專利名稱：一種胰島素的脂質(zhì)復(fù)合物及其制備方法和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰島素脂質(zhì)復(fù)合物及其制備方法，還涉及包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的油溶液及其在制備緩釋注射劑和非注射給藥途徑制劑中的用途，又涉及包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的新型囊泡(脂質(zhì)體)及其在制備非注射給藥途徑制劑中的用途，屬醫(yī)藥制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1、脂質(zhì)復(fù)合物研究進(jìn)展及背景介紹
1. 1復(fù)合物的構(gòu)造特點(diǎn)及形成機(jī)制
磷脂復(fù)合物是由意大利學(xué)者Bombardelli在研究脂質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，早期磷脂復(fù)合物研究涉及的藥物大多是含有酚羥基的黃酮或多酚類成分，后期更多的研究證實(shí)，除酚羥基外，一些醇羥基、酰胺基或羰基等極性基團(tuán)均有可能與磷脂或其他脂質(zhì)材料(如膽固醇、 膽酸鈉等)的親水端通過分子間氫鍵或范德華力等相互作用形成復(fù)合物球狀體。不論是親水性藥物還是親脂性藥物，只要含有能復(fù)合的極性基團(tuán)，都可形成脂質(zhì)復(fù)合物。脂質(zhì)復(fù)合物的形成，可顯著提高藥物親脂性和油溶性。
磷脂復(fù)合物的組成、結(jié)構(gòu)與同樣由磷脂構(gòu)成的囊泡(又稱脂質(zhì)體)在構(gòu)造上明顯不同。脂質(zhì)體是磷脂分子的親水端向外、疏水端向內(nèi)形成的雙分子膜圍成的囊泡結(jié)構(gòu)。而磷脂復(fù)合物則是活性成分的極性基團(tuán)與磷脂的親水端部位通過分子間相互作用而被固定，將磷脂的親水部位包裹，而疏水端不參與復(fù)合反應(yīng)，可自由移動(dòng)，形成一個(gè)親脂性的球狀體。
一個(gè)脂質(zhì)體囊泡可能有成百甚至上千個(gè)磷脂分子包圍而成，雙分子膜的外層和內(nèi)層均為磷脂的親水端，而中間夾層則為疏水端。對(duì)于親脂性藥物，可被包封于雙分子膜的夾層中(圖中藍(lán)色方塊)，包封率通常較高且穩(wěn)定，不易泄漏；而親水性藥物只能分散在雙分子膜圍成的囊泡內(nèi)核或外圍，由于藥物進(jìn)入內(nèi)核比較困難，實(shí)際上親水性藥物大多數(shù)分布在外圍，穩(wěn)定性較差且易發(fā)生泄漏。在粘膜透過性方面，親脂性藥物的脂質(zhì)體往往明顯優(yōu)于親水性藥物的脂質(zhì)體。
因此，對(duì)于親水性藥物，如先制備脂質(zhì)復(fù)合物提高親脂性，再制備囊泡，可提高包封率和穩(wěn)定性，改善粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性。
2、胰島素脂質(zhì)復(fù)合物研究背景及現(xiàn)有技術(shù)的缺陷
2. 1胰島素脂質(zhì)復(fù)合物研究背景
胰島素易受胃酸及消化道各種蛋白水解酶的破壞，且因分子量大難以穿透胃腸粘膜屏障，常規(guī)口服制劑無效，皮下注射仍是目前最主要的給藥途徑，長期頻繁的注射患者順應(yīng)性差。在過去的幾十年中，國內(nèi)外醫(yī)藥工作者為克服頻繁注射的順應(yīng)性問題，開展了大量研究，一方面是通過結(jié)構(gòu)修飾，制備中效和長效胰島素，延長了藥效維持時(shí)間，減少注射次數(shù)，另一方面是通過藥劑學(xué)技術(shù)方法，制備脂質(zhì)體、納米粒、微球、微乳或油溶液，提高藥物對(duì)抗酸堿及生物酶的穩(wěn)定性、促進(jìn)藥物經(jīng)上皮粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收，為口服、經(jīng)皮、粘膜、肺部吸入等非注射給藥制劑的發(fā)展提供釋藥載體。
由于胰島素親脂性差，限制了微粒載體的制備與發(fā)展。胰島素脂質(zhì)體是國內(nèi)外報(bào)道最多的微粒載體，但由于胰島素分子量大，親水性強(qiáng)，藥物大多存在于磷脂雙分子膜的外圍，包封率低，易發(fā)生泄漏，對(duì)胃腸穩(wěn)定性及粘膜透過性的改善程度有限；而納米粒、微球的制備大多是在有機(jī)溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行的，而胰島素難溶于有機(jī)溶劑，包封率極低，且僅吸附于微粒表面，給藥后藥物易發(fā)生突釋，穩(wěn)定化效果同樣較差；現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的微乳或自微乳，均將胰島素溶于水相，無法避免藥物與胃酸及生物酶的接觸，不利于提高胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性。
