專利名稱：抑制il－6作用的方法
白細(xì)胞介素6(IL-6)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。編碼B細(xì)胞刺激因子2(BSF-2)、干擾素β2和26kDa蛋白的cDNA的分子克隆表明這些分子是相同的。而且，雜交瘤/漿細(xì)胞瘤生長因子(HPGF)和肝細(xì)胞刺激因子(HSF)也被發(fā)現(xiàn)與該分子相同，因此，這個(gè)分子被稱為IL-6。隨后的研究表明IL-6不僅作用于B細(xì)胞，而且作用于造血干細(xì)胞和肝細(xì)胞，并誘導(dǎo)造血以及急性相反應(yīng)(acute phase reaction)。它也被表明作用于T細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角化細(xì)胞。由于抗體產(chǎn)生、造血和急性相反應(yīng)是抗感染、炎癥和組織損傷的三種主要反應(yīng)，IL-6可能在宿主防御機(jī)制中起關(guān)鍵作用。另一方面，IL-6基因表達(dá)的去調(diào)節(jié)被表明與多克隆和單克隆B細(xì)胞異常的發(fā)病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性骨髓瘤有關(guān)。
白細(xì)胞介素6起先被確定為T細(xì)胞來源的淋巴因子，它誘導(dǎo)B細(xì)胞最終成熟為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。重組的人IL-6作用于用金黃色葡萄球菌CowanI或pokeweed促細(xì)胞分裂劑(PWM)激活的B細(xì)胞，以誘導(dǎo)IgM、IgG和IgA的產(chǎn)生，但不作用于靜止的B細(xì)胞。人們發(fā)現(xiàn)抗IL-6抗體抑制PWM誘導(dǎo)的Ig產(chǎn)生，表明IL-6是PWM誘導(dǎo)的Ig產(chǎn)生中的必需因子。此外，IL-6可以增加小鼠體內(nèi)初級(jí)和次級(jí)抗SRBC抗體的產(chǎn)生。IL-6也能增強(qiáng)鼠Peyer’s Patch B細(xì)胞中IgA的合成，所述B細(xì)胞已能產(chǎn)生IgA。鼠IL-6也作用于用抗Ig抗體或硫酸葡聚糖激活的鼠B細(xì)胞；IL-6和IL-1協(xié)同地刺激這些鼠B細(xì)胞的生長和分化。白細(xì)胞介素6也能誘導(dǎo)T細(xì)胞的生長和分化，啟動(dòng)促細(xì)胞分裂劑刺激的胸腺細(xì)胞和外周T細(xì)胞的生長。它也可在IL-2的存在下誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的分化，所述IL-2來自鼠和人的胸腺和脾T細(xì)胞。
通過縮短干細(xì)胞的Go期，IL-6和IL-3協(xié)同地誘導(dǎo)多能造血祖細(xì)胞的集落形成。IL-3和IL-6和協(xié)同作用也在無血清的培養(yǎng)條件下觀察到，表明IL-6可以增強(qiáng)多能干細(xì)胞對(duì)IL-3的敏感性。當(dāng)骨髓細(xì)胞被移植給受到致死照射的接受者時(shí)，第30天的存活率僅為20％。但是，當(dāng)這些細(xì)胞在移植之前用IL-6和IL-3預(yù)培養(yǎng)之后，存活率升至90％。
此外，IL-6在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)巨核細(xì)胞的成熟。IL-6顯著增加細(xì)胞的大小和乙酰膽堿酯酶(該細(xì)胞系中的標(biāo)記酶)活性。IL-6也誘導(dǎo)向高倍體家族的明顯轉(zhuǎn)變。
急性相反應(yīng)是全身性的抗炎癥、感染或組織損傷的反應(yīng)，其特征在于白細(xì)胞增多、發(fā)燒、血管通透性增加、血漿金屬改變和類固醇濃縮，以及急性相蛋白水平提高。由肝細(xì)胞產(chǎn)生的急性相蛋白被幾種可溶因子調(diào)節(jié)，比如IL-1、TNF和HSF。在這些因子中，只有HSF能誘導(dǎo)全部的急性相蛋白。已經(jīng)表明，重組IL-6與HSF作用相同。在人肝癌細(xì)胞系中，它能誘導(dǎo)多種急性相蛋白，比如纖維蛋白原、α-1-抗糜蛋白酶、α-1-酸性糖蛋白和結(jié)合珠蛋白。此外，IL-6在人初級(jí)肝細(xì)胞中誘導(dǎo)血清淀粉樣蛋白A、C反應(yīng)蛋白和α-1-抗胰蛋白酶。在大鼠中，IL-6誘導(dǎo)纖維蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和α2巨球蛋白。血清白蛋白是由IL-6負(fù)向調(diào)節(jié)的。
