專利名稱：一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝，具體地說是長春新堿、長春堿和長春瑞濱的脂質(zhì)體和它們的pH梯度法生產(chǎn)工藝，屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長春花屬生物堿如長春新堿、長春瑞濱和長春堿是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物。目前主要應(yīng)用于急慢性白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，以及一些實體腫瘤，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤和Ewing肉瘤及乳腺癌和小細(xì)胞肺癌等。但是如同其他抗腫瘤化療藥物一樣，長春新堿在使用過程中對患者產(chǎn)生較大的毒副作用，主要為限制劑量的毒副作用有神經(jīng)毒性，多在給藥后6～8周出現(xiàn)，表現(xiàn)為感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)受損，嚴(yán)重的會出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、足下垂或腦神經(jīng)麻痹。此外還有胃腸道反應(yīng)，漏出血管外對皮下組織的刺激作用造成病人疼痛難忍等。這些毒副作用極大地限制了長春新堿的臨床應(yīng)用。
脂質(zhì)體為磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，主要成分是磷脂和膽固醇，對人體無毒性無免疫原性。由于其尺徑大小，表面易被控制，膜特性，容量大和生物兼容性等特點，近年來被用于一些抗腫瘤藥物的包裹，當(dāng)藥物被投放到病灶部位后，藥物從脂質(zhì)體中緩慢釋放出來，達(dá)到降低毒性提高療效的目的，因此用脂質(zhì)體包裹長春新堿不失為一種理想的降低毒性并消除注射疼痛的方法。
目前，國外脂質(zhì)體長春新堿作為藥物正在進(jìn)行臨床III期的試驗，主要成分為長春新堿、神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)和膽固醇。這種脂質(zhì)體降低了長春新堿的毒性，但是藥物穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時間都有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種毒副作用小、穩(wěn)定性高、體內(nèi)循環(huán)時間長的長春花屬生物堿脂質(zhì)體。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供這種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，由長春花屬生物堿、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。
脂質(zhì)體材料中還含有DSPE-PEG2000(多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～9。
所述磷脂選自神經(jīng)鞘磷脂(MS)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或氫化磷脂酰膽堿(HSPC)中的一種。
所述長春花屬生物堿選自長春新堿、長春瑞濱和長春堿中的一種，本發(fā)明使用的是它們的硫酸鹽或重酒石酸鹽(vinorelbine bitartrate)，可方便地購得。
我們使用過DSPC、HSPC和SM分別與膽固醇組成磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體，其中以SM和膽固醇組成的脂質(zhì)體穩(wěn)定性最好。SM(或者HSPC、DSPC)是組成雙層膜的磷脂，是脂質(zhì)體最基本組成成分。膽固醇的作用是降低膜的流動性提高雙層膜的穩(wěn)定性。它們濃度的配比原則是為取得最佳穩(wěn)定性的脂質(zhì)體，SM(或HSPC、DSPC)40～60mol％，膽固醇30～50mol％，高于或低于這個濃度比例脂質(zhì)體都不會穩(wěn)定，有文獻(xiàn)報道膽固醇濃度不能低于30mol％，否則就不會起到任何作用，但是膽固醇濃度又不能高于50mol％，那樣反而會加快包裹藥物從脂質(zhì)體中滲漏出來。
提高藥物穩(wěn)定性是通過在配方中加入微量的α-tocopherol和desferal實現(xiàn)的。它們的作用一個是抑制磷脂和膽固醇的水解和氧化，另一個作用是抑制長春新堿的氧化。穩(wěn)定性試驗表明，在本發(fā)明配方劑量下合用這兩個抗氧化劑的脂質(zhì)體的滲漏率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于只用其中一種抗氧化劑的脂質(zhì)體。
通常情況下，藥脂比越低藥物的包封率會越高，穩(wěn)定性也隨之增加，因此很多包封率較高的脂質(zhì)體藥物的藥脂比在0.05∶1或更低。然而藥脂比越低，進(jìn)入脂質(zhì)體中的藥物含量越少，極不利于藥物的臨床應(yīng)用。但是由于脂質(zhì)體容量有限，如果再加上均勻分布于磷脂雙層兩側(cè)的大分子PEG，又占用部分脂質(zhì)體容量，所以提高藥脂比非常困難。本發(fā)明采用上述配方，使藥脂比最高能夠達(dá)到0.2∶1，同時包封率不低于90％。國外文獻(xiàn)和脂質(zhì)體產(chǎn)品中從未見過高于此比例的，國內(nèi)許多研究機(jī)構(gòu)所制備的脂質(zhì)體藥物的藥脂比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此比例。
在減少藥物毒副作用的同時盡量延長藥物在體內(nèi)循環(huán)的時間從而增加藥物療效也是脂質(zhì)體藥物研發(fā)所追求的目標(biāo)，本發(fā)明通過在配方中加入親水性大分子多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)來實現(xiàn)這個目的，與國外只有SM和膽固醇組成的脂質(zhì)體相比，本發(fā)明在體內(nèi)的循環(huán)時間明顯延長。對于長春花屬生物堿而言，所用DSPE-PEG2000的較佳濃度范圍是4～9mol％低于4mol％也可延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，但效果不十分顯著；而PEG的濃度超過9mol％時，會使脂質(zhì)體形成泡沫狀micelle而不呈現(xiàn)雙層結(jié)構(gòu)。DSPE-PEG2000能夠增強(qiáng)脂質(zhì)體膜表面親水性，降低各種血漿蛋白對脂質(zhì)體的結(jié)合，使脂質(zhì)體可非常有效地躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，穩(wěn)定性及包封率得到提高，漏出率降低，使脂質(zhì)體的體循環(huán)時間明顯延長，體內(nèi)重新分布，降低所包藥物的毒性反應(yīng)，同時在病灶中的濃度也顯著提高，因而增加治療指數(shù)。另外由于注射時藥物仍包裹在脂質(zhì)體中，消除了藥物漏出后對組織的刺激造成疼痛。
