專利名稱：：一種具有生理活性的核肽復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從海產(chǎn)螺中提取制備天然的生理活性的核肽復(fù)合物，以及該復(fù)合物的制備方法與在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景男性自50歲開始，隨著年齡增長睪丸代謝生理性衰退，雄激素合成功能減退，嚴(yán)重者引起中老年男性部分雄激素缺乏綜合征(PartialAndrogenDeficiencyinAgingMale,PADAM)，該綜合征的特征為身體和智力領(lǐng)域的變化，該改變與雄激素環(huán)境有關(guān)，并能通過調(diào)節(jié)雄激素環(huán)境加以糾正。2002年國際老年男子研究學(xué)會(ISSAM)將這一綜合征重新命名為遲發(fā)性睪丸功能減退(lateonsethypogonadismin腿les，L0H)，把這種疾病界定為發(fā)生在中老年男子的一種與年齡相關(guān)的睪丸功能減退，并得到了國際男科學(xué)學(xué)會和歐洲泌尿科學(xué)會的認(rèn)同。他們認(rèn)為PADAM、男性雄激素缺乏癥(ADAM)、雄激素缺乏癥或繼發(fā)性睪丸功能減退是一種癥狀群，主要臨床表現(xiàn)特征是(1)早期征象是性欲和勃起質(zhì)量減退；(2)情緒改變伴有腦力和空間定向能力下降，容易疲勞、抑郁和易怒；(3)痩體量減少伴肌肉容積和肌力下降；(4)體毛減少和皮膚改變；(5)骨礦密度下降，引起骨量減少和骨質(zhì)疏松；(6)內(nèi)臟脂肪增加。上述癥狀不一定全部出現(xiàn)，其中某一種或幾種癥狀可能更為突出。PADAM最典型的生化特征是血清雄激素水平隨年齡老化而降低，不管是否存在基因組的敏感性降低，可出現(xiàn)多個(gè)器官或系統(tǒng)功能異常的癥狀和導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。雄激素中最主要的為睪丸酮，睪丸酮通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)和陰莖海綿體局部的作用調(diào)節(jié)性欲和勃起功能，外傷、手術(shù)或藥物去勢可導(dǎo)致性欲喪失和勃起功能障礙(ED)。在排除年齡、性激素結(jié)合球蛋白和雌二醇的影響后，睪丸酮有獨(dú)立的調(diào)節(jié)陰莖海綿體平滑肌松弛的作用。除了性分化和生殖器官的生長和發(fā)育外，睪丸酮對骨骼、肌肉、脂肪、情緒和認(rèn)知功能、性功能、血液和心血管等器官和系統(tǒng)都有重要的生理作用，睪丸酮缺乏將會導(dǎo)致這些器官和系統(tǒng)功能失常，出現(xiàn)一系列病理生理學(xué)改變。在本發(fā)明中，PADAM、ADAM與L0H的定義表述不影響本發(fā)明的限定，換言之，本發(fā)明的內(nèi)容涵蓋了用于改善和/或治療PADAM、ADAM與L0H所述的所有臨床癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國男子LOH的患病率隨年齡的增長而增高，4(T49歲約為13%，5(T69歲約為30%，70歲以上約為47%。目前，國際提倡PADAM患者進(jìn)行睪丸酮補(bǔ)充治療，如睪丸酮的脂肪酸酯(安特爾)、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍，通過外源性睪丸酮結(jié)構(gòu)類似物補(bǔ)充提高血中睪丸酮水平，維持正常的性活動(dòng)。由于涉及到不良的副作用，雄激素僅謹(jǐn)慎地用于治療和激素補(bǔ)充。事實(shí)上，雄激素通常僅用于對確診為原發(fā)性或繼發(fā)性雄激素缺失的男性進(jìn)行治療。顯然，雄激素的補(bǔ)充治療并非理想的可供長期使用的理想治療方案。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種從海洋螺類生物組織中提取的核肽復(fù)合物，該復(fù)合物具有天然的生理活性。本發(fā)明還提供核肽復(fù)合物的制備方法及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案如下-一種具有生理活性的核肽復(fù)合物，其特征在于，該核肽復(fù)合物是從海洋螺類生物組織中提取的，其成分包括每毫升含有無機(jī)氮820-980yg，無機(jī)磷61-85yg，不飽和脂質(zhì)0.2-1.0yg，水解氨基酸100.0-180.0ug，鳥嘌呤0.15-1.12ug，次黃嘌呤2.82-7.08yg，尿嘧啶4.90-12.85ug。