IL-6刺激的成膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6mRNA的產(chǎn)生，表明IL-6對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有某些作用。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12是-種典型的神經(jīng)分化模型。神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中化學(xué)的、超結(jié)構(gòu)的、形態(tài)上的改變。也發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)該細(xì)胞典型地分化為神經(jīng)細(xì)胞，而病毒感染的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。IL-6也誘導(dǎo)星形細(xì)胞分泌NGF。在CNS中，IL-6可能與病毒感染過程中的修復(fù)機(jī)制有關(guān)。
IL-6與疾病有關(guān)首先是針對(duì)心粘液瘤提出的?；颊呓?jīng)常顯示出與多克隆漿細(xì)胞增多有關(guān)的癥狀，比如高γ球蛋白癥、存在多種自身抗體、急性相蛋白增加。這些癥狀隨腫瘤的切除而消失，表明粘液瘤來源的因子可誘導(dǎo)出這些現(xiàn)象。人們發(fā)現(xiàn)粘液瘤細(xì)胞表達(dá)大量的IL-6。異常的IL-6產(chǎn)生也在Castleman氏病患者中觀察到。在這些患者中，發(fā)現(xiàn)增生淋巴結(jié)的生發(fā)中心中的激活的B細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。在切除這些淋巴結(jié)后，觀察到臨床改善和血清IL-6水平降低。這個(gè)證據(jù)表明去調(diào)節(jié)的IL-6生成可誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞活化和急性相蛋白的增加。據(jù)認(rèn)為，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)也存在這種可能性。在取自患有活性RA的患者的關(guān)節(jié)的滑液中，檢測到了高水平的IL-6。白細(xì)胞介素5是鼠雜交瘤/漿細(xì)胞瘤的強(qiáng)力生長因子，表明IL-6可能與漿細(xì)胞瘤/骨髓瘤的生成有關(guān)。而且，用分離自多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，IL-6是人骨髓瘤細(xì)胞的自分泌生長因子。所有的證據(jù)表明IL-6的去調(diào)節(jié)基因表達(dá)可能與多克隆B細(xì)胞的活化和漿細(xì)胞成瘤有關(guān)。
間質(zhì)增生性腎小球腎炎(PGN)的組織學(xué)特征是間質(zhì)細(xì)胞(MC)的增殖，表明MC的生長因子與該病的病因有關(guān)。這顯示IL-6是MC的自分泌生長因子。它可從PGN患者的尿樣中檢測出來。而且，觀察到尿中IL-6的水平與PGN的發(fā)展是緊密相關(guān)的。這些結(jié)果表明MC中去調(diào)節(jié)的IL-6產(chǎn)生與PGN的病因有關(guān)。
與IL-6過量有關(guān)的其他疾病包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤、狼瘡、Hashmito氏自身免疫甲狀腺炎和自身免疫溶血性貧血癥。
本發(fā)明提供抑制IL-6作用的方法，其包括對(duì)需要治療的人施用有效量的式(I)化合物及其藥用鹽和溶劑化物，