胰島素分子中含有大量的酰氨基、酚羥基、羥基、羰基等極性基團(tuán)，均有可能與脂質(zhì)材料的親水端發(fā)生分子間相互作用形成脂質(zhì)復(fù)合物，從而改善其親脂性，突破微粒載體制備的限制。近年來，關(guān)于胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的研究成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。但胰島素的親脂性較差，同樣限制了脂質(zhì)復(fù)合物的制備，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道和專利普遍存在復(fù)合率低、質(zhì)量不穩(wěn)定的缺陷。
2. 2現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺陷
胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成，分子量接近6千，介于多肽和蛋白質(zhì)之間。人胰島素 (Insulin Human) A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共沈種51個(gè)氨基酸組成。胰島素不溶于水及有機(jī)溶劑，但可溶于酸性稀醇、PH7. 4的磷酸鹽緩沖液、稀酸和稀堿中。
胰島素中含有大量的可能與脂質(zhì)材料親水端發(fā)生分子間相互作用的極性基團(tuán)，具備形成脂質(zhì)復(fù)合物的條件。但胰島素的蛋白質(zhì)類結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)特點(diǎn)，使得脂質(zhì)復(fù)合物的制備極其困難，最大的障礙就是復(fù)合溶劑的選擇。
有機(jī)溶劑尤其是非質(zhì)子傳遞溶劑有利于復(fù)合反應(yīng)，但胰島素在有機(jī)溶劑中不溶， 且有機(jī)溶劑有可能導(dǎo)致胰島素降解或構(gòu)象變化，因此，單純的有機(jī)溶劑無法制備胰島素復(fù)合物，至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。如果選用PH7. 4的磷酸鹽緩沖液，雖然胰島素具有一定的溶解度且質(zhì)量穩(wěn)定，但脂質(zhì)材料不能夠溶解成澄清透明的溶液，再加上水的極性太大，制得的復(fù)合物包封率極低，且分子間作用力極弱，質(zhì)量不穩(wěn)定。沃維漢[沃維漢，重組人胰島素復(fù)合物、 其制備方法及包含該復(fù)合物的藥物組合物，中國專利01140047，2004-10-06]采用磷酸鹽緩沖液為溶劑，將胰島素和磷脂分別溶于或混懸于水溶液中，混合均勻，冷凍干燥去除水分制備磷脂復(fù)合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷脂與藥物的質(zhì)量比為25 1(摩爾比約為185 1)時(shí)， 復(fù)合率僅21. 35%，150 1(摩爾比約為1110 1)時(shí)復(fù)合率為72.0%。
理論上分析，胰島素含53個(gè)酰氨基，4個(gè)酚羥基，12個(gè)醇羥基，這些基團(tuán)都有可能與磷脂復(fù)合，則1摩爾的藥物理論上需要約70摩爾的磷脂(重量比約為1 10)。通常，為確保藥物復(fù)合完全，脂質(zhì)材料的投料量應(yīng)略高于理論值，按理論量的1. 5倍計(jì)算，脂質(zhì)材料最大用量應(yīng)不超過藥物質(zhì)量的15倍，即磷脂用量應(yīng)控制在胰島素質(zhì)量的15倍以下比較經(jīng)濟(jì)合理。但01140047專利技術(shù)中，磷脂的質(zhì)量高達(dá)胰島素的150倍時(shí)，仍未能完全復(fù)合，提示以水為溶劑復(fù)合效率太低。
另一公開文件[R · R · C · New,包含中鏈單酸甘油酯的疏水性制劑，中國專利 97196069，1999-07-28]被稱為Macrosol技術(shù)，提供了一種含脂質(zhì)復(fù)合物的胰島素油溶液， 其脂質(zhì)復(fù)合物的制備方法也是將藥物與雙親性的脂質(zhì)材料共同溶于緩沖鹽的水相溶劑中， 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或凍干技術(shù)除去溶劑，再溶于油相中制得油溶液(或?qū)?fù)合溶液直接與油混合，再進(jìn)行冷凍干燥)。其確定的胰島素與磷脂的重量比為1 1至1 20，優(yōu)選1 2至 1 8，但未提供復(fù)合率評(píng)價(jià)結(jié)果。鑒于01140047專利以水為溶劑難以獲得高復(fù)合率的復(fù)合物，不難推測，97196069專利條件制備的復(fù)合物，大部分藥物可能并未與磷脂復(fù)合。
