專(zhuān)利名稱(chēng)：一種螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題， 2010年WHO把變態(tài)反應(yīng)性疾病列為世界上第四大類(lèi)最主要的慢性疾病。世界各國(guó)變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率約為10 20%，包括過(guò)敏性哮喘，是臨床常見(jiàn)病，多發(fā)病。當(dāng)前，變態(tài)反應(yīng)疾病日趨嚴(yán)重，引起過(guò)敏的主要變應(yīng)原有塵螨、花粉、屋塵、霉菌、羽毛等，而塵螨是世界性分布最強(qiáng)烈的變應(yīng)原之一。哮喘是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的疾患之一，哮喘患者約占人口總數(shù)的2_10%。全世界塵螨過(guò)敏的患者約有5000萬(wàn)，由塵螨過(guò)敏誘發(fā)的哮喘占哮喘的比例為10-30%。在塵螨過(guò)敏患者中，45-80%患者患有哮喘，塵螨過(guò)敏是誘發(fā)哮喘的一個(gè)主要因素。能引起人類(lèi)變態(tài)反應(yīng)疾病的塵螨主要有3種，即塵螨亞科中的塵螨屬(Dermatophagoides)的兩種戶(hù)塵螨 (D. pteronyssinus)和粉塵螨(D. farinae)，以及蚍螨亞科中一種歐塵螨屬(Euroglyphus) 的埋內(nèi)歐塵螨，三種塵螨在抗原性強(qiáng)度方面比較，粉塵螨和戶(hù)塵螨比埋內(nèi)歐塵螨強(qiáng)得多。變應(yīng)性鼻炎同樣是一個(gè)全球性健康問(wèn)題，它在世界各地均常見(jiàn)，其全球發(fā)病率 10% _25%，并且患者數(shù)仍有上升趨勢(shì)。過(guò)敏性鼻炎嚴(yán)重影響了患者的日常生活、學(xué)習(xí)以及工作效率，增加了醫(yī)療的負(fù)荷。國(guó)內(nèi)外研究顯示，塵螨是變應(yīng)性鼻炎最主要的變應(yīng)原。目前，過(guò)敏性哮喘和過(guò)敏性鼻炎的治療一般分為兩種對(duì)癥治療和特異性免疫治療。對(duì)癥治療一般采用化學(xué)藥物，如抗組胺藥物和糖皮質(zhì)激素，化學(xué)藥物治療隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)伴隨一系列不良反應(yīng)和副作用。如，化學(xué)藥物的耐藥性和糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的輕度抑制。過(guò)敏性疾病的特異性免疫治療自1911年noon和freeman 用花粉提取液治療枯草熱以來(lái)，已經(jīng)廣泛用于治療過(guò)敏性疾病，并且取的飛躍的發(fā)展。變應(yīng)原疫苗經(jīng)歷了粗浸液、純化變應(yīng)原疫苗、標(biāo)準(zhǔn)化變應(yīng)原疫苗、類(lèi)變應(yīng)原疫苗的發(fā)展過(guò)程，在劑型上從皮下注射到舌下滴劑到舌下片劑的發(fā)展歷程。在皮下注射給藥和舌下含服給藥兩種給藥方式中，各有優(yōu)缺點(diǎn)。舌下給藥免疫治療病人更容易接受，依從好，但皮下注射給藥相比舌下給藥免疫治療療效快，治療周期短，對(duì)于一些重癥過(guò)敏患者，皮下注射給藥治療周期短，療效更快。在目前上市的注射用螨變應(yīng)原疫苗中，美國(guó)市場(chǎng)上常見(jiàn)的主要是甘油制劑，在歐洲變應(yīng)原疫苗生產(chǎn)企業(yè)制備的主要是含有氫氧化鋁佐劑的螨變應(yīng)原疫苗。甘油制劑螨變應(yīng)原疫苗由于含有50%的甘油，所以每次給藥最大體積不能超過(guò)0. anl，限制了其使用的方便性；再者相比凍干疫苗的形式，它的穩(wěn)定性不如凍干更穩(wěn)定，使用時(shí)，由于含有50%甘油，會(huì)增加患者的疼痛。含有氫氧化鋁佐劑的變應(yīng)原疫苗，雖然鋁鹽具有極佳的安全性和佐劑活性的追蹤記錄，但是在應(yīng)用鋁鹽時(shí)仍然存在一定的問(wèn)題。這些問(wèn)題包括局部反應(yīng)如紅斑、接觸性過(guò)敏、皮下小結(jié)、以及肉芽腫性炎癥、在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)中特定的和總的IgE抗體反應(yīng)增加(在某些病原情況下如過(guò)敏反應(yīng)中出現(xiàn)不希望出現(xiàn)的抗體類(lèi)型)。此外，已經(jīng)報(bào)道了鋁鹽作為佐劑時(shí)對(duì)某些抗原無(wú)效。也有一些研究報(bào)道，鋁鹽能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)性的變性病癥。雖然仍沒(méi)有關(guān)于包括鋁的疫苗與人類(lèi)的神經(jīng)變性病癥如阿爾茨海默氏疾病的發(fā)展有關(guān)臨床證據(jù)，但是已經(jīng)推定他們之間有聯(lián)系并且由此引發(fā)了廣泛的爭(zhēng)論。在過(guò)敏性疾病的治療過(guò)程中，不同于預(yù)防用疫苗，需要反復(fù)給藥，治療周期長(zhǎng)達(dá)三年之久，在人體內(nèi)累積的鋁含量是不可忽視的問(wèn)題。就穩(wěn)定性而言，含有氫氧化鋁佐劑的螨變應(yīng)原疫苗不如凍干后的變應(yīng)原疫苗更加穩(wěn)定。凍干技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品和生物制品行業(yè)中，在藥典三部記載的藥品中，除了含有氫氧化鋁佐劑的疫苗不是采用凍干的形式，其它藥品都有凍干劑型上市。已證明藥物凍干劑型不僅穩(wěn)定性好，而且安全性高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有螨變應(yīng)原疫苗的不足，提供一種新型的螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種螨變應(yīng)原凍干疫苗，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護(hù)劑和PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 100-1000 70-140的重量比混合后凍干制成；其中，所述凍干保護(hù)劑為甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、 乳糖或海藻糖中的一種或多種。優(yōu)選地，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、甘露醇和PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按 1 200 70的重量比混合后凍干制成。 優(yōu)選使用pH8. 0的磷酸鹽緩沖液。所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自粉塵螨(Dermatophagoides farinae)變應(yīng)原和/或戶(hù)塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)變應(yīng)原。優(yōu)選所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。