào)節(jié)劑制成藥物組合物。生理可接受的鹽形式和標準的藥物制劑技術(shù)和賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的(見例如，Physicians'DeskReference(PDR)2003，第57版，MedicalEconomicsCompany,2002;和Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennado等人編著，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins，2000)。本發(fā)明的方法中可用的調(diào)節(jié)劑可以以從約1照/kg至約20mg/kg的劑量施用，這取決于癥狀嚴重性和疾病i^艮。適宜的有效劑量通過進行治療的臨床醫(yī)生從如下范圍選擇例如，約lug/kg至約20mg/kg、約ljig/kg至約10mg/kg、約lug/kg至約lmg/kg、約lOpg/kg至約lmg/kg、約lOpg/kg至約100照/kg、約100ng/kg至約lmg/kg，和約500照/kg至約lmg/kg。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法4吏用的組合物還包含可藥用賦形劑。如本文中使用的，詞組"可藥用賦形劑"指任何和所有的溶劑、^L^質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲的和吸收延遲試劑等等，其與藥物施用相容的。此類基質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域普遍已知的。組合物還可以含有其他活性化合物，提供補充的、額外的或增強的治療功效。還可以將藥物組合物與施用說明書共同包括在容器、包裝或分樣器中。將藥物組合物制成符合其預期的給藥途徑。此類組合物的實例包括結(jié)晶蛋白質(zhì)制劑、棵露的提供或結(jié)合生物可降解的多聚物(例如，PEG、PLGA)來提供。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以作為藥物組合物給藥，聯(lián)合載體凝膠、基質(zhì)、賦形劑，或者其他用于指導骨再生和/或骨置換的組合物。此類基質(zhì)的實例包括合成的聚乙二醇(PEG)-、羥磷灰石、基于膠原和纖維蛋白的基質(zhì)、組織血纖蛋白膠等。賦形劑可以包括藥物可接受的鹽、多糖、肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、合成的多聚物、天然多聚物和表面活性劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，GDF-9調(diào)節(jié)劑和BMP-15調(diào)節(jié)劑可以配制成作為可注射的或可植入的組合物用于遞送。組合物可以是適合注射或以固態(tài)植入體內(nèi)的圓柱狀。在一個實施方案中，可注射的制劑包括抑制劑和透明質(zhì)酸酯，如美國專利公開號20050287135中詳細描述的，其引入本文作為參考。例如，Hyaffi1p65可以作為透明質(zhì)酸使用。在另一個實施方案中，可注射的制劑包括調(diào)節(jié)劑和磷酸鈣物質(zhì)，例如無定形磷灰石磷酸鈣、結(jié)晶不好的磷灰石磷酸鉀、羥磷灰石、磷酸三鈣、氟磷灰石及其組合物，如美國專利z^開號20050089579中詳細描述的，其引入本文作為參考。在一些實施方案中，GDF-9抑制劑和BMP-15抑制劑可以以與其他治療性化合物聯(lián)合或伴隨給藥，所述治療性化合物例如，二膦酸鹽(含氮和不含氮)、apomine、睪酮、雌激素、氟化鈉、雷奈酸鍶、維生素D及其類似物、降釣素、鈣補充物、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM，例如，雷洛昔芬)、成骨蛋白(例如，BMP-2)、他汀類、RANKL抑制劑、非基因引向雌激素-樣信號發(fā)放的活化劑(ANGELS)，和甲狀旁腺素(PTH)。(Apomine是新型l，l，-二膦酸酯，其激活farneionX活化受體，并加快HMGCoA(3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A)還原酶的降解(見例如，美國專利公開號2003/0036537和其中引用的參考文獻))。在一個優(yōu)選的實施方案中，GDF-9或BMP-15的抑制劑是與二膦酸鹽共同給藥的，所述二膦酸鹽包括但不限于阿倫膦酸鹽、英卡膦酸、氯膦酸鹽、EB-1053、羥乙二磷酸、伊班膦酸、奈立膦酸、奧帕膦酸、帕米膦酸、利塞膦酸、替魯膦酸鹽、YH529、唑侖西平和可藥用鹽、酯、酸，及其混合物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，GDF-9和/或BMP-15的抑制劑可以與一種或多種成骨蛋白共同給藥，所述成骨蛋白包括但不限于BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP曙7、BMP-9、BMP-IO、BMP-12、BMP-13和MP52。在一個實施方案中，GDF-9的抑制劑與BMP-3的抑制劑共同給藥。還可以通過基因療法的方式，根據(jù)本發(fā)明的方法向個體施用治療劑，然后再將所述細胞引入患者。對于具體的基因療法方案，參見Morgan,GeneTherapyProtocols,第2版，HumanaPress(2000)。HI.篩選和it斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明可以用于鑒別有遺傳傾向于具有改變的骨密度的對象，或者目前已經(jīng)具有改變的骨密度的對象。在一個實施方案中，為了篩選和/或診斷改變的骨密度，比較了來自對象的測試樣品和對照樣品中的GDF-9或BMP-15的相對水平。