專(zhuān)利名稱(chēng)：用于預(yù)防、穩(wěn)定和/或抑制病理性新生血管形成相關(guān)病癥的可注射用藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是眼科領(lǐng)域的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的治療。具體而言，本發(fā)明涉及包含能夠抑制胰島素受體底物I (IRS-1)表達(dá)的反義寡核苷酸GS-101的可注射用藥物組合物，以預(yù)防和/或治療眼的病理性新生血管形成相關(guān)病癥。
背景技術(shù)：
血管生成是新血管通過(guò)其形成的基本過(guò)程。該過(guò)程在多種正常生理現(xiàn)象例如生殖、發(fā)育、甚至傷口愈合中是必不可少的。內(nèi)皮細(xì)胞的新生血管形成包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)和分化。這些生物現(xiàn)象的調(diào)節(jié)與胰島素受體底物I(IRS-1)相關(guān)，胰島素受體底物I是細(xì)胞質(zhì)?？康鞍祝浒l(fā)揮活化的細(xì)胞表面受體(包括胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF-1)、催乳素、生長(zhǎng)激素(GH)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體，整合素受體家族成員)的下游的必需信號(hào)傳導(dǎo)中間體的作用，并選擇細(xì)胞因子受體。盡管新生血管形成可能是正常的生理過(guò)程，但是病理性新生血管形成在許多疾病中尤其是在眼科中是關(guān)鍵的情況。在眼科中，眼后段的病變特別是視網(wǎng)膜病變是現(xiàn)代社會(huì)更多致殘病變中的一些。這些病變中的許多以視網(wǎng)膜、虹膜和脈絡(luò)膜異常新生血管形成，隨之形成功能失調(diào)的新生血管(其可能導(dǎo)致滲漏或出血或可能與導(dǎo)致視力下降的視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜/玻璃體出血或視網(wǎng)膜脫離有關(guān))為特征(Survey of Ophthalmology, Jan.2007, Vol.52, SI, S3-S19)。眼部病理性新生血管還已知為人類(lèi)失明的主要原因之一，并在不同的眼部疾病中發(fā)現(xiàn)(Bradley等,2007, AngiogenesislO:141-8;Chen和 Smith, 2007, AngiogenesislO:133-40;Friedlander 等,2007, AngiogenesislO:89-101)。目前正在實(shí)施用于治療眼后段疾病如葡萄膜炎、黃斑變性、黃斑水腫等的療法中，玻璃體內(nèi)注射皮質(zhì)類(lèi)固醇是之一。然而，皮質(zhì)類(lèi)固醇具有眾所周知的缺點(diǎn)，仍然需要新的用于治療與病理性新生血管形成相關(guān)的眼睛內(nèi)部紊亂、病癥或疾病的療法。本發(fā)明帶來(lái)解決方案:現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)稱(chēng)為GS-101的特異性寡核苷酸，已知在局部給藥中其抑制 IRS-1 基因表達(dá)的能力(例如 EP1409672，Bock 等，Ophthalmologe, 2007, 104:336-44;Al-Mahmood 等，The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 2
009,329:496-504; Cursiefen 等,Ophthalmology, 2009, 116 (9): 1630-7),當(dāng)眼內(nèi)給藥用于治療與病理性新生血管形成相關(guān)的眼睛內(nèi)部的病變時(shí)是特別使人感興趣的。這是令人驚奇的，因?yàn)轶w外GS-101對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的效果在24小時(shí)溫育后是最大的且是暫時(shí)的。根據(jù)這些結(jié)果，當(dāng)在眼后段內(nèi)給藥時(shí)GS-101，沒(méi)有預(yù)期長(zhǎng)期效果。 眼內(nèi)途徑帶來(lái)了使給予患者治療有效但低量的活性成分成為可能的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)。其還有控制精確的給藥量以及避免任何患者引起的對(duì)治療不遵從的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸， 5 ’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，或具有包含9至30個(gè)核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95%或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，并且所述組合物通過(guò)在眼后段內(nèi)給藥來(lái)施用給需要其的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的功能保守序列是5’ -TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:2)。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的功能保守序列選自以下組成的組:5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3’ (SEQ ID NO:4)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCAT-3’ (SEQ ID NO:8)5’-CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5，-TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 10)5，-CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 11)5，-CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 12)5，-GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 13)5，-GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 14)5，-AGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 15)5，-GGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 16)5，-GCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 17)5，-CTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 18)5，-TCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 19)5，-CGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO:20)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明的藥物組合物中的寡核苷酸的濃度為約 0.01mg/ml 至約 100mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每次給藥注射的組合物體積范圍為I至500 μ I。