更優(yōu)選所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。本發(fā)明還提供上述螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備方法，包括塵螨在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)傳代、螨體的分離純化、活性蛋白的提取、活性蛋白的純化以及凍干的步驟，其中，采用甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種作為凍干保護(hù)劑。前述的方法，包括以下步驟1)在培養(yǎng)基中接種塵螨，培養(yǎng)傳代，收獲塵螨培養(yǎng)物，用95 %乙醇滅活30min，靜置后分層，棄去上清，所得固體物經(jīng)自然干燥后，分離純化螨體；2)向純化后的螨體中加入95%乙醇進(jìn)行脫脂，直至上清液無(wú)色，靜置后分層，棄去上清，干燥所得固體物至無(wú)乙醇?xì)馕叮?)向干燥后的固體物中加入pH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液，攪拌后離心，得上清；過(guò)濾上清液，用截留分子量IkD IOkD的膜，以磷酸鹽緩沖液衡濾，直至濾出液無(wú)色；濾出液經(jīng)超濾濃縮后得螨變應(yīng)原活性蛋白原液；4)向上述原液中加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌后，凍干即得。前述方法中凍干條件為以每分鐘2. 5 3. 5°C /min的速度將溫度降至-45°C，保持7 8h ；然后以每分鐘0. 3 0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時(shí)維持真空度為OPa ；再以0. 50C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min。前述方法中，所述塵螨為粉塵螨變應(yīng)原和/或戶(hù)塵螨變應(yīng)原。優(yōu)選為粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。更優(yōu)選為等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。1、原液制備1)戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液的制備從工作種子庫(kù)取出一瓶戶(hù)塵螨工作種子，在25°C，相對(duì)濕度75% 士5%條件下放置15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長(zhǎng)狀況和活動(dòng)度，螨生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基沒(méi)有真菌污染，將工作種子按1 60-1 12(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基O份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，2份酵母粉，1份豬肉粉)，于25°C、相對(duì)濕度75%條件下培養(yǎng)。戶(hù)塵螨培養(yǎng)約2-4個(gè)月后，解剖鏡下觀察生長(zhǎng)增殖情況良好時(shí)，精確稱(chēng)量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計(jì)數(shù)法計(jì)算蟲(chóng)體密度。當(dāng)蟲(chóng)體密度達(dá)到約30-50只螨/mg培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)即可收獲培養(yǎng)物。將戶(hù)塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層， 小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為戶(hù)塵螨收獲物。以振動(dòng)過(guò)篩的方法純化螨體，重復(fù)幾次，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖;3min后靜置lOmin，重復(fù)3次， 直到上清液無(wú)色為止。棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開(kāi)干燥至少4 至無(wú)乙醇?xì)馕?，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊。稱(chēng)取脫脂的戶(hù)塵螨螨體原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，離心分離去除殘?jiān)?，濾液經(jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級(jí)過(guò)濾澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以 pH8. 050mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液為無(wú)色，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌后得戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。2)粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液的制備從工作種子庫(kù)取出一瓶粉塵螨工作種子，在25°C，相對(duì)濕度65% 士5%條件下放置15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長(zhǎng)狀況和活動(dòng)度，螨生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基沒(méi)有真菌污染，將工作種子按1 60-1 12(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基(小麥胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相對(duì)濕度65% 士5%條件下培養(yǎng)。粉塵螨培養(yǎng)約2-4 個(gè)月后，解剖鏡下觀察生長(zhǎng)增殖情況良好時(shí)，精確稱(chēng)量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計(jì)數(shù)法計(jì)算蟲(chóng)體密度。當(dāng)蟲(chóng)體密度達(dá)到約30-50只螨/mg培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)即可收獲培養(yǎng)物。將粉塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為粉塵螨收獲物。以振動(dòng)過(guò)篩的方法純化螨體，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。 