其中R1和R3獨(dú)立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
-Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
本發(fā)明涉及這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即一類特定的2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩(苯并噻吩)，也就是式I化合物，可以用于抑制IL-6，也可抑制白血病抑制劑因子(LIF)。最后，該化合物可用于抑制利用gp130跨膜蛋白進(jìn)行結(jié)合/信號(hào)傳導(dǎo)的抑制受體系統(tǒng)。這樣的受體系統(tǒng)包括IL-6、LIF、onconstatin M、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子和IL-11。
本發(fā)明通過的應(yīng)用方法可如下進(jìn)行向需要治療的人施用一定劑量的式I化合物或其藥用鹽或溶劑化物，其可以有效地抑制IL-6的作用。
術(shù)語“抑制”包括其通常被接受的含義，包括阻止、預(yù)防、遏制、減緩、終止或逆轉(zhuǎn)。如此，如果需要的話，本方法包括藥物治療和/或預(yù)防性施用。不希望被理論所束縛，據(jù)信式I化合物可抑制IL-6的分泌和/或利用，因此可用于與IL-6過量有關(guān)的疾病。而且，看來該化合物抑制利用gp130跨膜蛋白進(jìn)行結(jié)合/信號(hào)傳導(dǎo)的抑制受體系統(tǒng)。
雷洛昔芬是核調(diào)節(jié)分子，它是本發(fā)明式I化合物的鹽酸鹽，其中R1和R2是氫，R2是1-哌啶基。已表明雷洛昔芬結(jié)合雌激素受體，它起先被認(rèn)為是一種具有抗雌激素功能和藥性的分子，能夠阻遏雌激素激活子宮組織和雌激素依賴性乳癌的能力。實(shí)際上，雷洛昔芬確實(shí)阻遏雌激素在一些細(xì)胞中的作用；但是，在其他細(xì)胞類型中，雷洛昔芬與雌激素激活同樣的基因，并表現(xiàn)出同樣的藥性，例如使骨質(zhì)疏松，血脂過高。結(jié)果，雷洛昔芬被認(rèn)為是具有激動(dòng)劑-拮抗劑混合特性的抗雌激素物質(zhì)。雷洛昔芬表現(xiàn)出的獨(dú)特的作用方式及其與雌激素的差異目前被認(rèn)為是來自于雷洛昔芬-雌激素受體復(fù)合物對(duì)不同基因功能的獨(dú)特的激活和/或抑制作用，該作用與雌激素-雌激素受體復(fù)合物對(duì)基因的激活和/或抑制作用不同。因此，雖然雷洛昔芬和雌激素利用和競爭同一受體，但二者由基因調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的藥理作用是難以預(yù)測的，而且是各自不同的。
一般說來，將本發(fā)明化合物與普通的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制并壓成片劑，或制成適于口服的酏劑或溶液，或通過肌肉或靜脈內(nèi)途徑施用。該化合物可以透皮施用，也可以制成持續(xù)釋放的劑型等。
本發(fā)明方法所用的化合物可用已經(jīng)建立的方法來制備，如美國專利4,133,814、4,418,068和4,380,635所述，在此引入作為參考。一般說來，制備過程開始于一個(gè)帶有6-羥基和2-(4-羥苯基)基團(tuán)的苯并[b]噻吩。起始化合物被保護(hù)、?；?、去保護(hù)，形成式I化合物。這樣的化合物的制備實(shí)例見上述美國專利。術(shù)語“任意取代的苯基”包括苯基和被C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代一次或兩次的苯基。