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，眼后段內(nèi)給藥是玻璃體內(nèi)注射。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所述的組合物注射至多每周一次，優(yōu)選每?jī)芍芤淮?，更?yōu)選每三周一次，甚至更優(yōu)選一個(gè)月一次，還甚至更優(yōu)選每?jī)蓚€(gè)月一次。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物以單位劑量的形式包裝，優(yōu)選所述單位劑量是一次性注射器。有利地，所述組合物是無(wú)菌的。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，病理性新生血管形成相關(guān)的病癥可以是葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變。
具體實(shí)施例方式因此，本發(fā)明涉及用于治療眼睛內(nèi)部的與病理性新生血管形成相關(guān)的眼部疾病的或用于在所述治療中使用的藥物組合物，其中所述組合物包含治療有效量的GS-101且所述組合物通過(guò)眼內(nèi)途徑給予需要其的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述眼內(nèi)途徑指眼睛內(nèi)部給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的組合物治療的眼部疾病是與病理性視網(wǎng)膜血管形成相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物配制成適合于眼內(nèi)注射的形式。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，所述組合物是水溶液。水溶液的實(shí)例包括但不限于GS-101在NaCl中的溶液，優(yōu)選在0.9%NaCl中。根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，所述組合物在植入物內(nèi)。根據(jù)第三個(gè)實(shí)施方案，所述組合物與持續(xù)遞送系統(tǒng)、組合物或裝置聯(lián)合。根據(jù)第四個(gè)實(shí)施方案，所述組合物可包含GSlOl和聚合劑。根據(jù)本發(fā)明，GS-101是具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，或具有包含9至30個(gè)核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95%或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制病理性新生血管形成能力。術(shù)語(yǔ)“同一性” 或“相同的”，當(dāng)用于兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的序列之間的關(guān)系時(shí)，指核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)的程度，由兩個(gè)或更多個(gè)堿基串之間的匹配數(shù)所確定?！巴恍浴睖y(cè)量?jī)蓚€(gè)或多個(gè)序列的較小者之間的相同匹配的百分比，由特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即“算法”)處理空位比對(duì)(如果有的話)。相關(guān)核苷酸序列的同一性可以容易地通過(guò)已知的方法計(jì)算。這些方法包括但不限于Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編著,Oxford University Press,紐約,1988;Biocomputing:1nformatics andGenome Projects, Smith, D.ff.編著，Academic Press,紐約，1993; Computer Analysisof Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.編著,Humana Press,新澤西，1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., AcademicPress, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux, J.編著，M.StocktonPress,紐約，1991;以及 Carillo 等，SIAM J.Applied Math.48, 1073(1988)。用于確定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計(jì)為給出測(cè)試序列之間的最大匹配。在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中描述確定同一性的方法。用于確定兩個(gè)序列之間同一性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括GCG程序包，包括 GAP ((Devereux 等，Nucl.Acid.Res.\2, 387 (1984) ; Genetics Computer Group,威斯康星大學(xué)，麥迪遜，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul等，J.Mo1.Biol.215，403-410 (1990))。BLASTX程序從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)以及其他來(lái)源(BLAST Manual, Altschul 等，NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894; Altschul 等，同前)可公眾獲得。眾所周知的Smith Waterman算法也可用來(lái)確定同一'丨生。SEQ ID NO:1 的功能保守序列的實(shí)例是SEQ ID NO: 2 (5，-TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’)。