在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直至上清液無(wú)色為止。棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開(kāi)干燥至少4 至無(wú)乙醇?xì)馕?，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊。稱(chēng)取脫脂的粉塵螨螨體原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，離心分離去除殘?jiān)瑸V液經(jīng)8 μ m、 0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級(jí)過(guò)濾澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以pH8. 050mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液為無(wú)色，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌后等粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。2、半成品的稀配和分裝凍干1)和2~)的原液經(jīng)檢驗(yàn)，活性不小于40000AU，無(wú)菌生長(zhǎng)，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液的配制方法按比例稱(chēng)取適量的甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當(dāng)溫度降至30°C時(shí)，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過(guò)濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇水溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8μπι膜過(guò)濾，除去活性炭，0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌。稀配后的螨變應(yīng)原原液經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶lml。半壓塞放入凍干機(jī)腔體內(nèi)，以每分鐘2. 5 3. 5°C /min的速度將溫度降至_45°C，保持7 他； 然后以每分鐘0. 3 0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持腔內(nèi)真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時(shí)維持真空度為 OPa ；再以0. 50C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時(shí)維持真空度OPa，即得螨變應(yīng)原凍干疫苗。本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗與現(xiàn)已上市的螨變應(yīng)原疫苗的水制劑、甘油制劑、氫氧化鋁佐劑制劑相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(一)本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)變應(yīng)原疫苗甘油制劑使用的不方便性和水制劑的不穩(wěn)定性，例如，甘油制劑給病人帶來(lái)的疼痛和使用劑量的限制，而且克服了含有氫氧化鋁佐劑制劑因體內(nèi)鋁累積所帶來(lái)的危害及副作用，為塵螨過(guò)敏患者提供一種高效、穩(wěn)定性好、安全性好的疫苗制品。( 二)本發(fā)明突破變應(yīng)原行業(yè)產(chǎn)品的傳統(tǒng)，采用單劑量裝量，提高了變應(yīng)原疫苗使用的安全性和有效性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1戶(hù)塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備從工作種子庫(kù)取出一瓶戶(hù)塵螨工作種子，在25 °C，相對(duì)濕度75%條件下放置25天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長(zhǎng)狀況和活動(dòng)度，螨生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基沒(méi)有真菌污染，將工作種子按1 30(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基O份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，2份酵母粉，1份豬肉粉)，于25°C、相對(duì)濕度75%條件下培養(yǎng)。戶(hù)塵螨培養(yǎng)約3個(gè)月后，解剖鏡下觀察生長(zhǎng)增殖情況良好時(shí)，精確稱(chēng)量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計(jì)數(shù)法計(jì)算蟲(chóng)體密度。 當(dāng)蟲(chóng)體密度達(dá)到約50只螨/mg培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)即可收獲培養(yǎng)物。將戶(hù)塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為戶(hù)塵螨收獲物。以振動(dòng)過(guò)篩的方法純化螨體，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95% 乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直到上清液無(wú)色為止，棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開(kāi)干燥至少4 至無(wú)乙醇?xì)馕?，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊。稱(chēng)取脫脂的戶(hù)塵螨螨體原料，以1 50的投料比例置于50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，5000rpm，4°C離心15min，取上清去殘?jiān)?。上清?jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級(jí)過(guò)濾澄清。用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液無(wú)色為止，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌得戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。