在測試樣品中GDF-9或BMP-15的改變的水平的存在提示了改變的骨密度和/或在對象中發(fā)展出改變的骨密度的傾向。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其用于檢測與具有野生型核酸序列的對象相比，在含有核酸的樣品中，GDF-9或BMP-15變體核酸序列的存在。在一個實施方案中，對象中GDF-9和/或BMP-15的水平相對于對照樣品是升高的，而且對象具有降低的骨密度，或者增加的發(fā)展出降低的骨密度的風險。在另一個實施方案中，對象中GDF-9或BMP-15的水平相對于對照樣品是降4氐的，對象具有增加的骨密度，或者增加的;Ol出增加的骨密度的可能性?？笹DF-9或BMP-15的特異性抗體，或者抗GDF-9或BMP-15變體的特異性抗體可用于確定樣品中的各蛋白質(zhì)的水平。本發(fā)明提供了方法，其用于檢測待篩選或診斷的對象中的GDF-9或BMP-15或其變體，其包括將抗GDF-9或BMP-15的抗體接觸細胞或蛋白質(zhì)，檢測與抗體的結(jié)合?？梢杂没衔锘蚩蓹z測的標記直接標記抗體，允許檢測與其抗原的結(jié)合。不同的標記和標記的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明中可以使用的標記的類型的實例包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學發(fā)光化合物、發(fā)磷光的化合物，和生物發(fā)光化合物。可以檢測從生物液體和組織中分離的樣品中的GDF-9或BMP-15的水平?？梢允褂萌魏魏锌蓹z測量抗原的標本。本發(fā)明優(yōu)選的樣品是骨組織?？梢詫⒁伤萍毎械腉DF-9或BMP-15的水平與普通細胞中的水平相比較，從而確定對象是否傾向于改變的骨密度。本發(fā)明的抗體適合在例如免疫檢測中使用，包括液相或與固相載體結(jié)合的本發(fā)明的抗體。使用抗體的免疫檢測包括以直接或間接形式的竟爭性和非竟爭性免疫檢測，例如放射免疫檢測(RIA)和三明治夾心(免疫測定)檢測。還可以使用抗體，利用免疫組織化學檢測在生理樣品上檢測GDF-9或BMP-15。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其用于檢測與具有野生型核酸序列的對象相比，在從對象分離的含有核酸的測試樣品中，GDF-9或BMP-15變體核酸序列的存在。本文中^f吏用的"變體"指任何GDF-9或BMP-15核酸序列，其不對應野生型GDF-9或BMP-15核酸序列，以及相應的氨基酸序列。本發(fā)明的方法包括GDF-9或BMP-15片段的變體，其與野生型GDF-9或BMP-15序列的相應片段不享有序列同一性。在本發(fā)明的方法和檢測中有用的變體包括通過天然發(fā)生的或人為操作的突變、限制性片段長度多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、核酸缺失，或核酸取代而產(chǎn)生的改變。"缺失"是核苷酸序列中的改變，其中，失去了一個或多個核苷酸殘基。"取代"是用不同的核苷酸參見取代一個或多個核苷酸殘基。變體還包括肽，或全長蛋白質(zhì)，其在蛋白質(zhì)骨架中包含取代、缺失或插入，但仍然與原始的蛋白質(zhì)在相應的部分保留了70%同源性。保守取代的實例涉及具有相同或相似性質(zhì)的氨基酸。示例性的M酸保守取代包括以下改變丙氨酸至絲氨酸；精氨酸至賴氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；組氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸至亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸至精氨酸，谷氨酰胺，或谷氨酸；曱硫氨酸至亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲石充氨酸；絲氨酸至蘇氨酸；蘇氨酸至絲氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；纈氨酸至異亮氨酸至亮氨酸本文中使用的術(shù)語"分離的"包括基本上不含其他核酸、蛋白質(zhì)；脂類、糖類或其他天然相關(guān)的物質(zhì)的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸序列包括編碼GDF-9或BMP-15變體的DNA和RNA序列?？梢岳斫猓疚闹羞€包括了編碼全長或部分GDF-9或BMP-15變體的所有多核苷酸，例如天然存在的、合成的，和人為操作的多核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明的方法和檢測中的多核苷酸包括作為遺傳密碼結(jié)果的簡并序列?；パa序列可以包括反義核苷酸。還包括上述核酸序列的至少10-15個堿基長度的片段(部分)，其足以允許片段與變體核酸的DNA特異性雜交。方法獲得。例如，可以通過以下方法分離DNA:l)探針與基因組或cDNA文庫雜交來檢測同源的核苷酸序列，2)使用能夠與目標DNA序列退火的引物，在基因組DNA或cDNA上進行聚合SIM式反應(PCR)，和3)抗體篩選表達文庫來檢測共享結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。編碼GDF-9或BMP-15或其變體的特定的DNA序列的開發(fā)還可以通過以下方法獲得l)從基因組DNA中分離雙鏈DNA序列；2)化學產(chǎn)生DNA序列，以提供目標多核苷酸必需的密碼子；和3)通過逆轉(zhuǎn)錄從真核供體細胞中分離的mRNA，在體外合成雙鏈DNA序列。在后一種情況下，形成的與mRNA互補的雙鏈DNA，被稱為cDNA。