為了便于實施，本發(fā)明選擇pH梯度法作為基本生產(chǎn)工藝，通過試驗優(yōu)化其各項反應(yīng)條件，最終摸索出適合于長春花屬生物堿脂質(zhì)體規(guī)?；a(chǎn)的工藝路線。
一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體注射液的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體按照前述配方的量配制含有脂質(zhì)體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入200～400mM，pH值為2～5檸檬酸溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的檸檬酸溶液進(jìn)行五個冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成粒徑為80～120納米的小單層脂質(zhì)體液；(3)制備長春花屬生物堿脂質(zhì)體將長春花屬生物堿的硫酸鹽或重酒石酸鹽溶液在60℃條件下加入到小單層脂質(zhì)體液中混合，應(yīng)用0.3～0.6M的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外液pH值至7.0～7.6，在60℃水浴中放置10分鐘以上，使長春花屬生物堿進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去游離的長春花屬生物堿得到成品。
步驟(1)中使用200～400mM檸檬酸的作用主要是提高長春花屬生物堿的包封率。200～400mM可穩(wěn)定脂質(zhì)體滲透壓，優(yōu)選濃度為300mM；pH值采用2～5主要是建立pH梯度。包封率最好的pH值是2，但考慮到酸性過強(qiáng)，在脂質(zhì)體破壞后會對人體有害，所以我們優(yōu)選pH值4.0。
所述步驟(2)中的五個冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質(zhì)體用干冰(-20℃)冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。作用是進(jìn)一步提高包封率和穩(wěn)定性。小單層脂質(zhì)體的粒徑優(yōu)選100納米。
所述步驟(3)所應(yīng)用的磷酸氫二鈉溶液濃度為0.5M。用磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外pH值到高于7.0即可，但不能高過7.6，否則pH梯度不容易保持。
所述步驟(3)中除去游離的長春新堿的方法為層析法和離心分離法，屬本領(lǐng)域公知常識，故不冗述。層析柱法可以使用Sephadex G-50柱，將脂質(zhì)體長春新堿上柱，生理鹽水洗脫即可離心法是將脂質(zhì)體長春新堿置入離心機(jī)，在100,000g條件下離心5分鐘，去除上清液，用生理鹽水溶解pellet即可。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明公開的配方能夠制得包封率大于90％的脂質(zhì)體，毒性低，穩(wěn)定性高，加入DSPE-PEG2000后，進(jìn)一步延長了藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，有利于藥物的緩釋和療效提高。使用優(yōu)化后的pH梯度法操作簡便、省時，制得的脂質(zhì)體包封率高，回收率90％，磷脂，膽固醇及DSPE-PEG2000的回收率為85％左右。脂質(zhì)體滲漏率低，粒徑均勻(100±10納米)，穩(wěn)定性好，4℃放置保存一年粒徑無變化，包封率仍在85％以上。同時該方法便于滅菌及除去熱原，可實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實施例方式
表1脂質(zhì)體配方

以上材料來源如下長春堿(vinblastine)、長春新堿(硫酸鹽)和長春瑞濱(vinorelbine)購于深圳萬樂藥業(yè)。
神經(jīng)鞘磷脂(SM，sphingomyelin)、DSPC(distearoylphosphatidylcholine)、HSPC(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)、膽固醇和PEG2000-DSPE購于美國Avantipolar Lipids(Alabaster，AL)公司。
α-tocopherol和desferal購于美國Sigma公司。
實施例11.制備多層脂質(zhì)體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例21.將注射用SM和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
實施例31.制備多層脂質(zhì)體注射用DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例四1.制備多層脂質(zhì)體注射用DSPC和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
實施例51.制備多層脂質(zhì)體將注射用HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例61.制備多層脂質(zhì)體將注射用HSPC和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
實施例71.制備多層脂質(zhì)體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.6，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例81.制備多層脂質(zhì)體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春新堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例9