原液經(jīng)檢驗(yàn)，活性不小于40000AU，無(wú)菌生長(zhǎng)，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液)的配制按比例稱(chēng)取適量甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當(dāng)溫度降至30°C時(shí)，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過(guò)濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8 μ m膜過(guò)濾，除去活性炭，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌。稀配后的戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶1ml。半壓塞放入凍干機(jī)腔體內(nèi)，以每分鐘2. 5 3. 50C /min的速度將溫度降至_45°C，保持他；然后以每分鐘0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30h，維持腔內(nèi)真空度151 ；再以2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時(shí)維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時(shí)維持真空度OPa，即得戶(hù)塵螨變應(yīng)原凍干疫苗。對(duì)所得凍干疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表1所示表1戶(hù)塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的檢驗(yàn)
檢驗(yàn)項(xiàng)目
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定
檢驗(yàn)結(jié)果
性狀
水分活性 Derpl Derp2
無(wú)菌
無(wú)色疏松體，溶解后無(wú)色或
淡黃色澄明液體
<3%
10000AU-40000AU/ml
不得檢出有菌生長(zhǎng)
符合規(guī)定 1.7%
25000AU
9.8pg/ml
10.2pg/ml
符合規(guī)定注Derpl為戶(hù)塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白1 ；Derp2為戶(hù)塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白 2。實(shí)施例2粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備從工作種子庫(kù)取出一瓶粉塵螨工作種子，在25 °C，相對(duì)濕度65%條件下放置 15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長(zhǎng)狀況和活動(dòng)度，螨生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基沒(méi)有真菌污染，將工作種子按1 30 (螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基(小麥胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相對(duì)濕度65%條件下培養(yǎng)。粉塵螨培養(yǎng)約3個(gè)月后，解剖鏡下觀察生長(zhǎng)增殖情況良好時(shí)，精確稱(chēng)量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計(jì)數(shù)法計(jì)算蟲(chóng)體密度。當(dāng)蟲(chóng)體密度達(dá)到約50只螨/mg培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)即可收獲培養(yǎng)物。將粉塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為粉塵螨塵螨收獲物。以振動(dòng)過(guò)篩的方式純化螨體，反復(fù)純化幾次，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直到上清液無(wú)色為止，棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開(kāi)干燥至少4 至無(wú)乙醇?xì)馕?，干燥過(guò)程中注意壓散結(jié)塊。稱(chēng)取脫脂的粉塵螨螨體原料，以1 50的投料比例置于50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中 4°C攪拌提取Mh，5000rpm, 4°C離心15min，取上清去殘?jiān)?。上清?jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m 膜逐級(jí)過(guò)濾澄清。用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉衡濾， 到濾出液無(wú)色為時(shí)，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌得粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。原液經(jīng)檢，活性不小于40000AU，無(wú)菌生長(zhǎng)，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液)的配制按比例稱(chēng)取適量甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當(dāng)溫度降至30°C時(shí)，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過(guò)濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8 μ m膜過(guò)濾，除去活性炭，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌。稀配后的粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液0.22 μ m過(guò)濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶 Iml0半壓塞放入凍干機(jī)腔體內(nèi)，以每分鐘3°C /min的速度將溫度降至_45°C，保持他；然后以每分鐘0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30h，維持腔內(nèi)真空度10 151 ；再以2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時(shí)維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時(shí)維持真空度OPa，即得粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗。對(duì)所得凍干疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示表2粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的檢驗(yàn)
檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢驗(yàn)結(jié)果性狀無(wú)色疏松體，溶解后無(wú)色或符合規(guī)定淡黃色澄明液體水分<3%1.6%活性10000AU-40000AU/ml23 OOOAUDerfl10.8pg/mlDer￡292\xglm\無(wú)菌不得檢出有菌生長(zhǎng)符合規(guī)定注Derfl為粉塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白1 ；Derf2為粉塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白 2。實(shí)施例3戶(hù)塵螨和粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液和粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液按實(shí)施例1和實(shí)施例2 制備，原液檢驗(yàn)合格后，用甘露醇溶液稀釋至20000AU，甘露醇終濃度為2%。將稀釋后的戶(hù)塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液和粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液以1 1混合(體積比)，過(guò)濾除菌分裝到西林瓶中，每瓶1ml。半壓塞放入凍干機(jī)前箱內(nèi)，按實(shí)施例1和實(shí)施例2的凍干工藝凍干，即得塵螨變應(yīng)原合劑凍干疫苗。。對(duì)所得凍干疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示 表3塵螨變應(yīng)原合劑凍干疫苗的檢驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種螨變應(yīng)原凍干疫苗，其特征在于，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護(hù)劑和 PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 100-1000 70-140的重量比混合后凍干制成；其中，所述凍干保護(hù)劑為甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干疫苗，其特征在于，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、甘露醇和 pH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 200 70的重量比混合后凍干制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凍干疫苗，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的PH值為8. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自粉塵鋼(Dermatophagoides farinae)變應(yīng)原禾口 / 或戶(hù)塵鋼(Dermatophagoides pteronyssinus)變應(yīng)原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來(lái)自等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。
7.制備權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述凍干疫苗的方法，包括塵螨在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)傳代、 螨體的分離純化、活性蛋白的提取、活性蛋白的純化以及凍干的步驟，其特征在于，采用甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種作為凍干保護(hù)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)在培養(yǎng)基中接種塵螨，培養(yǎng)傳代，收獲塵螨培養(yǎng)物，用95%乙醇滅活30min，靜置后分層，棄去上清，所得固體物經(jīng)自然干燥后，分離純化螨體；2)向純化后的螨體中加入95%乙醇進(jìn)行脫脂，直至上清液無(wú)色，靜置后分層，棄去上清，干燥所得固體物至無(wú)乙醇?xì)馕叮?)向干燥后的固體物中加入pH7.0-8. 5的磷酸鹽緩沖液，攪拌后離心，得上清；過(guò)濾上清液，用截留分子量IkD IOkD的膜，以磷酸鹽緩沖液衡濾，直至濾出液無(wú)色；濾出液經(jīng)超濾濃縮后得螨變應(yīng)原活性蛋白原液；4)向上述原液中加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾除菌后，凍干即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，凍干條件為以每分鐘2.5 3.5°C/ min的速度將溫度降至-45 °C，保持7 8h ；然后以每分鐘0. 3 0. 4°C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持真空度10 151 ；再以1. 5 2°C /min速度將溫度升至 25°C，保持50min，同時(shí)維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持 60mino
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述塵螨為等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶(hù)塵螨變應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法，所述疫苗是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護(hù)劑和pH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖液按1∶100-1000∶70-140的重量比混合后凍干制成。本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗與傳統(tǒng)的螨變應(yīng)原疫苗的水制劑、甘油制劑、氫氧化鋁佐劑制劑相比，克服了變應(yīng)原疫苗甘油制劑使用的不方便性和水制劑的不穩(wěn)定性以及含有氫氧化鋁佐劑制劑所帶來(lái)的副作用，為塵螨過(guò)敏患者提供一種高效、穩(wěn)定性好、安全性好的疫苗制品。
文檔編號(hào)A61K39/35GK102258780SQ201110199519
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者喬秉善, 姜敏, 湯承祁, 牛占坡, 白彩明, 裴瀟竹 申請(qǐng)人:北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司