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供用于鑒別與改變的骨密度相關(guān)的核酸變體的方法，所述方法通過與具有正常骨密度和野生型GDF-9或BMP-15核酸序列的對象相比，檢測從具有改變的骨密度的對象中分離的樣品中的靶GDF-9或BMP-15變體核酸序列的存在。本發(fā)明包括在對象中鑒別等位變體的方法。對象可以是GDF-9或BMP-15變體的純合的或雜合的。如本文中使用的，"等位基因，，是在基因組中以一種以上的形式(不同的序列)出現(xiàn)的基因或核苷酸序列，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)。根據(jù)本發(fā)明，"純合的，，表示基因或SNP的兩份拷貝與其他等位基因在序列上是相同的。例如，野生型GDF-9或BMP-15基因是純合的對象含有至少兩份拷貝的GDF-9或BMP-15野生型序列。此類對象將不傾向于改變的骨密度。如本文中使用的，"雜合的"表示在基因組中存在等位基因的兩份不同的拷貝，例如一拷貝的野生型等位基因和一拷貝的變體等位基因。具有此類基因組的對象是雜合的。"雜合的，，還包括在它的GDF-9或BMP-15等位基因中具有兩個不同的突變的對象。本發(fā)明的一個實施方案提供了開發(fā)對象的GDF-9或BMP-15基因的等位基因譜(allelicprofile)的方法。如本文中使用的"等位基因鐠"，是根據(jù)GDF-9或BMP-15等位基因或其變體的存在或缺失，以及拷貝數(shù)目，確定對象的基因組的組成。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了確定對象改變的骨密度傾向的方法。該方法包括通過從包含GDF-9或BMP-15序列的對象中分離核酸標本，確定對象的GDF-9或BMP-15等位基因語，并確定GDF-9或BMP-15核酸序列中突變的存在或缺失。本發(fā)明還提供了用于確定對象的GDF-9或BMP-15等位基因譜的診斷或預后方法，其包括從對象中分離核酸樣品；使用與耙序列雜交的引物擴增核酸。可以使用任何檢測等位基因變體的方法。例如，等位基因特異的寡核苷酸(ASO，s)可以用作探針來鑒別此類變體。ASO探針可以是任何適合檢測目標序列的長度。優(yōu)選的此類探針是10-50個核苷酸長度，并將通過同位素或非同位素的方法可檢測的標記。可以可選的擴增革巴序列，并在Southern印跡固定之前通過凝膠電泳分離?？蛇x的，可以將含有未擴增的核酸的提取物轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上，并用斑點印跡直接探測。此外，可以通過相同限制性位點的改變鑒別等位基因特異的改變。突變有時改變限制性酶切位點，或者可選的，引入原先不存在的限制性位點。限制性酶識別位點的改變或增加可用于鑒別特定的變體。在本發(fā)明的方法中使用的引物包括足夠長度和合適序列的寡核香酸，其在嚴格條件下，為使用引物的反應提供含有靼核酸的大量核酸分子聚合作用的特異起始。在該方法中，能夠選擇性的擴增含有目標核酸的特異的耙核酸序列。特別的，本文中使用的術(shù)語"引物"指包含兩個或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列，優(yōu)選至少八個，該序列能夠起始引物延伸產(chǎn)物的合成，所述產(chǎn)物與靶核酸鏈基本互補。寡核苷酸引物一般含有15-22個或更多的核苷酸，但是，只要引物具有足夠特異性以基本上只允許特定的理想靶核苷酸序列的擴增(即，引物是基本上互補的)，它可以含有更少的核苷酸。每條鏈"基本上"互補?；旧匣パa意指引物必須足夠的互補，從而在允許聚合的物質(zhì)發(fā)揮功能的條件下與它們各自的鏈雜交。換言之，引物應該與雜交的側(cè)翼序列具有足夠的互補性，以允許突變核苷酸序列的擴增。優(yōu)選的，引物延伸的3'端延伸為與互補的側(cè)翼鏈完全互補的堿基對。寡核苷酸引物可用于任何產(chǎn)生增加的靶核酸的量的擴增方法，所述擴增方法包括聚合i^式反應。一般的，一條引物與突變核苷,列的負(-)鏈互補，另一條與正(+)鏈互補。引物與變性的核酸退火，然后用酶延伸，例如DNA聚合酶I的大片段(Klenow)或TaqDNA聚合酶，以及核苷酸或連接酶，獲得新合成的含有靼核酸的+鏈和-鏈。由于這些新合成的核酸也是模板，變性、引物退火和延伸的重復循環(huán)獲得了由引物定義的區(qū)域(即，靶突變核苷酸序列)的指數(shù)產(chǎn)品。擴增反應的產(chǎn)物是*的核酸雙螺旋，具有與4吏用的特異引物的末端相應的末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其他的擴增方法學，其也可用于增加靶核酸的拷貝數(shù)。來自任何組織標本純化或非純化形式的核酸都可以作為一個或多個起始核酸使用，如果它含有，或疑似含有包含靼核酸的特異的核酸序列。因此，該方法可以4吏用，例如，DNA或RNA，包括信使RNA(mRNA)，其中DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈。在使用RNA作為模板的情況下，應該使用適合將才莫板逆轉(zhuǎn)錄為DNA的酶和/或條件。此外，可以使用^^有一條鏈的DNA-RNA雜化物。釆用相同或不同的引物還可以使用核酸的混合物，或者在本文中上述擴增反應中產(chǎn)生的核酸。被擴增的突變核苷酸序列可以是更大分子的一部分，或者開始可以作為分離的分子存在，從而特異的序列構(gòu)成整個核酸。待擴增的序列開始以純化的形式存在并不是必需的；它可以是復雜混合物的小部分，例如包含在整個人或動物DNA中?？梢酝ㄟ^Southern印跡分析檢測擴增的產(chǎn)物，不需要使用放射性探針。在此類方法中，例如，擴增含有極低水平的突變核苷酸序列的DNA小樣品，并通過Southern印跡技術(shù)分析。通過高水平的擴增信號方便非放射性探針或標記的使用。