本專利發(fā)明人對(duì)97196069專利方法進(jìn)行了驗(yàn)證。首先根據(jù)胰島素復(fù)合物在環(huán)己烷中易溶、而游離胰島素不溶的特點(diǎn)，建立了復(fù)合率測定方法(HPLC方法定量)。根據(jù) 97196069專利方法制備胰島素磷脂復(fù)合物，當(dāng)胰島素/磷脂質(zhì)量比為1 2時(shí)，復(fù)合率低于8%;質(zhì)量比為1 8時(shí)，復(fù)合率未超過21% ；質(zhì)量比為1 12時(shí)，復(fù)合率未超過25%。 進(jìn)一步將胰島素/磷脂質(zhì)量比為1 8和1 12的復(fù)合物溶于中鏈油中，攪拌制備藥物濃度為1. 5mg/g的中鏈油溶液，室溫下放置1個(gè)月和冰箱)條件下放置3個(gè)月，均出現(xiàn)混濁現(xiàn)象。
雖然97196069專利確定的胰島素/磷脂質(zhì)量比例與理論值接近，但由于其制備方法中以水為復(fù)合溶劑，因此復(fù)合率極低，這與01140047專利技術(shù)結(jié)果相吻合。
綜合以上兩項(xiàng)專利，以水為溶劑制備胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，復(fù)合率低，存在明顯缺陷。
后續(xù)一些專利或報(bào)道，均在97196069基礎(chǔ)上對(duì)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，選用含有冰醋酸的乙醇、含有冰醋酸的DMS0、或含有稀鹽酸溶液的乙醚等為復(fù)合反應(yīng)的溶劑。與水溶液相比，有機(jī)溶劑的極性相對(duì)較小，而酸的加入是為了增加胰島素的溶解度，提高復(fù)合效率。 本專利發(fā)明人也進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，由于冰醋酸和鹽酸的酸性較強(qiáng)，且不易揮除干凈，制備過程中胰島素含量下降約5-10%，貯存過程中含量繼續(xù)下降至20%或更多。
綜上所述，關(guān)于胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的制備，現(xiàn)有的專利或文獻(xiàn)方法因溶劑系統(tǒng)選擇的缺陷導(dǎo)致復(fù)合效率低、藥物在制備過程中易發(fā)生降解、酸性成分或水分的殘留影響貯存過程中的質(zhì)量穩(wěn)定性。此外，對(duì)藥物/脂質(zhì)材料用量比例未經(jīng)科學(xué)優(yōu)化，最終獲得的復(fù)合物因復(fù)合率低而導(dǎo)致油中溶解度的改善程度有限，制成的油溶液載藥量低且貯存過程中易出現(xiàn)混濁等不穩(wěn)定現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，由胰島素和脂質(zhì)材料在含低沸點(diǎn)酸的有機(jī)溶劑系統(tǒng)中復(fù)合而成，復(fù)合物中，胰島素與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比為1 3 1 15;優(yōu)選地為1 4 1 12 ；更優(yōu)選地為1 5 1 10。。
本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，胰島素可選自天然胰島素、豬胰島素、牛胰島素、重組人胰島素及各類中、長效胰島素，優(yōu)選地為重組人胰島素；脂質(zhì)材料選自天然磷脂、合成磷脂、膽留醇、膽酸及其鹽類的一種或它們的混合物，優(yōu)選的脂質(zhì)材料選自天然磷脂，優(yōu)選的天然磷脂選自蛋黃磷脂或大豆磷脂。
本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，還可包含一種或多種選自抗氧化劑、金屬螯合劑和蛋白酶抑制劑的其它成分。
本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，所使用的復(fù)合溶劑為含低沸點(diǎn)酸的有機(jī)溶劑，其中， 低沸點(diǎn)酸選自三氟乙酸和氯化氫氣體中的一種或它們的混合物，有機(jī)溶劑為甲醇、四氫呋喃、DMS0、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一種或其混合物。
本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，可采用如下方法制備
方法1)取有機(jī)溶劑，先加入適量三氟醋酸或通入適量氯化氫氣體，再加入胰島素和脂質(zhì)材料，攪拌使兩者充分復(fù)合至形成澄清透明的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸法或噴霧干燥除去有機(jī)溶劑，殘余物干燥即得。