以上列出的各類成分為本發(fā)明核肽復(fù)合物發(fā)揮生物效應(yīng)的主要物質(zhì)，其余為與治療作用無關(guān)或者暫時(shí)未知的雜質(zhì)成分，這部分物質(zhì)的存在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明并不會對本發(fā)明所述的治療作用帶來不良影響。優(yōu)選的，上述核肽復(fù)合物中還可添加有維生素E，使維生素E在終產(chǎn)品中的重量百分比為0.02-0.05%。一種具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下將海洋螺類生物的組織原料搗碎或粉碎，用溶劑提取，合并提取液，降溫使提取液溫度低于提取時(shí)的溫度，析出沉淀，取上層清液，濃縮去除溶劑，凈化處理，然后使用色譜柱層析分離洗脫得到核肽復(fù)合物。所述的海洋螺類生物為軟體動(dòng)物門新腹足目骨螺科生物；優(yōu)選脈紅螺、紅螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺；所述海洋螺類生物的組織為除螺殼外的全部組織，優(yōu)選其中的軀干組織、肝臟組織和/或生殖器官組織。所述原料可以為新鮮狀態(tài)，也可以為冷凍狀態(tài)。在確保原料生物活性的條件下，為使原料利于生物組織粉碎，優(yōu)選的原料處理溫度在0'C以下。所述的溶劑提取，提取次數(shù)不少于2次，以充分提盡所需物質(zhì)。所述的溶劑提取在10-4(TC范圍內(nèi)進(jìn)行，以保證不破壞原料中所含成分的生物活性。例如可以在室溫狀態(tài)進(jìn)行，也可在低于室溫的狀態(tài)下進(jìn)行。所述的降溫使低提取液溫度低于提取時(shí)的溫度，能夠使一類極性較小的雜質(zhì)析出，達(dá)到去除雜質(zhì)的作用，采用降低溫度的方法，方法簡便，成本低廉，是在一系列的試驗(yàn)基礎(chǔ)上摸索到的去除雜質(zhì)的優(yōu)選方法，優(yōu)選的，析出沉淀的溫度控制在0-l(TC。所述溶劑提取首次提取采用高濃度醇溶液，優(yōu)選的，用80—100%的乙醇提取，重復(fù)提取時(shí)采用較低濃度的醇溶液，優(yōu)選的，用30—60的％乙醇提取。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)采用不同的梯度濃度溶劑進(jìn)行提取，其提取效果要優(yōu)于使用相同濃度的溶劑，高濃度乙醇的溶解域較寬，第一次可提取大部分活性復(fù)合物，如果繼續(xù)用高濃度乙醇提取，提取液中活性復(fù)合物比例降低，絕大部分為雜質(zhì)。從盡量減少雜質(zhì)混入的角度考慮，后續(xù)提取選用低濃度乙醇繼續(xù)提取較好。優(yōu)選的，所述溶劑提取步驟中溶劑調(diào)節(jié)為酸性，pH4.0—6.5為佳。這樣，一方面可保證活性復(fù)合物提取完全，另一方面盡量控制雜質(zhì)混入提取液中?？梢杂名}酸或有機(jī)酸調(diào)節(jié)溶劑為酸性，本發(fā)明優(yōu)選采用有機(jī)酸調(diào)節(jié)提取溶劑為酸性，具體優(yōu)選的有機(jī)酸為乙酸或甲酸。溶劑調(diào)節(jié)為酸性時(shí)提取效果很好，可有效去除糖類、色素、膽固醇氧化產(chǎn)物及其酯等雜質(zhì)部分。本發(fā)明具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，所述的凈化處理分兩步，先用凈化劑與提取液以體積比(1-5):l混合，除去極性最小的一部分雜質(zhì)，然后用活性炭處理，脫去色素。優(yōu)選的，凈化劑選自正己烷、環(huán)己烷、石油醚之一或組合，凈化處理中活性炭用量為l-5%wt，進(jìn)一步優(yōu)選的，活性炭用量為2y。wt。優(yōu)選的，在凈化處理后，加入維生素E，使維生素E在終產(chǎn)品組合物中的重量百分比為0.02-0.05%。這樣可以保護(hù)復(fù)合物在制備過程中不受氧化破壞。本發(fā)明具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠，優(yōu)選的，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠LH20(s印hadexLH20)。