當耙核酸沒有擴增時，可以在分離的核酸上直接實施使用合適雜交探針的檢測。在這些實例中，當耙核酸被擴增時，使用合適的雜交探針的檢測將在擴增后實施。本發(fā)明的探針可用于檢查所檢測的特異片段的分布，以及探針結(jié)合的定量(相對)程度，以用于確定特異性強結(jié)合(雜交)序列的存在。本發(fā)明的探針可以用原子或無機基團可檢測標記，最常使用放射性核素，但還可使用重金屬?？梢允褂萌魏翁峁┏渥阈盘柡途哂凶銐虬胨テ诘姆派湫詷擞?。其他標記包括配體，標記的配體可以作為特異性結(jié)合對的成員等?？梢允褂迷诿庖邫z測中常規(guī)使用的多種標記。熒光化合物包括螢光素(fluorescein)及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光物包括螢光素(luciferin)和2,3-二氫酞嗪二酮(2，3-dihydrophtha-lazinediones，例如，魯米諾)。液中或者在與固體支持物結(jié)合后，通過通常用于特異性DNA序列檢測的任何方法，例如PCR、寡聚體限制性酶消化(oligomerrestriction,Saiki等人，Bio/Technology,3:1008-1012,1985)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO膝針分析(Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sd.USA，80:278，1983)、寡核苷酸連接檢測(OLA)(Landegren等人，Science,241:1077，1988)等，進行進一步評估、檢測、克隆、測序等等。本發(fā)明還提供用于檢測GDF-9和/或BMP-15中改變的水平或突變的試劑盒。此類試劑盒可包括可檢測的或能夠可檢測標記的探針。此類探針可分別是特異性針對靶蛋白或其片段，或者靼核酸或其片段的抗體或核苷酸，其中靼是指定的，或者與GDF-9或BMP-15或其變體的存在相關(guān)。例如，本發(fā)明的寡核苷酸探針可以包括在試劑盒中，并用于檢查GDF-9變體或BMP-15變體，以及探針結(jié)合的定量(相對)程度，以確定特異性強結(jié)合(雜交)序列的存在，從而提示對象具有或傾向具有改變的骨密度的可能性。在一個實施方案中，試劑盒使用核酸雜交來檢測靼核酸，試劑盒還可以具有容器，其含有用于靶核酸序列擴增的一個或多個核苷酸。當需要擴增耙核酸序列例如變體核酸序列時，其可以使用寡核苦酸來完成，所述寡核苷酸是用于擴增的引物。在一個實施方案中，試劑盒可以提供含有抗體的容器，所述抗體與耙蛋白或其片段、或此類蛋白質(zhì)或其片段的變體結(jié)合。因此，試劑盒可以含有與野生型GDF-9或BMP-15或其變體結(jié)合的抗體。此類抗體可用于區(qū)分特定的GDF-9或BMP-15變體的存在，或此類變體在標本中的表達水平。下列實施例提供了本發(fā)明的示例性的實施方案。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將i人識到，在不改變本發(fā)明的精神或范圍的條件下，可以進行大量的修飾和改變。此類修飾和改變都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例不以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1:在GDF-9敲除小鼠中的骨礦物質(zhì)密度在雌性小鼠中分析GDF-9無效突變對骨礦物質(zhì)密度的影響。以前已經(jīng)描述過GDF-9敲除小鼠(Dong等人，Nature383:531-535(1996))。在16周齡(表l)和10月齡(表2)的雌性小鼠中如下確定總的、骨小梁的和皮質(zhì)的容積骨礦物質(zhì)密度(volumetricbonemineraldensity,vBMD)。4吏用XCTResearch外周定量計算機化斷層顯像密度儀(pQCT;StratecMedizinetechnik,Pforzheim,德國)評估左側(cè)股骨的容積骨礦物質(zhì)密度(vBMD，mg/cm3)。從臨近股骨遠端2.5mm處獲得了一份0.5mm厚的pQCT切片，并被用于計算股骨遠端干骺端的總的和骨小梁的骨密度。使用臨近股骨端6mm處獲得的第二片切片評估皮質(zhì)的密度。斷層切片具有0.07mm的平面像素尺寸(in-planepixelsize)。在獲取圖像后，顯示圖像，并畫出包含每次掃描的目標區(qū)域的整個股骨輪廓。使用迭代算法自動移去軟組織，確定在第一份切片中的殘留骨的密度(總密度)。然后，以同心螺旋剝?nèi)ス堑耐鈱?5%，以mg/ci^公布第一個切片的殘留骨(骨小梁密度)的密度。在第二個切片中，使用迭代算法確定骨皮質(zhì)和骨小梁之間的邊界，并確定骨皮質(zhì)的密度。表l:在16周齡的GDF-9敲除的雌性小鼠中的骨密度<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>N=10;a:平均值(mg/cms)±SEM;b:平均值(mm)±SEM;*:pO.05vs.相應的野生型值(學生T檢驗)**:PO.Olvs.相應的野生型值(學生T檢驗)表2:在10月齡的雌性小鼠中GDF-9無效突變對骨礦物質(zhì)密度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>N-8只動物/組；a.與各自的WT(sFRP)測量顯著不同(P<0.05;學生T檢驗)；sFRP動物短暫的暴露在高溫。根據(jù)本說明書中所引用參考文獻的教導，對本說明書進行最徹底的理解。本說明書中的實施方案提供了對本發(fā)明實施方案的說明并且不應當被解釋為限制本發(fā)明的范圍。技術(shù)人員將容易地認識到在本發(fā)明所包含的眾多其它實施方案。將^/>開中所引用的全部出版物、專利和生物序列完整地引用作為參考。