1.制備多層脂質(zhì)體將注射用SM和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春堿脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春堿溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春堿脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春堿仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例101.制備多層脂質(zhì)體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質(zhì)體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質(zhì)體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春瑞濱脂質(zhì)體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用重酒石酸鹽長春瑞濱溶液加入小單層脂質(zhì)體中混合，應(yīng)用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春瑞濱。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質(zhì)，即得到長春瑞濱脂質(zhì)體成品。
本品脂質(zhì)體長春瑞濱穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春瑞濱仍包裹于脂質(zhì)體中。
實施例11、急性毒性試驗一.材料DBA/2J小鼠和CD-1小鼠購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所硫酸長春新堿購于深圳萬樂藥業(yè)。
硫酸長春新堿脂質(zhì)體注射液，實施例2。
二.方法比較硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質(zhì)體注射液一次性小鼠尾靜脈給藥后的急性毒性反應(yīng)和死亡分布。
將小鼠隨機(jī)分組，每組10只，硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質(zhì)體注射液各用30只小鼠。分別注射硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質(zhì)體注射液，劑量為2、4、6毫克/公斤體重。觀察37天，每日觀察小鼠體重變化、急性中毒癥狀和死亡數(shù)目來確定半數(shù)致死量(LD50)。結(jié)果見表2。
三.結(jié)果表2.長春新堿和脂質(zhì)體長春新堿的急性毒性試驗(LD50)

長春新堿脂質(zhì)體有效降低載荷藥物的毒性，在不同種數(shù)的動物試驗中降低毒性1.7-2.1倍。
權(quán)利要求
1.一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，其特征在于由長春花屬生物堿、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體材料中還含有多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)；磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～9mol％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂選自神經(jīng)鞘磷脂(MS)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或氫化磷脂酰膽堿(HSPC)中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，其特征在于所述長春花屬生物堿選自長春新堿、長春瑞濱和長春堿中的一種。
5.一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體按照權(quán)利要求1或2所述配方的量配制含有脂質(zhì)體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入200～400mM，pH值為2～5檸檬酸溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的檸檬酸溶液進(jìn)行五個冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成80～120納米的小單層脂質(zhì)體液；(3)制備長春花屬生物堿脂質(zhì)體將長春花屬生物堿的硫酸鹽或重酒石酸鹽溶液在60℃條件下加入到小單層脂質(zhì)體液中混合，應(yīng)用0.3～0.6M的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外液pH值至7.0～7.6，在60℃水浴中放置10分鐘以上，使長春花屬生物堿進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去游離的長春花屬生物堿得到成品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(1)中檸檬酸濃度為300mM；pH值為4.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中的五個冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質(zhì)體用干冰冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中小單層脂質(zhì)體的粒徑為100納米。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(3)所應(yīng)用的磷酸氫二鈉溶液濃度為0.5M。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(3)中除去游離的長春新堿的方法為層析法或離心分離法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體及其生產(chǎn)工藝，屬于化學(xué)制藥領(lǐng)域。一種長春花屬生物堿脂質(zhì)體，由長春花屬生物堿、脂質(zhì)體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質(zhì)體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α－tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。該生產(chǎn)工藝包括(1)制備多層脂質(zhì)體；(2)制備小單層脂質(zhì)體；(3)制備長春花屬生物堿脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)點是成品毒性小、包封率高、穩(wěn)定性好；方法操作簡便，可工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K9/127GK1795859SQ20041010262
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者曹利人, 馬潔 申請人:北京文卓醫(yī)藥生物制品技術(shù)開發(fā)有限公司, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所