該吸附材料具有樣品損失少，分離效果好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，柱層析洗脫液為醇-水復(fù)合溶劑，優(yōu)選的，醇為甲醇、乙醇或丙醇，進(jìn)一歩優(yōu)選使用甲醇，其中，復(fù)合溶劑中甲醇與水的體積比為5:(1-5)。優(yōu)選的，調(diào)節(jié)洗脫液為酸性，可以大幅度提高洗脫效率。優(yōu)選用乙酸調(diào)節(jié)洗脫液為酸性。本發(fā)明具有生理活性的核肽復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，其特征在于是在制備用以治療、預(yù)防、改善PADAM患者的癥狀的藥用物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中老年男性部分雄激素缺乏綜合征過程中出乎意料的發(fā)現(xiàn)，源自海洋生物的一類核肽復(fù)合物具有強(qiáng)大的生理活性。這種生理活性集中體現(xiàn)在能夠調(diào)節(jié)機(jī)體自身有效促進(jìn)血循環(huán)中雄激素，特別是雄激素中最主要的睪丸酮的釋放，通過給男性患者施予該復(fù)合物及以該復(fù)合物的制劑，可有效治療、預(yù)防、改善、抑制或減少該患者由于PADAM引起的性功能障礙、性欲減退、勃起功能障礙、性腺機(jī)能減退、少肌癥、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、認(rèn)知和情緒變化、抑郁癥、貧血、毛發(fā)脫落、良性前列腺增生或前列腺癌的癥狀。本發(fā)明提供的核肽復(fù)合物可單獨(dú)應(yīng)用，也可將核肽復(fù)合物與其他藥物組合應(yīng)用。還可通過采用藥學(xué)上可接受的輔料組合制成藥學(xué)上可以接受的各種制劑，如片劑、膠囊、貼劑、膜劑、凝膠劑、鼻噴劑、注射劑等。本發(fā)明具有生理活性的核肽復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，可采用醫(yī)學(xué)上可以接受的任何方式，如口服、透皮吸收、注射(靜脈注射、肌肉注射、皮下注射)、黏膜吸收、腔道吸收等。在本發(fā)明中，所述的核肽復(fù)合物以單獨(dú)使用、與其他藥物聯(lián)合使用、添加輔料制成制劑的使用時(shí)，可以在治療期連續(xù)每日給藥，也可以間歇給藥。核肽復(fù)合物有效劑量以每日服用多少毫克核肽復(fù)合物來計(jì)算，一名正常體重的男性患者可采用每日劑量為10mg/天2000mg/天，給藥途徑的不同會導(dǎo)致給藥劑量的不同，例如注射使用的劑量比口服使用該復(fù)合物藥劑的劑量小。為了更好說明本發(fā)明核肽復(fù)合物的獨(dú)特性，對復(fù)合物的成分進(jìn)行化學(xué)分析，分析數(shù)據(jù)見下表l。表ut發(fā)明提供的核肽復(fù)合物的成分分析(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從上表中顯示，本發(fā)明核肽復(fù)合物的構(gòu)成有別于現(xiàn)有的所有藥物。核肽復(fù)合物中的磷、嘌呤和嘧啶反映了其中含有的核苷酸；氮、水解氨基酸反映了其中含有的蛋白成分；此外該復(fù)合物中還含有一定量的不飽和脂質(zhì)。本發(fā)明提供的具有生理活性核肽復(fù)合物及其方法的優(yōu)良效果在于-1.采用了溫度控制的提取設(shè)備，通過在原料預(yù)處理、提取、凈化過程溫度的調(diào)節(jié)，一方面保證了生物原料的活性不受破壞，另一方面達(dá)到了去除雜質(zhì)的目的；2.所選擇的復(fù)合物凈化、精制的方法為不同方式的組合，操作簡便，且凈化效果顯著。3.采用溶劑提取和色譜層析的方法聯(lián)用，保證了原料中生物活性成分的利用完全，并且獲得純度較高的核肽復(fù)合物，顯示了極其顯著的生理性特性。4.本發(fā)明的特點(diǎn)還于本發(fā)明提供的核肽復(fù)合物本身并非激素，與雄激素補(bǔ)充療法具有本質(zhì)不同；本發(fā)明核肽復(fù)合物可以顯著提高血循環(huán)中游離睪丸酮水平。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行闡述，但并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1取100g紅螺組織(軀干、肝臟、生殖器官)在冷凍狀態(tài)下?lián)v碎，加10倍量95%乙醇提取lh，過濾，再用50%酸性乙醇攪拌提取311，過濾，合并兩次提取液，放冷，析出沉淀，傾出上層清液，濃縮，用3倍量己垸處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于4(TC，加入維生素E使終濃度到0.03y。