SEQ ID NO:1的功能保守序列的其它實(shí)例是以下序列:5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3，(SEQ ID NO:4)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5，-TCTCCGGAGG GCTCGCCAT-3，(SEQ ID NO:8)5’-CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5，-TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 10)5，-CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 11)5，-CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 12)5，-GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 13)5，-GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 14)5，-AGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 15)5，-GGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 16)5，-GCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 17)5，-CTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 18)5，-TCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 19)5，-CGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO:20)根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述包含9至30個(gè)核苷酸的功能保守序列可以是在C-末端和N-末端中的其他核酸之間包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的序列。所述功能保守序列還可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的9至12個(gè)連續(xù)核苷酸片段。所述藥物組合物可以包含如上所述的GS-101或如上所述的其功能保守序列與用于眼內(nèi)途徑的任何藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述眼內(nèi)途徑是眼睛內(nèi)部?jī)?nèi)給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是玻璃體內(nèi)注射。本發(fā)明還涉及用于治療有需要的個(gè)體中眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的方法，該方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的、包含如上所述的GS-101或如上所述的其功能保守序列的、與藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合的組合物，所述組合物通過(guò)眼內(nèi)途徑施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述眼內(nèi)途徑是眼睛內(nèi)部?jī)?nèi)給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是玻璃體內(nèi)注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥選自葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變和影響視網(wǎng)膜的全身性病變。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，如上所述的GS-101或其功能保守序列以約0.01mg/ml至約100mg/ml,優(yōu)選0.lmg/ml至80mg/ml,更優(yōu)選6至60mg/ml,甚至更優(yōu)選約8至約12mg/ml的濃度存在于本發(fā)明的組合物中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，每次給藥所述注射的組合物的體積范圍在I至500 μ 1，優(yōu)選在約5至400 μ 1，更優(yōu)選在5至300 μ I。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述注射的組合物的體積為約 50 μ I。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，每次給藥注射的GS-101的量范圍在10至5000 μ g，優(yōu)選在約50至4000 μ g，更優(yōu)選在50至3000 μ g。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，注射的GS-101的量為約500 μ g0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物是這樣的，使得所述眼內(nèi)給藥是玻璃體內(nèi)給藥。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述組合物注射至多每三周一次，優(yōu)選至多每四周一次，甚至更優(yōu)選每八周一次。如實(shí)施例中所證明的，本發(fā)明的組合物以至多每三周注射一次獲得最佳的治療。該結(jié)果是令人驚奇的，因?yàn)楫?dāng)內(nèi)皮細(xì)胞體外用GS-101溫育時(shí)，效果在溫育后24小時(shí)是最大的且僅是暫時(shí)的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述患者在二至五個(gè)月，優(yōu)選三個(gè)月期間每三周注射一次，優(yōu)選每四周注射一次治療。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，治療期間是三至六個(gè)月。如果在患者中觀察到視敏度損失，則可以重新進(jìn)行所述治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述的藥物組合物以單位劑量的形式包裝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單位劑量是一次性注射器。優(yōu)選地，所述單位劑量是無(wú)菌的。定義根據(jù)本發(fā)明，下列術(shù)語(yǔ)具有以下含義:“約”指所限定的數(shù)值、參數(shù)或特征加上或減去10%?！把劬?nèi)部”指位于眼球內(nèi)的任何部位，包括眼睛的前和后段，其通常包括但并不限于眼球內(nèi)存在的任何功能性(例如視覺(jué))或結(jié)構(gòu)性組織，或者部分或完全地襯于眼球內(nèi)部的組織或細(xì)胞層。部位的具體實(shí)例包括前房、后房、玻璃體腔、脈絡(luò)膜、黃斑和視網(wǎng)膜以及使后眼部區(qū)域或位點(diǎn)血管形成或受神經(jīng)支配的血管和神經(jīng)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，眼睛內(nèi)部指眼后段，包括后房、玻璃體腔、脈絡(luò)膜、黃斑和視網(wǎng)膜以及使后眼部區(qū)域或位點(diǎn)血管形成或受神經(jīng)支配的血管和神經(jīng)。優(yōu)選地，表述“眼睛內(nèi)部的疾病”指視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜和/或黃斑和/或后房的疾病?！芭c病理性新生血管形成相關(guān)的病癥”或“病理性新生血管形成相關(guān)病癥”是其中存在不期望的新生血管形成的疾病，包括以下疾病:葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變，可能與用于治療該相同病變的其他療法組合。特別地，本發(fā)明的目的是解決血液和淋巴新生血管形成?！爸委熂膊　敝阜乐?即阻止 發(fā)生)、降低或減輕與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病、紊亂或病癥中的至少一種不良效應(yīng)或癥狀。