本發(fā)明方法所用的化合物可以與多種有機(jī)和無機(jī)的酸和堿形成藥用酸和堿加成鹽，包括在藥物化學(xué)中經(jīng)常應(yīng)用的生理可接受鹽。這樣的鹽也是本發(fā)明的一部分。用于形成這樣的鹽的典型無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等。也可以使用從有機(jī)酸，比如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸以及羥基鏈烷二酸、芳香族酸、脂肪酸和芳香族磺酸獲得的鹽。這樣的藥用鹽包括乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰乙酰氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、尼克酸鹽、異尼克酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對(duì)苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
藥用酸加成鹽典型地是通過將式I化合物與等摩爾或過量的酸反應(yīng)形成的。反應(yīng)物一般于互溶劑如乙醚或苯中進(jìn)行反應(yīng)。鹽通常在大約1小時(shí)至10天內(nèi)從溶液中析出，并可通過過濾分離，或用常規(guī)方法去掉溶劑。
通常用于形成鹽的堿包括氫氧化銨、堿金屬及堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽，以及脂肪族的伯、仲、叔胺、脂肪族二胺。在制備加成鹽中特別有用的堿包括氫氧化銨、碳酸鉀、甲胺、乙二胺、二乙胺和環(huán)己胺。
與形成它們的化合物相比，藥用鹽一般具有更強(qiáng)的溶解特性，因此更適于制成液體或乳劑。
藥物制劑可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，這些化合物可以與常用的賦形劑、稀釋劑或載體制成片劑、膠囊劑、懸液劑、粉劑等。適于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的例子包括填充劑和增量劑，如淀粉、糖、甘露醇和硅衍生物；結(jié)合劑，如羧甲基纖維素和其他纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮；保濕劑，如甘油；崩散劑，如碳酸鈣和碳酸氫鈉；阻滯溶解劑，如石蠟；吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物；表面活性劑，如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯；吸附載體，如陶土和皂土；潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂，固體聚乙二醇。
這些化合物也可制成酏劑或溶液劑，使之適于口服，或制成適于胃腸外(如肌肉內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi))給藥的溶液。此外，這些化合物也適于制成持續(xù)釋放的劑型等。這些制劑可以這祥制成，使得它們可能在一段時(shí)間內(nèi)，僅僅或優(yōu)選地在腸道的特定部位釋放出活性成分。包衣、包膜和保護(hù)性基質(zhì)可以由例如聚合物質(zhì)和蠟制成。
根據(jù)本發(fā)明，抑制IL-6、LIF或利用gp130跨膜的受體系統(tǒng)所需的式I化合物的具體劑量，依賴于病惰的嚴(yán)重程度、施用途徑、以及由主治醫(yī)師決定的相關(guān)因素。一般說來，可接受的有效的日劑量為大約0.1至1000毫克/天，更典型的是大約50至200毫克/天。用這樣的劑量對(duì)患者施用，每天要進(jìn)行一次至大約三次，如果需要，可以施用更多次，以有效地抑制細(xì)胞-細(xì)胞粘連或其作用，或本文所公開的任何其他應(yīng)用。
如施用帶有堿性基團(tuán)(如哌啶子基環(huán))的藥物時(shí)慣用其酸加成鹽一樣，通常優(yōu)選的是以酸加成鹽的形式施用式I化合物。通過口服途徑施用該化合物也是有利的。為此，下述口服劑型是適用的。