方法幻取有機(jī)溶劑，將脂質(zhì)材料先溶于其中，再加入胰島素，攪拌條件下緩慢通入適量氯化氫氣體或加入適量三氟醋酸，至胰島素完全溶解形成澄清透明的溶液，常溫條件下攪拌或超聲處理一定時(shí)間，使胰島素與脂質(zhì)材料充分復(fù)合，旋轉(zhuǎn)蒸法或噴霧干燥除去有機(jī)溶劑，殘余物經(jīng)干燥即得。
方法3)將胰島素溶于含適量三氟乙酸或氯化氫氣體的溶劑A中，制成澄清的胰島素溶液，脂質(zhì)材料溶于適量的溶劑B中制成澄清的脂質(zhì)溶液，將胰島素溶液與脂質(zhì)溶液混合均勻后，水浴減壓旋蒸，再經(jīng)水泵抽干處理，干燥即得。
方法4)將胰島素溶于含適量三氟乙酸或氯化氫氣體的的溶劑A中，制成澄清的胰島素溶液，脂質(zhì)材料溶于適量的溶劑B中制成澄清的脂質(zhì)溶液，將胰島素溶液與脂質(zhì)溶液混合均勻后，在一定溫度下水浴減壓旋蒸，在溶劑蒸除過程中，分次加入適量的溶劑B，繼續(xù)旋蒸，水泵抽除溶劑，干燥即得。
上述的方法1)及方法2)中，所述的“有機(jī)溶劑”選自甲醇、四氫呋喃和DMSO中的一種或其混合物，優(yōu)選地為甲醇。三氟乙酸的加入量或氯化氫氣體的通入量，以能使加入的胰島素完全溶解為準(zhǔn)，優(yōu)選地，酸在有機(jī)溶劑中的濃度為0. 01-0. 5%，優(yōu)選0. 05-0. 1 %。 (重量/體積，g/ml)
在上述方法幻及方法4)中，所述的“溶劑A”可選自甲醇、四氫呋喃或DMSO中的任一種溶劑或它們的混合物，優(yōu)選甲醇；所述的“溶劑B”可選自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一種或其混合物，優(yōu)選二氯甲烷。三氯醋酸或氯化氫氣體在溶劑A中的濃度約為 0.01-0.5%,優(yōu)選0. 05-0. 1 %。溶劑B的用量約為溶劑A的3-8倍，優(yōu)選4-6倍。
胰島素與脂質(zhì)材料的復(fù)合溶液中，胰島素的濃度應(yīng)控制在0. 5 30mg/ml，優(yōu)選 1.0 10.0mg/ml。“常溫條件下攪拌或超聲處理一定時(shí)間”中的“常溫條件”系指控制在 15°C 30°C，例如15°C、20°C、25°C或30°C ；“一定時(shí)間，，是指控制在30分鐘以內(nèi)，例如30 分鐘、20分鐘、10分鐘或5分鐘。“
在本發(fā)明的制備方法中，去除有機(jī)溶的方法可以是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法，也可以是冷凍干燥法，還可采用其它揮除溶劑的方法，只要能夠?qū)⑷軇]除干凈，并且不影響藥物的穩(wěn)定性即可。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除溶劑時(shí)，應(yīng)在不超過40°C的條件下進(jìn)行，具體地說，可以是35°C、 30°C或 25°C。
本發(fā)明還提供一種胰島素油溶液的制劑，其包含本發(fā)明所述的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物和油。其中，油選自長鏈甘油三酸酯(長鏈油)、中鏈甘油酸三酯(中鏈油)、甘油單油酸酯、 甘油單甘酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯中的一種或它們的混合物。
本發(fā)明的包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的油溶液，其特征在于，油中還可任選地加入選地加入一種或多種選自吐溫80、司盤20、汴澤、聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremphor RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor EL35)和Labrosal的乳化劑。
本發(fā)明的包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的油溶液，其特征在于，油中還可任選地加入一種或多種選自丙二醇、PEG400、Transcutol P中的助乳化劑。
本發(fā)明的包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的油溶液，藥物含量可以是iang/g，10mg/g,8mg/g, 6mg/g, 5mg/g, 4mg/g, 2mg/g 或更低。
本發(fā)明制備的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，在制備胰島素緩釋注射劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的油溶液，在制備胰島素口服、經(jīng)皮、粘膜和肺部吸入等非注射給藥制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種胰島素新型囊泡，其包含本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物和磷脂，還可加入適量的Tween20，Span60等一種或幾種混合表面活性劑，平均粒徑約為 20nm-200nmo