“治療有效量”指旨在以下而對(duì)目標(biāo)不引起顯著的負(fù)性或不良作用的藥劑的水平或量:(1)延遲或預(yù)防與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的發(fā)生；(2)減慢或停止與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)展、加重或惡化；(3)使得與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的癥狀改善；(4)降低與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的嚴(yán)重程度或發(fā)生率；(5)治愈與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥。治療有效量可以在與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥發(fā)生之前施用用于預(yù)防或防止作用?？商娲鼗蝾~外地，所述治療有效量可以在與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥發(fā)生之后施用用于治療作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目標(biāo)是眼睛內(nèi)部，在該實(shí)施方案中，GS-101的治療有效量是有效減輕眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的至少一種癥狀的量。“眼內(nèi)”指眼內(nèi)給藥途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，眼內(nèi)給藥途徑是眼睛內(nèi)部?jī)?nèi)的給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)。優(yōu)選眼內(nèi)途徑是玻璃體內(nèi)注射。根據(jù)本發(fā)明，眼內(nèi)途徑是特別令人感興趣的，因?yàn)槠涫沟檬褂孟喈?dāng)?shù)秃椭委煖?zhǔn)確劑量的活性成分(即GS-101或其功能保守序列)并獲得最佳的治療。事實(shí)上，如實(shí)施例所證明，本發(fā)明的組合物以最多每三周注射一次獲得最佳治療。該結(jié)果是令人驚奇的，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞用GS-101溫育時(shí)，效果在溫育24小時(shí)后是最大的且僅是暫時(shí)的?！皞€(gè)體”指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，但也可以指動(dòng)物，例如寵物。


圖1是顯示OIR之后GS-101或其載體(NaCl)的兩個(gè)眼內(nèi)注射對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的影響的直方圖。結(jié)果是均值土SEM。與載體相比P〈0.01 ；$:與錯(cuò)義(Scramble)相比P〈0.05。(錯(cuò)義是與GS-101具有相同堿基但不具有相同序列的寡核苷酸，從其設(shè)計(jì)術(shù)語(yǔ)“錯(cuò)義”)。圖2是顯示激光治療后第22/23日玻璃體內(nèi)注射GS-101對(duì)病變晚期熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響的直方圖。豎線指 示SEM。圖3是顯示用單劑量GS-101 (10 μ M)或錯(cuò)義寡核苷酸(10 μ Μ)在IRS-1隨時(shí)間表達(dá)上對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的治療效果的直方圖。IRS-1蛋白通過(guò)ELISA進(jìn)行定量。結(jié)果以對(duì)照(用載體溫育的細(xì)胞)的％表示，其代表三次實(shí)驗(yàn)的平均值。豎線指示SEM。ns=未顯示。實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)方法程序和實(shí)驗(yàn)方案由我們的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)我們的機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針以及法國(guó)和加拿大的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)進(jìn)行。動(dòng)物保持在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可自由接近食物和水(24°C ; 12:12小時(shí)光照/黑暗周期)。大鼠中氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變?nèi)缰八?，使用氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(OIR)大鼠模型(Dorfman A, Dembinska0，Chemtob S，Lachapelle P.Early manifestations of postnatal hyperoxia on theretinal structure and function of the neonatal rat.1nvest Ophthalmol VisSci2008; 49:458-466)。將新生 SD 大鼠幼嵐(Charles River Laboratories, St-Constant,魁北克，加拿大)出生后立即暴露于80%氧氣(醫(yī)用級(jí)100%02和用氧儀表測(cè)量的室內(nèi)空氣的混合物；MaxO2Ceramatec, 0M25-ME型號(hào)，Medicana Inc.,蒙特利爾,魁北克,加拿大)。簡(jiǎn)而言之，從出生到出生后第14日每日持續(xù)22.5小時(shí)暴露于高氧(80%02)，用常氧條件下(21%02) 30分鐘持續(xù)時(shí)間的三次間隔中斷。高氧暴露后，將動(dòng)物在P14下分配至以下實(shí)驗(yàn)，并將動(dòng)物在P14和P16下通過(guò)在一只眼內(nèi)玻璃體內(nèi)注射僅I μ I載體(無(wú)菌NaCl0.9%) (η=8)或含有錯(cuò)義GS-101寡核苷酸(2mg/ml,遞送2 μ g, n=4)或濃度為0.5mg/ml (遞送0.5 μ g,n=7)、l(遞送lμg，n=8)和2(遞送2μg，n=8)的GS-101(SEQ ID N0:2)的載體進(jìn)行治療。在注射前，將大鼠用氟烷( 2.5%)麻醉，用連接于約60規(guī)格的玻璃毛細(xì)管的10μ IHamilton注射器注射。在治療期間，將大鼠保持在周期光照環(huán)境(801ux; 12小時(shí)黑暗/12小時(shí)光照)下。最后，將幼崽的母親每24小時(shí)在常氧和高氧條件下交替，使得可能避免已知在成年大鼠在高氧環(huán)境下引起的肺部并發(fā)癥。然后將所有動(dòng)物在P18下安樂(lè)處死:摘除眼睛，切開(kāi)前段，眼杯(eyecup)在4%福爾馬林中固定過(guò)夜。上面詳述的劑量基于估計(jì)的眼睛體積(出生后第三周 25 μ I vs.成人 50 μ L)。新生大鼠中發(fā)育的視網(wǎng)膜血管形成在氟烷麻醉下，在Pl和Ρ3下將I μ I僅載體(無(wú)菌NaCl0.9%) (η=6)或含有濃度為0.5mg/ml的GS-101載體(遞送0.5 μ g，n=8)注射入一只眼睛中。