專利名稱：具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核 苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)八十年代日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)卡介苗(BCG)中的DNA組分在人和動(dòng)物體內(nèi)具有抗 腫瘤活性，后來研究反義核酸治療的科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)人工合成的硫代寡聚脫氧核苷酸存在非 特異的免疫刺激活性。Krieg AM等在《Nature》1995，第374卷、第546-549頁中揭示了這 些現(xiàn)象的本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化5' -CpG-3' 二核苷 酸的六核苷酸序列，特征為5’ -PuPuCpGPyPy-3’ (Pu代表嘌呤A或G ;Py代表嘧啶C或T)， 如5’ -GACGTT-3’等。其中，核心核苷酸C和G為其活性所必需，兩端各兩個(gè)核苷酸也與其 活性緊密相關(guān)。上述六核苷酸特征序列稱作CpG基元(CpG motif)，含有CpG基元的寡聚脫 氧核苷酸統(tǒng)稱為CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)。含有上述特征的CpG-ODN對(duì)小鼠具有良 好的免疫刺激活性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了 CpG-ODN在疫苗佐劑、腫瘤預(yù)防和治療、感染預(yù)防 和治療以及過敏預(yù)防和治療等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其免疫刺激 活性具有種屬特異性，因此闡明活化人免疫細(xì)胞的CpG基元和CpG-ODN是將CpG-ODN應(yīng)用 于人體臨床的必要前提。Krieg AM等在《The Journal of Immunology 2000，第164卷、第 1617-1624頁中報(bào)道了第一個(gè)能夠活化人免疫細(xì)胞的CpG基元5’_GTCGTT_3’。由此衍生的 CpG-ODN(如CpG-ODN 2006)在體外對(duì)人免疫細(xì)胞具有良好的免疫刺激活性，而且目前多個(gè) 人體臨床研究也證實(shí)了 CpG-ODN 2006在疫苗佐劑、腫瘤治療以及感染治療等領(lǐng)域的免疫 效果。根據(jù)Krieg AM等研究結(jié)果，上述CpG-ODN是人特異的，對(duì)小鼠沒有活性，因此只能用 猴子等靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為動(dòng)物模型來評(píng)價(jià)這些序列在體內(nèi)的免疫刺激活性，這增加了實(shí)驗(yàn)的 難度，例如成本增加、動(dòng)物來源難于獲得等。因此，發(fā)現(xiàn)一種非種屬特異性的廣譜CpG-ODN 是十分有必要的。對(duì)于有關(guān)CpG-ODN的研究在文獻(xiàn)《中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志》2001,21 (5)，第 471-475頁、《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2004，25 (4)，第25-28頁、《Gene Therapy)) 1996，第6卷，第 893-903 頁中有所描述。另外，專利文獻(xiàn) CN 1271733A、CN 1526718A、US 2005/0267057A1 或TO 99/56755中也公開了一些CpG-ODN及其相關(guān)的應(yīng)用，但是在上述文獻(xiàn)中，均未公開有 關(guān)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)的核苷酸，也未公開任 何有關(guān)包含該基元的硫代寡聚脫氧核苷酸對(duì)人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技術(shù)啟示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非種屬特異性的、具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸。更具體地說，本發(fā)明提供了一種對(duì)人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脫 氧核苷酸。本發(fā)明的目的還在于提供該具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸在制備疫 苗佐劑以及在制備預(yù)防或治療腫瘤、感染和過敏的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)(1)活化人免疫細(xì)胞的CpG基元 為5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ) ； (2)活化小鼠免疫細(xì)胞 的CpG基元為5’ -NA/TCGTT-3’ (其中N代表A、G、C或Τ)。在此研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)出含有 5，-NTCGTT-3，基元(包括 5，-ATCGTT-3，、5，-GTCGTT-3，、5，-CTCGTT-3，和 5，-TTCGTT-3，) 的CpG-ODN對(duì)人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。發(fā)明人進(jìn)一步研究表明，核苷酸序列中具 有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的5’ -NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)是本發(fā)明所述的硫代寡聚 脫氧核苷酸對(duì)人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的關(guān)鍵。鑒于此，本發(fā)明提供了一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸，其序列中 具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元，所述N不代表A或G，優(yōu)選為T或C。所述 硫代寡聚脫氧核苷酸的長(zhǎng)度為15 35個(gè)核苷酸，優(yōu)選為20 30個(gè)核苷酸。所述CpG是 非甲基化的。當(dāng)N為T時(shí)，所述硫代寡聚脫氧核苷酸的序列優(yōu)選為5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5' -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5，-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5，-TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、5，-TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5，-TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3，、5，-TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、
5，-TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’、5， -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’、5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5， -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5' -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3‘或
5，-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，。 當(dāng)所述N為C時(shí)，所述硫代寡聚脫氧核苷酸的序列優(yōu)選為
4