制劑在下述制劑中，“活性成分”指的是式I化合物。制劑1明膠膠囊硬明膠膠囊以如下方式制備成分 量(毫克/膠囊)活性成分 0.1-1000淀粉，NF 0-650淀粉可流動(dòng)粉末 0-650350厘斯聚硅氧烷流體 0-15各成分混合后，通過45號(hào)篩孔的U.S.篩，填入硬明膠膠囊中。已制成的具體的雷洛昔芬膠囊制劑包括以下這些制劑2雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 112淀粉可流動(dòng)粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑3雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 108淀粉可流動(dòng)粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑4雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 103淀粉可流動(dòng)粉末 225.3350厘斯聚硅氧烷流體1.7制劑5雷洛昔芬膠囊成分 量(毫克/膠囊)雷洛昔芬 50淀粉，NF 150淀粉可流動(dòng)粉末 397350厘斯聚硅氧烷流體 3.0上述具體的制劑可依照所提供的合理的變化而改變。用如下成分可以制備片劑制劑6片劑成分 量(毫克/片)活性成分 0.1-1000微晶纖維素 0-650煅制二氧化硅 0-650硬脂酸 0-15將各成分混合，壓成片劑?？蛇x地，每片含有0.1-1000毫克活性成分的片劑可如下制成制劑7片劑成分 量(毫克/片)活性成分 0.1-1000淀粉 45微晶纖維素 35聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶 4液)羧甲基纖維素鈉 4.5硬脂酸鎂 0.5滑石 1將活性成分、淀粉和纖維素通過45號(hào)篩孔的U.S.篩并充分混合。所得的粉末與聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，然后通過14號(hào)篩孔的U.S.篩。所得顆粒在50°-60℃下干燥，通過18號(hào)篩孔的U.S.篩。將羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石預(yù)先通過60號(hào)的U.S.篩，然后加入到顆粒中，混合后，用壓片機(jī)壓成片劑。
每5毫升劑量含有0.1-1000毫克藥物的懸液劑可如下制備制劑8懸液劑成分量(毫克/5毫升)活性成分0.1-1000毫克羧甲基纖維素鈉 50毫克糖漿1.25毫升苯甲酸溶液 0.10毫升調(diào)味劑 q.v.
著色劑 q.v.
加純水至5毫升將藥物通過45號(hào)篩孔的U.S.篩，與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合形成光滑的膏體。將苯甲酸溶液、調(diào)味劑、著色劑用一些水稀釋，邊攪動(dòng)邊加到膏體中。再加入足量的水以達(dá)到所需的體積。
測試1六月齡的未孕SD大鼠是OVX或OVX/垂體切除的(HYPOX)，并用賦形劑(20％環(huán)糊精，PO)、雷洛昔芬(0.1至10毫克/公斤/天，PO)或ethynyl雌二醇EE2(0.001至0.1毫克毫克/公斤/天，PO)。還包括一個(gè)假飼的，用賦形劑處理的對(duì)照。35天或較短的處理時(shí)間之后收集血清或長骨。通過生物測試確定血清細(xì)胞因子。
處理35天后，OVX導(dǎo)致骨質(zhì)量的顯著降低，并伴有血清IL-6水平的顯著而協(xié)同的增高(表1)。有趣的是，雷洛昔芬和EE2都顯著地減弱OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)減少并升高血清IL-6的水平。在OVX后僅處理了4天的動(dòng)物中，EE2和雷洛昔芬處理會(huì)產(chǎn)生顯著的降低。相反，在OVX/HYOX大鼠中沒有觀察到血清IL-6的升高，骨密度也不受EE2或雷洛昔芬的影響。沒有檢測到其他血清因子的協(xié)同改變。
表1血清IL-6(ng/ml) BMD％(保護(hù))假飼 0.42±0.13100±4.65OVX 7.18±2.0 0.00±10.24雷洛昔芬10mg/kg 1.23±0.4582.09±7.02雷洛昔芬1mg/kg1.55±0.4882.50±17.17雷洛昔芬0.1mg/kg 4.32±1.6563.88±19.8Ethy 100μg/kg0.20±0.1076.00±18.3雌二醇10μg/kg1.84±0.6057.25±16.07雌二醇1μg/kg 3.42±2.235.28±11.8317-β-E2 100μg/kg0.07±0.10106.4±11.8測試2十周齡的雄性BALB/c小鼠用賦形劑(20％環(huán)糊精，PO)或雷洛昔芬(1mg/kg，PO)處理3天。在第4天，用賦形劑(含鹽的，IP)、LA-15.1抗IL-1受體單克隆抗體(mAb)(250ug，IP)或人重組IL-1b(3ug，SC)處理小鼠。2小時(shí)后，眼眶血竇穿刺(orbital sinus puncture)收集血清，用ELISA測量IL-6水平。