當參考文獻所包括的材料有悖于本說明書或與本說明書不一致時，本說明書將優(yōu)先于任何此類材料。引用本文中的任意參考文獻并不承認此類參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。除非另外指出，在所有情況下，將本說明書(包括權(quán)利要求書)中所用的表示成分數(shù)量、細胞培養(yǎng)、治療條件等的全部數(shù)字理解為由術(shù)語"大約，，修飾。因此，除非另外相反地指出，數(shù)字性參數(shù)為近似值并且根據(jù)本發(fā)明所欲得到的目的特性而變化。除非另外指出，在一系列要素前的術(shù)語"至少，，應當理解為指該系列中的每一要素。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將識別到，或使用不超過常規(guī)的實驗法能夠確定與本文所述的本發(fā)明特定實施方案的眾多等效物。此類等效物將旨在包含于如下權(quán)利要求書中。權(quán)利要求1、在哺乳動物中治療或預防骨疾病的方法，所述方法包括在一段時間內(nèi)向需要的哺乳動物施用一定量的GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑，所述施用的量和時間足以治療或預防骨疾病。2、權(quán)利要求1的方法，其中GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑是GDF-9或BMP-15的抑制劑，骨疾病是骨退行性疾病。3、權(quán)利要求2的方法，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。4、權(quán)利要求2的方法，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。5、權(quán)利要求2的方法，其中骨疾病選自骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓癌、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障礙、骨髓癌高鈣血癥、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。6、權(quán)利要求5的方法，其中疾病是骨質(zhì)疏松。7、權(quán)利要求6的方法，其中骨質(zhì)疏松是閉經(jīng)后的、類固醇誘導的、老年性的或甲狀腺素使用誘導的。8、權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物中的骨疾病與以下一種或多種情況相關(guān)高血鈣、慢性腎病、腎透析、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進、炎癥性腸病、克羅恩氏病，和長期卩吏用皮質(zhì)類固醇、GnRH激動劑或拮抗劑。9、在哺乳動物中減慢骨破壞、維持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的方法，所述方法包括在一段時間內(nèi)向需要的哺乳動物施用治療有效量的GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑，所述施用的量和時間足以減慢骨破壞、重建缺失的骨，或刺激新骨形成。10、權(quán)利要求9的方法，其中調(diào)節(jié)劑是GDF-9抑制劑。11、權(quán)利要求9的方法，其中調(diào)節(jié)劑是BMP-15抑制劑。12、權(quán)利要求9的方法，其中骨破壞的特征是骨量的減少。13、權(quán)利要求12的方法，其中骨量的減少是通過測量骨礦物質(zhì)密度確定的。14、權(quán)利要求9的方法，其中骨破壞的特征是骨質(zhì)量的惡化。15、權(quán)利要求14的方法，其中骨質(zhì)量的惡化是通過評估骨的顯微結(jié)構(gòu)的完整性來確定的。16、權(quán)利要求1或9的方法，其中哺乳動物是人類。17、權(quán)利要求1或9的方法，其中調(diào)節(jié)劑選自化合物、抗體、蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA和RNA干擾物質(zhì)。18、權(quán)利要求17的方法，其中調(diào)節(jié)劑是抗體。19、權(quán)利要求18的方法，其中抗體選自抗GDF-9抗體、抗GDF-9受體抗體、抗BMP-15抗體，和抗BMP-15受體抗體。20、權(quán)利要求18的方法，其中抗體是人抗體或其人源化衍生物。21、權(quán)利要求18的方法，其中抗體是單克隆抗體。22、權(quán)利要求18的方法，其中抗體特異性的結(jié)合成熟的GDF-9蛋白。23、權(quán)利要求18的方法，其中抗體特異性的結(jié)合成熟的BMP-15蛋白。24、權(quán)利要求17的方法，其中調(diào)節(jié)劑特異性的結(jié)合成熟的GDF-9蛋白或成熟的BMP-15蛋白。25、權(quán)利要求17的方法，其中調(diào)節(jié)劑抑制GDF-9多肽與其受體之間相互作用介導的信號發(fā)放，或者調(diào)節(jié)劑抑制BMP-15多肽與其受體之間的相互作用介導的信號發(fā)放。26、權(quán)利要求17的方法，其中調(diào)節(jié)劑選自可溶性GDF-9受體、結(jié)合GDF-9受體的蛋白質(zhì)、可溶性BMP-15受體，和結(jié)合BMP-15受體的蛋白質(zhì)。27、權(quán)利要求17的方法，其中RNA干擾物質(zhì)是雙鏈的、短干擾RNA(siRNA)。28、權(quán)利要求27的方法，其中siRNA通過轉(zhuǎn)錄沉默抑制GDF-9或BMP15。29、權(quán)利要求1或9的方法，其中調(diào)節(jié)劑是全身給藥。