5， -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，或5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，。本發(fā)明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如 可以采用固相亞磷酰胺三酯法化學(xué)合成，此法具有高效和快速偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于 DNA化學(xué)合成領(lǐng)域中。目前對(duì)于寡聚脫氧核苷酸人工合成多委托專業(yè)的基因合成公司來處 理，例如國(guó)內(nèi)可委托上海生工生物技術(shù)公司合成。固相亞磷酰胺三酯法由3’端開始，具體反應(yīng)步驟如下1.脫保護(hù)基用三氯乙酸脫去連接在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸 的保護(hù)基團(tuán)DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應(yīng)使用；2.活化將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成 亞磷酰胺四唑活性中間體(其3’端已被活化，但5’端仍受DMT保護(hù))，此中間體與CPG上 已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)；3.連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5’ 羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基；4.氧化縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接， 而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸或堿水解，此時(shí)使用硫代試劑將亞磷酰胺氧化為硫磷雙鍵的磷 酸三酯，從而得到穩(wěn)定的寡核苷酸；5.封閉縮合反應(yīng)后為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5’羥基在隨后的循環(huán) 反應(yīng)中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基。經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上。重復(fù)以上的脫 保護(hù)基、活化、連接、氧化、封閉過程即可得到一個(gè)DNA片段粗品。最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保 護(hù)基、純化(常用的有PAGE法、HPLC法、C18法和OPC法等方法)、定量等合成后處理即可 得到符合本發(fā)明要求的硫代寡聚脫氧核苷酸。本發(fā)明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預(yù)防或治療感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了硫代寡聚脫氧核苷酸在制備預(yù)防或治療過敏的藥物中的應(yīng)用。所述硫代寡聚脫氧核苷酸在體外對(duì)人和小鼠免疫細(xì)胞均有良好的免疫刺激活性， 可以從對(duì)小鼠中的免疫刺激活性結(jié)果來評(píng)價(jià)其在人體中的免疫刺激活性。作為疫苗佐劑， 其能夠顯著增強(qiáng)小鼠對(duì)基因工程乙肝疫苗的免疫應(yīng)答，而且能夠使免疫應(yīng)答偏向TH1方向。 由于本發(fā)明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸能夠誘生出很強(qiáng)的TH1類免疫應(yīng)答，表明其也可用 于過敏和感染的預(yù)防和治療。同時(shí)，本發(fā)明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內(nèi)也具有 良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性。


圖1為示出具有5’-NTCGTPy_3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脫氧核苷酸的人免疫刺激活性的圖。圖2為示出具有5’-NA/TCGTT_3’(其中N代表A、G、C或Τ)基元的寡聚脫氧核苷 酸的小鼠免疫刺激活性的圖。
圖3a為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(Tl T6、C1和C2)以及對(duì)照序列1826的人 免疫刺激活性的圖。圖3b為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(T7 T14)的人免疫刺激活性的圖。圖3c為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(T15 T22)的人免疫刺激活性的圖。圖4a為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(Tl T6、Cl和C2)以及對(duì)照序列1826和 T7C的小鼠免疫刺激活性的圖。圖4b為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(T7 T14)的小鼠免疫刺激活性的圖。圖4c為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸(T15 T22)的小鼠免疫刺激活性的圖。圖5為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸作為疫苗佐劑增強(qiáng)小鼠對(duì)基因工程乙肝表面 抗原的免疫應(yīng)答的圖。圖6為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸與其它疫苗佐劑聯(lián)用增強(qiáng)小鼠對(duì)基因工程乙 肝表面抗原的免疫應(yīng)答的圖。圖7為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內(nèi)誘生TH1類免疫應(yīng)答的圖。圖8為示出本發(fā)明寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式
的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本 發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要 不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1.具有5’ -NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脫氧核苷酸的人免疫刺激活性為了闡明活化人免疫細(xì)胞的CpG基元，本發(fā)明人對(duì)CpG基元中除核心核苷酸CpG 以外的其余四個(gè)核苷酸進(jìn)行了突變研究。為此，發(fā)明人設(shè)計(jì)了一組CpG-ODN，如表1所示，每 條序列長(zhǎng)度為12個(gè)核苷酸，均含有兩個(gè)相同拷貝的CpG基元。用這些CpG-ODN刺激體外培 養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，通過測(cè)定培養(yǎng)上清中的IgM含量，即可評(píng)價(jià)它們對(duì)人免 疫細(xì)胞的活性。本實(shí)施例中所使用的CpG-ODN由本發(fā)明人設(shè)計(jì)，委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行 人工合成，并進(jìn)行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化，溶于生理鹽水，-200C 冰箱中保存?zhèn)溆?。?權(quán)利要求
一種具有免疫刺激活性的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其序列中具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的5’ NTCGTT 3’基元，且其長(zhǎng)度為15～35個(gè)核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N為C。
2.如權(quán)利要求1所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于所述全鏈硫代修 飾的寡聚脫氧核苷酸的長(zhǎng)度為20 30個(gè)核苷酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于所述全鏈硫 代修飾的寡聚脫氧核苷酸的序列為5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 或5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3'。
4.一種藥物組合物，其特征在于由權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的全鏈硫代修飾的寡 聚脫氧核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體制成。
5.權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸在制備疫苗佐劑中 的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的全鏈硫代修飾的寡聚脫氧核苷酸在制備預(yù)防或治療 腫瘤、感染、過敏的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸，其序列中具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基元，且其長(zhǎng)度為15～35個(gè)核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N不代表A或G。該硫代寡聚脫氧核苷酸在體外對(duì)人和小鼠免疫細(xì)胞均有良好的免疫刺激活性，可以從對(duì)小鼠中的免疫刺激活性結(jié)果來評(píng)價(jià)其在人體中的免疫刺激活性。作為疫苗佐劑，其能夠顯著增強(qiáng)小鼠對(duì)基因工程乙肝疫苗的免疫應(yīng)答，而且能夠使免疫應(yīng)答偏向TH1方向，表明可用于過敏和感染的預(yù)防和治療。同時(shí)，本發(fā)明所述的硫代寡聚脫氧核苷酸在小鼠體內(nèi)也具有良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性。
文檔編號(hào)A61K31/7125GK101979566SQ20101052700
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者許洪林 申請(qǐng)人:許洪林