向環(huán)糊精處理過的小鼠注射IL-1，將導(dǎo)致血清IL-6顯著增加(193±29ng/ml)，這是相對(duì)向環(huán)糊精處理過的小鼠注射鹽水而言的(1ng/ml)(表2)。有趣的是，雷洛昔芬顯著減弱IL-1誘導(dǎo)的血清IL-6水平的增加(90±21ng/ml)?？笽L-1受體mAb LA-15.1完全減弱IL-1誘導(dǎo)的血清IL-6水平的增加。
表2IL-6(ng/ml)CDX/Sal/Sal ＜0.5CDX/Sal/IL-1193±2.9139478/Sal/IL-1 90±2.1CDX/15.6MAb/IL-1＜0.5測試3下列小鼠細(xì)胞系被用于細(xì)胞因子生物檢測CTLL6細(xì)胞裂解T細(xì)胞-IL-2，IL-4；11.6輔助T細(xì)胞-IL-4；T1165.17漿細(xì)胞瘤-IL-1，IL-6；B9雜交瘤-IL-6，LIF(白血病抑制因子)。在96孔平底微量滴定平板的各復(fù)孔中接種大約5000個(gè)細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基(即Iscove氏改性Dulbecco氏培養(yǎng)基或Dulbecco氏改性Eagle氏培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充了25mM Hepes，2mM L-谷氨酰胺，50μM 2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50μg/ml硫酸鏈霉素和胎牛血清)，培養(yǎng)基中含有賦形劑(DMSO)、雷洛昔芬(0.01至1μM)沒有或含有標(biāo)明的重組細(xì)胞因子。將微量滴定板在37℃，潮濕的10％CO2培養(yǎng)箱中保溫24至72小時(shí)。在該時(shí)間的終點(diǎn)，向各孔加入1μCi3H-胸苷或100μg的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)，然后再保溫4至6小時(shí)。將用3H-胸苷脈沖標(biāo)記的微量培養(yǎng)物收集到濾盤上，用液體閃爍技術(shù)計(jì)數(shù)。用MTT脈沖標(biāo)記的微量培養(yǎng)物每孔接受100微升10％SDS/0.01N HCl，隨后在黑暗中，在室溫下保溫過夜。在570nm下進(jìn)行光密度讀數(shù)以對(duì)細(xì)胞增殖定量，使用690nm的參考波長。
表3顯示了雷洛昔芬和雌激素對(duì)細(xì)胞因子依賴性增殖的抑制作用的比較結(jié)果。數(shù)據(jù)以對(duì)細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞增殖有50％抑制作用的IC50值表示。有趣的是，雷洛昔芬顯著地減弱IL-6和LIF刺激的細(xì)胞增殖(IL-6 IC50＝719nm；LIF IC50＝603nm)，但對(duì)IL-2和IL-4刺激的細(xì)胞增殖沒有影響(IC50＝＞1μM)。相反，17-b-雌二醇不顯著地抑制任何受試細(xì)胞因子引起的細(xì)胞增殖(IC50＝＞1μM)。這些結(jié)果表明雷洛昔芬抑制細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞增殖，所述細(xì)胞因子結(jié)合表面受體，這些受體用gp130跨膜蛋白進(jìn)行結(jié)合/信號(hào)傳導(dǎo)。這樣的受體系統(tǒng)包括IL-6、LIF、oncostatin M、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子和IL-11。