30、權(quán)利要求1或9的方法，其中調(diào)節(jié)劑以選自以下范圍的有效劑量施用ljig/kg和20mg/kg、lpg/kg和10mg/kg、lfig/kg和lmg/kg、10照/kg和lmg/kg、10照/kg和100照/kg、lOO^ig/kg和lmg/kg,和500ng/kg和lmg/kg。31、權(quán)利要求1或9的方法，其中調(diào)節(jié)劑在至少兩周的時間段內(nèi)重復施用。32、增加骨皮質(zhì)密度的方法，所述方法包括向哺乳動物施用治療有效量的權(quán)利要求17的調(diào)節(jié)劑，從而增加骨皮質(zhì)密度。33、增加骨小梁密度的方法，所述方法包括向哺乳動物施用治療有效量的權(quán)利要求17的調(diào)節(jié)劑，從而增加骨小梁密度。34、權(quán)利要求1或9的方法，所述方法還包括向哺乳動物施用一種或多種骨疾病治療物質(zhì)，所述治療物質(zhì)選自二膦酸鹽、降釣素、雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、曱狀旁腺激素、維生素及其組合。35、權(quán)利要求34的方法，其中骨疾病治療物質(zhì)是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。36、權(quán)利要求34的方法，其中骨疾病治療物質(zhì)是二膦酸鹽。37、權(quán)利要求1或9的方法，所述方法還包括向哺乳動物施用一種或多種成骨蛋白。38、權(quán)利要求37的方法，其中成骨蛋白選自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP10、BMP-12、BMP-13和MP52。39、權(quán)利要求37的方法，其中成骨蛋白是BMP-3的抑制劑。40、在哺乳動物中降低生育力，以及治療或預防骨疾病的方法，所述方法包括在一段時間內(nèi)向需要的哺乳動物施用一定量的GDF-9或BMP-15的抑制劑，所述施用的量和時間足以降低生育力，以及治療或預防骨疾病。41、權(quán)利要求40的方法，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。42、權(quán)利要求40的方法，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。43、權(quán)利要求40的方法，其中骨疾病選自骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓癌、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障礙、骨髓癌高鈣血癥、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。44、權(quán)利要求43的方法，其中疾病是骨質(zhì)疏松。45、權(quán)利要求40的方法，其中哺乳動物中的骨疾病與以下一種或多種情況相關(guān)高血鈣、慢性腎病、腎透析、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁g能亢進，和長期使用皮質(zhì)類固醇。46、在哺乳動物中降低生育力，以及減慢骨破壞、維持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的方法，所述方法包括在一段時間內(nèi)向向需要的哺乳動物施用治療有效量的GDF-9或BMP-15的抑制劑，所述施用的量和時間足以降低生育力，以及減慢骨破壞、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的時間。47、權(quán)利要求46的方法，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。48、權(quán)利要求46的方法，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。49、權(quán)利要求46的方法，其中骨破壞的特征是骨量的減少。50、權(quán)利要求49的方法，其中骨量的減少是通過測量骨礦物質(zhì)密度確定的。51、權(quán)利要求46的方法，其中骨破壞的特征是骨質(zhì)量的惡化。52、權(quán)利要求51的方法，其中骨質(zhì)量的惡化是通過評估骨的顯微結(jié)構(gòu)的完整性來確定的。53、權(quán)利要求40或46的方法，其中哺乳動物是人類。54、篩選和/或診斷對象中改變的骨密度的方法，其包括a)確定來自對象的測試樣品中的GDF-9或BMP-15的水平；和b)比較測試樣品中的GDF-9或BMP-15的水平與對照樣品中的GDF-9或BMP-15的水平，其中與對照樣品相比，測試樣品中的改變的GDF-9或BMP-15的水平提示對象中改變的骨密度，和/或發(fā)展出改變的骨密度的傾向。55、權(quán)利要求54的方法，其中GDF-9或BMP-15的水平相對于對照樣品是升高的，對象具有降低的骨密度或增加的t艮出降低的骨密度的風險。56、權(quán)利要求54的方法，其中GDF-9或BMP-15的水平相對于對照樣品是降低的，并且對象具有增加的骨密度或增加的t艮出增加的骨密度的可能性。57、權(quán)利要求54的方法，其中使用捕獲試劑確定GDF-9或BMP-15的水平。58、權(quán)利要求57的方法，其中捕獲試劑是抗體。59、權(quán)利要求58的方法，其中抗體包含可檢測的標記。60、權(quán)利要求54的方法，其中可檢測的標記選自放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物和化學發(fā)光化合物。61、i貪斷試劑盒，其包括特異針對GDF-9多肽或BMP-15多肽的捕獲試劑、試劑和使用說明書。