本發(fā)明包含胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的新型囊泡，可以是水分散液，還可以經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后制成固體粉末。
本發(fā)明的包含胰島素復(fù)合物的新型囊泡，在制備胰島素口服、經(jīng)皮、粘膜和肺部吸入等非注射給藥制劑中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明的復(fù)合物具有以下優(yōu)點(diǎn)
1)含低沸點(diǎn)酸的有機(jī)溶劑系統(tǒng)作為復(fù)合溶劑復(fù)合溶劑中不含水，低沸點(diǎn)的三氟醋酸和氯化氫氣體易于蒸除，既為胰島素的溶解提供了酸性環(huán)境，又縮短了有機(jī)溶劑揮除時(shí)間；選擇的有機(jī)溶劑可保證胰島素與脂質(zhì)材料的復(fù)合溶液澄清，其極性可確保胰島素與脂質(zhì)材料的復(fù)合穩(wěn)定性，且不影響胰島素的質(zhì)量穩(wěn)定，制得的復(fù)合物中無酸性物質(zhì)或水分殘留，復(fù)合率在90 %以上，制備及貯存過程中藥物含量無明顯變化。
2)藥物/脂質(zhì)材料用量合理基于復(fù)合溶劑的突破，胰島素與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比為1 3 1 15，即可獲得復(fù)合完全的復(fù)合物。脂質(zhì)材料用量與理論推測值相吻合。
3)制備穩(wěn)定的油溶液復(fù)合物顯著改善了胰島素的油溶性，制得的油溶液不僅載藥量高，且穩(wěn)定性好，長期放置不發(fā)生混濁，物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)均較穩(wěn)定。
4)制備穩(wěn)定的新型囊泡復(fù)合物顯著改善了胰島素的親脂性，使藥物分布在囊泡的雙分子膜夾層中，藥物在胃腸液中的穩(wěn)定性及粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率均明顯改善。
在本發(fā)明中，如果沒有特別地指出，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語以及名稱都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的意思；并且，如果沒有特別地指出，其中所采用的物質(zhì)及其含量或比例、裝置、儀器、制備條件等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的或者其根據(jù)本發(fā)明的描述可得知的。
制備實(shí)施例
1.前期探索性研究結(jié)果
1. 1有機(jī)溶劑對(duì)藥物化學(xué)性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)的影響考察
本發(fā)明人在前期研究工作中，對(duì)不同的有機(jī)溶劑進(jìn)行了系統(tǒng)考察，具體方法如下 取胰島素溶液(PH7. 4PBS)適量，加入適量的甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙醚、 氯仿，充分混勻放置1小時(shí)，氮吹吹干，加入PH7. 4的PBS溶液復(fù)溶，過濾后進(jìn)行HPLC測定， 以相同濃度的胰島素對(duì)照品PBS溶液為對(duì)照，依法測定，計(jì)算胰島素含量的變化，結(jié)果顯示，甲醇中藥物含量無明顯變化，最為穩(wěn)定，其次為四氫呋喃，而乙醇和丙酮?jiǎng)t使藥物含量下降約5-10%，乙醚下降約15%，乙酸乙酯、氯仿和四氫呋喃中下降更為明顯，約30-40%， 提示在甲醇和四氫呋喃中胰島素化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。此外還考察了 DMSO和DMF，由于DMSO 和DMF沸點(diǎn)太高，氮吹法難以吹干，因此采用冷凍干燥法去除溶劑，再加入pH7. 4的PBS溶液復(fù)溶，過濾后同上法進(jìn)行HPLC測定并計(jì)算胰島素含量，結(jié)果顯示，DMF使胰島素含量明顯下降，可能與其堿性條件有關(guān)，而DMSO質(zhì)量相對(duì)比較穩(wěn)定。