大鼠幼崽眼睛體積是成人的約0.3%。 視網(wǎng)膜鋪片(flatmount)隨后分離視網(wǎng)膜，并制備鋪片用于腺苷二磷酸酶(ADPase)染色。固定標(biāo)本并拍照(40x, Axiophot 顯微鏡，Carl Zeiss Meditec, GmbH, Oberkochen,德國(guó))。對(duì)于發(fā)育方案，已經(jīng)使用 ImagePro Plus4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜血管形成面積和強(qiáng)度。對(duì)于OIR方案，使用評(píng)價(jià)以下標(biāo)準(zhǔn)的視網(wǎng)膜評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度:血管生長(zhǎng)、血管叢、額外的視網(wǎng)膜新生血管形成、中央血管收縮、視網(wǎng)膜出血和血管迂曲。此外，已經(jīng)在視網(wǎng)膜鋪片上評(píng)價(jià)了血管叢本身。統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)ANOVA使用 Dunnett posttest (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P <0.05認(rèn)為是顯著的。為確定在后房中抑制OIR大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成所需要的GS-101的有效濃度，將GS-101注射入眼睛中。如圖1所示，0.5yg劑量降低病理性新生血管形成?？紤]眼睛的體積(25 μ I)，這表明需要20 μ g/ml的濃度降低OIR大鼠模型中的視網(wǎng)膜新生血管形成。結(jié)果表I眼內(nèi)注射GS-101對(duì)新生大鼠發(fā)育期間視網(wǎng)膜中正常血管形成及其強(qiáng)度的影響。
權(quán)利要求
1.用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ 或具有包含9至30個(gè)核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95% 或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，以及所述組合物通過(guò)在眼后段內(nèi)施用被施用給需要其的個(gè)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述SEQ ID NO:1的功能保守序列是5’-TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述SEQ ID NO:1的功能保守序列選自以下組成的組:5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3) 5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3’ (SEQ ID NO:4)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCAT-3’ (SEQ ID NO:8)5’ -CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5’ -TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:10)5’ -CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:11)5’ -CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:12)5， -GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:13)5， -GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:14)5’ -AGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:15)5， -GGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:16)5， -GCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:17)5， -CTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:18)5， -TCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:19)5’ -CGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:20)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述寡核苷酸的濃度為約0.01mg/ml至約IOOmg/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中每次施用所注射的組合物的體積的范圍為I至500 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述在眼后段內(nèi)施用是玻璃體內(nèi)注射。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物注射至多每周一次，優(yōu)選每?jī)芍芤淮?，更?yōu)選每三周一次，甚至更優(yōu)選一個(gè)月一次，還更優(yōu)選每?jī)蓚€(gè)月一次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物以單位劑量的形式包裝。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物是無(wú)菌的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述單位劑量是一次性注射器。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述病理性新生血管形成相關(guān)病癥可以是葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’或具有包含9至30個(gè)核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與SEQ ID NO:1相比具有75%、80%、85%、90%、95%或大于95%、96%、97%、98%、99%的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，和通過(guò)在眼后段內(nèi)給藥將所述組合物給予需要其的個(gè)體；本發(fā)明還涉及用于治療需要其的個(gè)體中眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的方法，該方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的所述藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P9/00GK103180444SQ201180048959
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者S·阿爾-瑪穆德, S·科蘭, J-P·柯都佐爾蓋茲, E·維奧德 申請(qǐng)人:基因信號(hào)國(guó)際公司