62、篩選對象中改變的骨密度的方法，所述方法包括確定在來自對象的測試樣品中編碼GDF-9或BMP-15的多核苦酸中至少一種核酸變化的存在或缺失，其中至少一種核酸變化的存在提示對象中改變的骨密度，和/或M出改變的骨密度的傾向。63、權(quán)利要求62的方法，其中通過將樣品與寡核苷酸探針接觸，檢測至少一種核酸變化的存在或缺失，所述寡核苷酸探針與編碼GDF-9或BMP-15的多核苷酸特異性雜交。64、權(quán)利要求63的方法，其中寡核苷酸探針包含編碼GDF-9或BMP-15的多核苷酸的至少約15個核苷酸的部分，所述多核香酸選自SEQIDNO:l，和SEQIDNO:3所示的多核苷酸。65、斥又利要求62的方法，其中多核苷酸選自DNA、基因組DNA、cDNA、RNA和mRNA。66、權(quán)利要求62的方法，其中多核苷酸編碼GDF-9或BMP-15變體。67、權(quán)利要求62的方法，其中多核苷酸編碼突變的GDF-9或BMP-15。68、權(quán)利要求67的方法，其中突變的GDF-9或BMP-15是截短的GDF-9或BMP-15。69、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在產(chǎn)生用于治療或預防所需哺乳動物中的骨疾病的藥物中的用途。70、權(quán)利要求l的用途，其中GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑是GDF畫9或BMP-15的抑制劑，骨疾病是骨退行性疾病。71、權(quán)利要求70的用途，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。72、權(quán)利要求70的用途，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。73、權(quán)利要求70的用途，其中骨疾病選自骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓癌、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障礙、骨髓癌高鈣血癥、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。74、權(quán)利要求73的用途，其中疾病是骨質(zhì)疏松。75、權(quán)利要求74的用途，其中骨質(zhì)疏松是閉經(jīng)后的、類固醇誘導的、老年性的或曱狀腺素使用誘導的。76、權(quán)利要求70的用途，其中哺乳動物中的骨疾病與以下一種或多種情況相關(guān)高血鈣、慢性腎病、腎透析、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁1*^1能亢進、炎癥性腸病、克羅恩氏病，和長期使用皮質(zhì)類固醇、GnRH激動劑或拮抗劑。77、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在制備用于在所需哺乳動物中減慢骨^^壞、維持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的藥物中的用途。78、權(quán)利要求77的用途，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。79、權(quán)利要求77的用途，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。80、權(quán)利要求77的用途，其中骨破壞的特征是骨量的減少。81、權(quán)利要求80的用途，其中骨量的減少是通過測量骨礦物質(zhì)密度確定的。82、權(quán)利要求77的用途，其中骨破壞的特征是骨質(zhì)的退化。83、權(quán)利要求82的用途，其中骨質(zhì)量的惡化是通過評估骨的顯微結(jié)構(gòu)的完整性來確定的。84、權(quán)利要求70或77的用途，其中哺乳動物是人類。85、權(quán)利要求70或77的用途，其中調(diào)節(jié)劑選自化合物、抗體、蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA，和RNA干擾物質(zhì)。86、權(quán)利要求85的用途，其中調(diào)節(jié)劑是抗體。87、權(quán)利要求86的用途，其中抗體選自抗GDF-9抗體、抗GDF-9受體的抗體、抗BMP-15抗體，和抗BMP-15受體的抗體88、權(quán)利要求86的用途，其中抗體是人抗體或其人源化衍生物。89、權(quán)利要求86的用途，其中抗體是單克隆抗體。90、權(quán)利要求86的用途，其中抗體特異性的結(jié)合成熟的GDF-9蛋白。91、權(quán)利要求86的用途，其中抗體特異性的結(jié)合成熟的BMP-15蛋白。92、權(quán)利要求85的用途，其中調(diào)節(jié)劑特異性的結(jié)合成熟的GDF-9蛋白或成熟的BMP-15蛋白。93、權(quán)利要求85的用途，其中調(diào)節(jié)劑抑制GDF-9多肽與其受體之間的相互作用介導的信號發(fā)放，或者調(diào)節(jié)劑抑制BMP-15多肽與其受體之間的相互作用介導的信號發(fā)放。94、權(quán)利要求85的用途，其中調(diào)節(jié)劑選自可溶性GDF-9受體、結(jié)合GDF-9受體的蛋白質(zhì)、可溶性BMP-15受體，和結(jié)合BMP-15受體的蛋白質(zhì)。95、權(quán)利要求85的用途，其中RNA干擾物質(zhì)是雙鏈的、短干擾RNA(siRNA)。96、權(quán)利要求95的用途，其中siRNA通過轉(zhuǎn)錄沉默抑制GDF-9或BMP15。