進(jìn)一步按上述甲醇、四氫呋喃和DMSO處理方法操作，去除溶劑后用5mM PBS(pH7. 4)溶解成含胰島素0. lmg/ml的供試溶液，照圓二色譜測定法，將供試溶液置于光徑0. Icm的石英樣品池中，于遠(yuǎn)紫外區(qū)(190nm 250nm)測定，記錄二級(jí)結(jié)構(gòu)圖譜的特征峰峰位及最低橢圓率；另將供試溶液置于Icm的樣品池，于近紫外區(qū)O50nm 350nm)測定， 記錄三級(jí)結(jié)構(gòu)圖譜的特征負(fù)峰峰位及最低橢圓率。結(jié)果表明，三種溶劑處理后的胰島素，二級(jí)圖譜均顯示兩個(gè)負(fù)峰，分別在210nm和223nm左右，最低橢圓率分別為-10. 63和-8. 45 左右；三級(jí)圖譜中均有一個(gè)負(fù)峰，峰位在274. 5nm左右，最低橢圓率約為-2. 26。與未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的胰島素PBS結(jié)果相比，無明顯變化，提示甲醇、四氫呋喃和DMSO不會(huì)導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的改變。
1. 2冰醋酸和鹽酸的加入對(duì)復(fù)合物質(zhì)量的影響
現(xiàn)有文獻(xiàn)中，為了使胰島素形成澄清透明的溶液，大多在有機(jī)溶劑中加入冰醋酸或鹽酸。
冰醋酸沸點(diǎn)高，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)耗時(shí)長，隨著有機(jī)溶劑的揮除，冰醋酸濃度越來越濃，導(dǎo)致胰島素降解或變性。尤其是最終的復(fù)合物中殘留的冰醋酸無法去除，會(huì)使復(fù)合物貯存穩(wěn)定性變差。這種冰醋酸殘留量較高的復(fù)合物，即使溶于油溶液中，藥物含量仍會(huì)明顯下降， 在最初的M小時(shí)含量通常下降。
本發(fā)明人曾選用對(duì)胰島素含量沒有影響的甲醇為復(fù)合溶劑，加入1-5%的冰醋酸， 以藥物/磷脂質(zhì)量比為1 10制備復(fù)合物，35°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除溶劑，真空條件下干燥48 小時(shí)，對(duì)制得的復(fù)合物進(jìn)行測定，復(fù)合率達(dá)98%以上，但氣相色譜法測定冰醋酸殘留量超出0.5%。制得的復(fù)合物在2-8°C條件下貯存4周后，與初始含量相比，胰島素含量下降約 20%。將復(fù)合物溶于中鏈油中，室溫放置對(duì)小時(shí)，與初始含量相比，含量下降約15%。由此提示，冰醋酸的殘留對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性有極為顯著的影響。
本發(fā)明人進(jìn)一步用含有稀鹽酸的甲醇溶液作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，35°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法(溫度達(dá)到50°C即對(duì)胰島素質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響，通常需控制在40°C以下、且時(shí)間不宜過長)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因引入了一定的水分，去除溶劑更加困難，復(fù)合物成形不好。氣相色譜法測定鹽酸殘留量約0. 2%，在2-8°C條件下貯存4周后，與初始含量相比，復(fù)合物中的胰島素含量下降約10%。將復(fù)合物溶于中鏈油中，室溫放置對(duì)小時(shí)，與初始含量相比，含量下降約 5%。
1.3以甲醇(含0.1%三氟乙酸)_ 二氯甲烷為復(fù)合溶劑的考察
以甲醇(含0. 三氟乙酸)_ 二氯甲烷為溶劑，設(shè)定藥物質(zhì)量濃度為1.5mg/ ml，胰島素與大豆磷脂的投料比分別為1 1，1 3，1 5，1 7. 5，1 10，1 15和 1 20 (w/w)。將胰島素溶于甲醇中，磷脂加入二氯甲烷中，然后將兩者混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水浴溫度為37°C，氮吹。
照如下方法測定復(fù)合率及油中溶解度
復(fù)合率(包封率)利用胰島素復(fù)合物在環(huán)己環(huán)中易溶，而游離胰島素不溶于環(huán)己環(huán)的特征，進(jìn)行復(fù)合率測定。
復(fù)合物藥物總含量測定精密稱取胰島素磷脂復(fù)合物適量，用含冰醋酸的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試液；另精密稱取胰島素對(duì)照品適量，用PBS(pH7. 4)溶液溶解制成濃度為lmg/ml的溶液，再用含冰醋酸的甲醇稀釋成濃度為0. 2mg/mL的溶液作為對(duì)照液。分別精密量取供試液和對(duì)照液各10 μ L，照HPLC方法，以0.2% TFA 乙腈=70 30為流動(dòng)相，柱溫30°C，流速lmL/min，波長214nm，色譜柱為Agilent ZORBAX 300SB-C8，依法測定，根據(jù)峰面積按外標(biāo)法計(jì)算復(fù)合中的藥物總含量，記為W總。