，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:3甲醇-水復(fù)合溶劑(用乙酸調(diào)節(jié)洗脫液為酸性)洗脫得到核肽復(fù)合物。經(jīng)化學(xué)分析檢測，所得到核肽復(fù)合物成分包括每毫升含有無機(jī)氮900ug，無機(jī)磷85Pg,不飽和脂質(zhì)0.8yg，水解氨基酸120.0"g，鳥嘌呤O.15"g，次黃嘌呤2.82yg，尿嘧啶5.90ug。實(shí)施例2取100g脈紅螺全部組織在冷凍狀態(tài)下?lián)v碎，加10倍量50%乙醇，用乙酸調(diào)pH值不小于4.5，在一個(gè)帶有混合攪拌功能的容器中提取2h，過濾，濃縮，放冷析出沉淀，傾出上清液，用3倍量己烷處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于40°C，加入0.02%維生素E，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:2甲醇-水復(fù)合溶劑洗脫得到核肽復(fù)合物。經(jīng)化學(xué)分析檢測，所得到核肽復(fù)合物成分包括每毫升含有無機(jī)氮850yg，無機(jī)磷85ug，不飽和脂質(zhì)O.5ng，水解氨基酸160.0pg,鳥嘌呤1.10ug，次黃嘌呤5.82ug,尿嘧啶10.85ug。實(shí)施例3取100g骨螺組織(軀干、肝臟、生殖器官)在冷凍狀態(tài)下?lián)v碎，加8倍量80%乙醇，用乙酸調(diào)PH值不小于4.5，攪拌提取3h，過濾，濃縮至原體積的1/10，放冷析出沉淀，傾出上清液，用3倍量己垸處理，棄去己烷層，下層脂蛋白層用2%活性炭純化，超濾，濃縮，操作溫度始終保持低于40'C，加入0.03。/。維生素E，減壓濃縮去除溶劑，得到粗品，再用s印hadexLH20柱層析分離，體積比為5:4乙醇-水復(fù)合溶劑(用乙酸調(diào)節(jié)洗脫液為酸性)洗脫得到核肽復(fù)合物。經(jīng)化學(xué)分析檢測，所得到核肽復(fù)合物成分包括每毫升含有無機(jī)氮830yg，無機(jī)磷70yg，不飽和脂質(zhì)O.6pg，水解氨基酸120yg，鳥嘌呤1.0yg，次黃嘌呤7.08ng，尿嘧啶12.85iig。實(shí)施例4:實(shí)施例1的核肽復(fù)合物藥用制劑核肽復(fù)合物10mg;淀粉17mg;糖粉18mg;糊精15mg;47%乙醇適量(制軟材用)；硬脂酸鎂0.6g，制成片劑。實(shí)施例5:實(shí)施例2的核肽復(fù)合物藥用制劑核肽復(fù)合物2mg，加入0.02。/。維生素E，加入10%乙醇溶液溶解，超濾，滅菌，灌裝入2ml安瓶，-3(T-4(TC凍干，封口，制成注射凍干粉。實(shí)施例6:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例所用核肽復(fù)合物為實(shí)施例1-3獲得的產(chǎn)品。考察本發(fā)明提供的核肽復(fù)合物對老年大鼠睪丸酮水平的影響。取老年雄性大鼠，每日肌內(nèi)注射藥物O.1rag/kg體重，給藥10天，同時(shí)取成年大鼠按照相同劑量給藥，對照組每曰按照相同劑量給予生理鹽水。用放射免疫法測定血中睪丸酮水平。在正常情況下，老年大鼠和成年大鼠的睪丸酮水平都在nmo1/1級，老年大鼠的血中睪丸酮水平約為成年大鼠正常值的十分之一。實(shí)驗(yàn)見表2，結(jié)果表明在給予本發(fā)明核肽復(fù)合物后，老年大鼠的血中睪丸酮相比給藥前水平提高了10倍，達(dá)到了與成年雄鼠相當(dāng)甚至更高的水平。另外試驗(yàn)中令人驚喜地發(fā)現(xiàn)該核肽復(fù)合物并不影響正常成年大鼠的睪丸酮水平。結(jié)果提示本發(fā)明藥物可以明顯提高PADAM的血槳睪丸酮水平，這種作用與雄激素補(bǔ)充療法不同，是通過調(diào)節(jié)機(jī)體自身睪丸酮的釋放達(dá)到改善PAD層患者的臨床癥狀，體現(xiàn)了不同于已有抗PADAM藥物的獨(dú)特機(jī)理，并且服藥方便，效果顯著。同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合物安全性高，并不會影響正常動(dòng)物的荷爾蒙水平。