97、權(quán)利要求70或77的用途，其中調(diào)節(jié)劑全身給藥。98、權(quán)利要求70或77的用途，其中調(diào)節(jié)劑以選自以下范圍的有效劑量給藥lfig/kg和20mg/kg、lpg/kg和10mg/kg、l照/kg和lmg/kg、10|tig/kg和lmg/kg、10pg/kg和100照/kg、綱ng/kg和lmg/kg，和500ng/kg和lmg/kg。99、權(quán)利要求70或77的用途，其中調(diào)節(jié)劑在至少兩周的時間段內(nèi)重復施用。100、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在制備用于在所需哺乳動物中增加骨皮質(zhì)密度的藥物中的用途，其中調(diào)節(jié)劑選自化合物、抗體、蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA,和RNA干擾物質(zhì)。101、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在制備用于在所需哺乳動物中增加骨小梁密度的藥物中的用途，其中調(diào)節(jié)劑選自化合物、抗體、蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA，和RNA干擾物質(zhì)。102、權(quán)利要求70或77的用途，其中組合物還包含一種或多種骨疾病治療物質(zhì)，所述治療物質(zhì)選自二膦酸鹽、降鈣素、雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺激素、維生素及其組合。103、權(quán)利要求102的用途，其中骨疾病治療物質(zhì)是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。104、權(quán)利要求34的用途，其中骨疾病治療物質(zhì)是二膦酸鹽。105、權(quán)利要求70或77的用途，其中組合物還包含一種或多種成骨蛋白。106、權(quán)利要求105的用途，其中成骨蛋白選自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP畫6、BMP-7、BMP畫9、BMP-IO、BMP-12、BMP-13和MP52。107、權(quán)利要求105的用途，其中成骨蛋白是BMP-3的抑制劑。108、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在制備用于在所需哺乳動物中降低生育力，以及治療或預防骨疾病的藥物中的用途。109、權(quán)利要求108的用途，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。110、權(quán)利要求108的用途，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。111、權(quán)利要求108的用途，其中骨疾病選自骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓癌、骨營養(yǎng)不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、骨再生障礙、骨髓癌高鈣血癥、多發(fā)性骨髓癌和轉(zhuǎn)移后的骨薄化。112、權(quán)利要求lll的用途，其中疾病是骨質(zhì)疏松。113、權(quán)利要求108的用途，其中哺乳動物中的骨疾病與以下一種或多種情況相關(guān)高血鈣、慢性腎病、腎透析、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進，和長期使用皮質(zhì)類固醇。114、GDF-9或BMP-15的調(diào)節(jié)劑在制備用于在所需哺乳動物中降低生育力和減慢骨破壞、維持骨、重建缺失的骨，或刺激新骨形成的藥物中的用途。115、權(quán)利要求114的用途，其中抑制劑是GDF-9抑制劑。116、權(quán)利要求114的用途，其中抑制劑是BMP-15抑制劑。117、權(quán)利要求114的用途，其中骨破壞的特征是骨量的減少。118、權(quán)利要求117的用途，其中骨量的減少是通過測量骨礦物質(zhì)密度確定的。119、權(quán)利要求114的用途，其中骨破壞的特征是骨質(zhì)量的惡化。120、權(quán)利要求119的用途，其中骨質(zhì)量的惡化是通過評估骨的顯微結(jié)構(gòu)的完整性來確定的。121、權(quán)利要求108或114的用途，其中哺乳動物是人類。全文摘要本發(fā)明提供了用于治療或預防骨退行性疾病的方法。治療或預防的疾病包括，例如，骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓瘤、骨營養(yǎng)不良、佩吉特病、成骨不全，和與慢性腎病、甲狀旁腺機能亢進，和長期使用皮質(zhì)類固醇相關(guān)的骨退行性疾病。本發(fā)明公開的方法包括向哺乳動物施用GDF-9的抑制劑或BMP-15的抑制劑，所述抑制劑的量可有效的(1)治療或預防骨退行性疾?。?2)減慢骨破壞；(3)重建缺失的骨；(4)刺激新骨形成；和/或(5)維持骨量和/或骨質(zhì)量。本發(fā)明還提供施用GDF-9激動劑或BMP-15激動劑治療特征為骨密度或骨量增加為特征的骨疾病。文檔編號A61P15/18GK101410132SQ200780011309公開日2009年4月15日申請日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日發(fā)明者A·巴帕特,E·S·舍恩,F·J·貝克斯三世,G·S·科普夫,M·V·錢加瓦拉,P·E·史蒂維斯,V·M·謝納蘇庫基,Y·P·卡羅迪申請人:惠氏公司