復(fù)合物中與磷脂結(jié)合的藥物含量測定精密稱取胰島素磷脂復(fù)合物適量(含胰島素約IOmg)，置IOmL容量瓶中，加環(huán)己烷溶解并定容，搖勻，經(jīng)0. 45 μ m有機(jī)膜濾除未被復(fù)合的游離胰島素，精密量取續(xù)濾液2mL于IOmL容量瓶中，氮吹除去溶劑，加入含冰醋酸的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，照上述HPLC方法依法測定，按外標(biāo)法計(jì)算溶液中的藥物含fi，id^ W復(fù)合。
復(fù)合率按下式計(jì)算復(fù)合率％= (fffi^/ff,6)X100%
油中溶解度分別取適量的胰島素及磷脂復(fù)合物，加入大豆油或中鏈油，置30°C 磁力攪拌器中，攪拌他使充分混合、溶解，30°C放置Mh，觀察藥物是否析出，如無藥物析出，再加適量胰島素磷脂復(fù)合物，同法操作，直至藥物析出。取樣5mL，用0. 45 μ m濾膜過濾， 取續(xù)濾液用醋酸甲醇稀釋適宜倍數(shù)，照HPLC依法測定，計(jì)算大豆油及中鏈油中的表觀溶解度。
7組復(fù)合物測定結(jié)果如下表所示
藥物與磷脂比例對(duì)復(fù)合物的影響
權(quán)利要求
1.一種胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，所述的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物由胰島素和脂質(zhì)材料復(fù)合而成，復(fù)合物中胰島素與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比例為1 3 1 20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，所述的胰島素選自天然胰島素、豬胰島素、牛胰島素、重組人胰島素及各類中、長效胰島素中至少一種；所述的脂質(zhì)材料選自天然磷脂、合成磷脂、膽留醇、膽酸及其鹽類中至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，所述的胰島素選自重組人胰島素，所述的脂質(zhì)材料選自天然磷脂，并且胰島素與天然磷脂的質(zhì)量比為1 5 1 10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，，所述的胰島素還包含選自抗氧化劑、金屬螯合劑或蛋白酶抑制劑中至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，所述胰島素脂質(zhì)復(fù)合物在制備過程中采用含低沸點(diǎn)酸的有機(jī)溶劑系統(tǒng)為復(fù)合溶劑；
6.根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物，其特征在于，所述的低沸點(diǎn)酸選自三氟乙酸和氯化氫氣體中的一種或它們的混合物，所述的有機(jī)溶劑選自甲醇、四氫呋喃、DMS0、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一種或其混合物。
7.一種胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物和油。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，所述的油選自長鏈甘油三酸酯、中鏈甘油酸三酯、甘油單油酸酯、甘油單甘酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯中的一種或它們的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，所述的油含有乳化劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，所述的乳化劑選自吐溫 80、司盤20、汴澤、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和Labrosal中至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，所述的油中還含有助乳化劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物油溶液，其特征在于，所述的助乳化劑劑選自丙二醇、PEG400、Transcutol P 中至少一種。
13.權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)的包含胰島素復(fù)合物的油溶液，在制備胰島素緩釋注射劑中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)的包含胰島素復(fù)合物的油溶液，在制備胰島素口服、經(jīng)皮、粘膜和肺部吸入等非注射給藥制劑中的應(yīng)用。