表3IC50值細(xì)胞因子 17-B-E2 雷洛昔芬IL-6 ＞1μM(n＝2) 719(n＝2)LIF ＞1μM(n＝6) 603±212nm(n＝6)IL-2 ＞1μM(n＝1) ＞1μM(n＝1)IL-4 ＞1μM(n＝3) ＞1μM(n＝3)測試4用雷洛昔芬或類似物處理雌性非ovex小鼠，給藥3-4天后，用每只鼠20-200微克劑量的脂多糖刺激這些小鼠。在刺激后3小時(shí)對(duì)動(dòng)物采血，測定血清IL-6。3小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)是基于預(yù)備實(shí)驗(yàn)得到的，代表IL-6檢測的峰值。
在雌激素類似物能夠在用LPS刺激的小鼠中降低IL-6水平的單獨(dú)的系列實(shí)驗(yàn)中，雌激素和雷洛昔芬類似物的結(jié)合導(dǎo)致協(xié)同性的IL-6減少，比各藥劑單獨(dú)使用時(shí)觀察到的效果要明顯。
因此可以預(yù)見，體內(nèi)降低IL-6水平的最有效方式是將低劑量的雌激素與雷洛昔芬結(jié)合。
最終的測試與間接體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)有關(guān)，在這些實(shí)驗(yàn)中，在有或沒有雌激素的條件下，巨噬細(xì)胞暴露于雷洛昔芬或其類似物中，在體外LPS刺激后，將能測量到顯著的IL-6水平。
表4樣本(mg/kg) O.D. ng/ml 平均賦形劑 .891 363.0賦形劑 .524 227.2賦形劑 1.001417.7賦形劑 .802 323.9 332.9雷洛昔芬0.5 .892 363.2雷洛昔芬0.5 .820 331.5雷洛昔芬0.5 .613 254.4雷洛昔芬0.5 .613 254.5 300.9雷洛昔芬5.0 .576 242.6雷洛昔芬5.0 .648 266.2雷洛昔芬5.0 .595 248.6雷洛昔芬5.0 .414 181.6 234.7雌激素0.5 .341 130.3雌激素0.5 .355 139.1雌激素0.5 .364 144.5雌激素0.5 .447 205.9 155.0雌激素5.0 .306 111.2雌激素5.0 .469 211.8雌激素5.0 .226 77.5雌激素5.0 .291 104.1 126.1雌激素+ .225 77.3Tamox雌激素+ .315 116.1Tamox雌激素+ .282 100.0Tamox雌激素+.333125.6104.8Tamox雌激素+雷 .26090.5洛昔芬0.5雌激素+雷 .20670.8洛昔芬0.5雌激素+雷 .19567.5洛昔芬0.5雌激素+雷 .298107.3 84.0洛昔芬0.5雌激素+雷 .15651.1洛昔芬5.0雌激素+雷 .22075.6洛昔芬5.0雌激素+雷 .22978.7洛昔芬5.0雌激素+雷 .12032.6 59.5洛昔芬5.0
權(quán)利要求
1.一種抑制IL-6的作用的方法，其包括對(duì)需要治療的人施用有效量的下式化合物或其藥用鹽或溶劑化物
其中R1和R3獨(dú)立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物是其鹽酸鹽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中化合物是下式化合物或其鹽酸鹽
4.一種抑制LIF的作用的方法，其包括對(duì)需要治療的病人施用有效量的下式化合物或其藥用鹽或溶劑化物
其中R1和R3獨(dú)立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
5.一種抑制利用gp130跨膜受體的表面受體系統(tǒng)的方法，其包括將所述表面受體系統(tǒng)接觸下式化合物或其藥用鹽或溶劑化物
其中R1和R3獨(dú)立地是氫、-CH3，
(C1-C6烷基)或
Ar，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
全文摘要
一種抑制IL－6作用的方法,其包括對(duì)需要治療的人施用有效量的式(Ⅰ)化合物及其藥用鹽和溶劑化物,其中R
文檔編號(hào)A61K31/4535GK1173819SQ96191799
公開日1998年2月18日 申請(qǐng)日期1996年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月6日
發(fā)明者A·L·格拉色布魯克, S·H·祖克爾曼 申請(qǐng)人:伊萊利利公司