表2:核肽復(fù)合物對大鼠血漿睪丸酮水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種具有生理活性的核肽復(fù)合物，其特征在于，該核肽復(fù)合物是從海洋螺類生物組織中提取的，其成分包括每毫升含有無機(jī)氮820-980μg，無機(jī)磷61-85μg，不飽和脂質(zhì)0.2-1.0μg，水解氨基酸100.0-180.0μg，鳥嘌呤0.15-1.12μg，次黃嘌呤2.82-7.08μg，尿嘧啶4.90-12.85μg。2、一種如權(quán)利要求1所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下將海洋螺類生物的組織原料搗碎或粉碎，用溶劑提取，合并提取液，降溫使提取液溫度低于提取時(shí)的溫度，析出沉淀，取上層清液，濃縮去除溶劑，凈化處理，然后使用色譜柱層析分離洗脫得到核肽復(fù)合物。3、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的海洋螺類生物為軟體動(dòng)物門新腹足目骨螺科生物；優(yōu)選脈紅螺、紅螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺；所述海洋螺類生物的組織為除螺殼外的全部組織，優(yōu)選其中的軀干組織、肝臟組織和/或生殖器官組織。4、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取，在10-4(TC范圍內(nèi)進(jìn)行，提取次數(shù)不少于2次，優(yōu)選的，首次提取采用80—100%的高濃度醇溶液提取，重復(fù)提取時(shí)采用較低濃度的30—60%的醇溶液。5、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述溶劑提取步驟中溶劑調(diào)節(jié)為酸性，優(yōu)選的pH4.06.5;可以用鹽酸或有機(jī)酸調(diào)節(jié)溶劑為酸性，優(yōu)選的有機(jī)酸為乙酸或甲酸。6、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的凈化處理分兩步，先用凈化劑與提取液以體積比(1-5):l混合，然后用活性炭處理，脫去色素；優(yōu)選的，凈化劑選自正己烷、環(huán)己烷、石油醚之一或組合，凈化處理中活性炭用量為卜5it，優(yōu)選的，活性炭用量為2%wt。7、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，在凈化處理后，加入維生素E，使維生素E在終產(chǎn)品組合物中的重量百分比為0.02-0.05%。8、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠，優(yōu)選的，柱層析吸附材料為葡聚糖凝膠LH20(s印hadexLH20)。9、如權(quán)利要求2所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，柱層析洗脫液為醇-水復(fù)合溶劑，優(yōu)選的，醇為甲醇、乙醇或丙醇，進(jìn)一步優(yōu)選使用甲醇，其中，復(fù)合溶劑中甲醇與水的體積比為5:(1-5)。10、權(quán)利要求l所述的具有生理活性的核肽復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，其特征在于是在制備用以治療、預(yù)防、改善PADAM患者的癥狀的藥用物質(zhì)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種從海產(chǎn)螺中提取制備天然的生理活性復(fù)合物，以及該復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明保護(hù)一種生理活性核肽復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，該生理活性復(fù)合物是從海洋螺類生物組織中提取，具有獨(dú)特的生理活性，可顯著提高PADAM患者血中睪丸酮的水平。文檔編號A61K38/02GK101240015SQ20081001473公開日2008年8月13日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者亞斯尼,依士丘克,劉可春,契克曼·伊萬,康尼維特·娜塔麗婭,柳高夫斯卡,考米沙林科·謝爾蓋,莫伊謝耶娃·柳米拉,達(dá)特森科·卓婭,韓利文申請人:山東省科學(xué)院生物研究所