15.一種胰島素新型囊泡，其特征在于，含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物和磷脂。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的胰島素新型囊泡，其特征在于，還含有表面活性劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的胰島素新型囊泡，其特征在于，所述的表面活性劑選自 Tween20、Span60 中至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的胰島素新型囊泡，其特征在于，所述的囊泡可以是水分散液，還可以經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后制成固體粉末。
19.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的胰島素新型囊泡，在制備胰島素口服、經(jīng)皮、粘膜和肺部吸入等非注射給藥制劑中的應(yīng)用。
20.制備權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的方法，包括如下步驟取有機(jī)溶劑，先加入或通入適量的低沸點(diǎn)酸，再加入胰島素和脂質(zhì)材料，攪拌使兩者充分復(fù)合至形成澄清透明的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸法或噴霧干燥除去有機(jī)溶劑，殘余物干燥即得；該制備方法的有機(jī)溶劑可選自甲醇、四氫呋喃或DMSO中的任一種溶劑或它們的混合物，優(yōu)選甲醇。
21.制備權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的方法，包括如下步驟將脂質(zhì)材料先溶于有機(jī)溶劑中，再加入胰島素，攪拌條件下緩慢加入或通入適量低沸點(diǎn)酸，至胰島素完全溶解形成澄清透明的溶液，常溫條件下攪拌或超聲處理一定時(shí)間，使胰島素與脂質(zhì)材料充分復(fù)合，旋轉(zhuǎn)蒸法或噴霧干燥除去有機(jī)溶劑，殘余物經(jīng)干燥即得；該制備方法的有機(jī)溶劑可選自甲醇、四氫呋喃或DMSO中的任一種溶劑或它們的混合物，優(yōu)選甲醇。
22.制備權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的方法，包括如下步驟將胰島素溶于含適量低沸點(diǎn)酸的溶劑A中制成澄清的胰島素溶液，脂質(zhì)材料溶于適量的溶劑B中制成澄清的脂質(zhì)溶液，將胰島素溶液與脂質(zhì)溶液混合均勻后，水浴減壓旋蒸，再經(jīng)水泵抽干處理，干燥即得。該制備方法中，溶劑A可選自甲醇、四氫呋喃或DMSO中的任一種溶劑或它們的混合物， 優(yōu)選甲醇；溶劑B可選自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一種或其混合物，優(yōu)選二氯甲烷。
23.制備權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物的方法，包括如下步驟將胰島素溶于含適量低沸點(diǎn)酸的溶劑A中制成澄清的胰島素溶液，脂質(zhì)材料溶于適量的溶劑B中制成澄清的脂質(zhì)溶液，將胰島素溶液與脂質(zhì)溶液混合均勻后，在一定溫度下水浴減壓旋蒸， 旋蒸過程中分次加入適量的溶劑B，繼續(xù)旋蒸，水泵抽除溶劑，干燥即得。該制備方法中，溶劑A可選自甲醇、四氫呋喃或DMSO中的任一種溶劑或它們的混合物， 優(yōu)選甲醇；溶劑B可選自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一種或其混合物，優(yōu)選二氯甲烷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胰島素脂質(zhì)復(fù)合物及其制備方法和制劑。本發(fā)明的胰島素脂質(zhì)復(fù)合物是由胰島素與脂質(zhì)材料在含低沸點(diǎn)酸的有機(jī)溶劑系統(tǒng)中復(fù)合、干燥而成，胰島素與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比為1∶3～1∶20，復(fù)合率高，穩(wěn)定性好。本發(fā)明還提供了一種胰島素的油溶液和一種胰島素的新型囊泡。
文檔編號(hào)A61K9/10GK102512667SQ20111019673
公開日2012年6月27日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者劉玉玲, 周翠萍, 夏學(xué)軍, 宋智慧, 李琳, 汪仁蕓, 王洪亮, 董武軍, 金篤嘉 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所