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多巴胺d的制作方法
專利名稱:多巴胺d的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及多巴胺D3受體激動(dòng)劑用于生產(chǎn)診斷和治療鹽依賴性高血壓用的藥物產(chǎn)品的用途。
盡管腎缺陷的準(zhǔn)確原因還不太清楚,但是已有人提出在某些類型的主要高血壓中腎多巴胺受體功能和腎鈉排泄減弱之間的關(guān)系(參見T.Hussain等,Hypertension,1998,32187-197)。
在人群中有約10-15%患鹽依賴性高血壓。診斷必需約定要求患者進(jìn)食幾周低鹽膳食,這樣當(dāng)為鹽依賴性高血壓時(shí)高血壓將降低。然而,難處之一是患者經(jīng)常不能連續(xù)地保持這種膳食,這樣難以作出可信的診斷。即使已經(jīng)診斷出來,但是經(jīng)常不能保證患者永遠(yuǎn)保持低鹽膳食。
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)能夠簡單地診斷和治療鹽依賴性高血壓的藥物產(chǎn)品。
我們已驚奇發(fā)現(xiàn),多巴胺D3受體激動(dòng)劑適合于生產(chǎn)診斷和治療鹽依賴性高血壓的藥物產(chǎn)品。
合適的多巴胺D3受體激動(dòng)劑原則上是所有對該受體亞類具有選擇性的激動(dòng)劑。這種激動(dòng)劑的一個(gè)實(shí)例是R(+)-7-羥基-2-二丙基氨基四氫萘(7 OH-DPAT)。特別合適的激動(dòng)劑是顯示高的周圍血漿水平的那些。
通過各種動(dòng)物試驗(yàn)已可以證實(shí)該效果。
Dahl大鼠(參見Dahl等,Nature 1962,194480-482)代表鹽依賴性高血壓的動(dòng)物模型??梢酝ㄟ^高鹽膳食在所謂的鹽敏性Dahl大鼠(即使它們還比較幼小)中誘導(dǎo)高血壓,而在所謂的鹽抗性Dahl大鼠中不產(chǎn)生這種效果。
然而在鹽抗性Dahl大鼠中,給予多巴胺D3受體激動(dòng)劑7 OH-DPAT使得腎小球?yàn)V過速率、尿鈉排泄和排泄體積增加,而在鹽敏性Dahl大鼠中給藥對腎功能沒有影響。
鹽抗性Dahl大鼠和鹽敏性Dahl大鼠的多巴胺D3受體mRNA測定證實(shí),在鹽敏性Dahl大鼠中該mRNA的表達(dá)比鹽抗性Dahl大鼠中少60%。
同樣地,與來自鹽抗性Dahl大鼠的腎的相應(yīng)制品相比,在來自鹽敏性Dahl大鼠的腎的膜制品中結(jié)合放射性標(biāo)記的選擇性多巴胺D3配體[3H]-7-OH-DPAT的能力降低約50%。
在鹽抗性大鼠(定義為當(dāng)它們接受高鹽膳食時(shí)不患高血壓)中,當(dāng)這些動(dòng)物接收亞慢性給予選擇性多巴胺D3受體拮抗劑5-氨基-3-(4-(4-(2-叔丁基-6-三氟甲基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-甲基-丁-2-烯-1-基巰基)-4-甲基-1,2,4(4H)-三唑同時(shí)接收高鹽膳食時(shí),發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血壓顯著增加。
由這些發(fā)現(xiàn)可以推斷出在鹽依賴性高血壓發(fā)展中起決定性的是多巴胺D3受體。
可以將多巴胺D3受體激動(dòng)劑用于診斷鹽敏性形式的高血壓。這是在標(biāo)準(zhǔn)化條件下通過口服或非腸道給予D3激動(dòng)劑并測定尿量和鈉排泄進(jìn)行的。尿量和鈉排泄增加將說明正常反應(yīng);沒有這種反應(yīng)將指示為鹽敏性高血壓。這種區(qū)別對接下來的治療判斷是重要的。
為了生產(chǎn)藥物產(chǎn)品,可以將所述D3受體激動(dòng)劑加工成常規(guī)藥物劑量形式,例如口服、非腸道、皮下、腹膜內(nèi)或局部給藥用。合適形式是例如片劑、膠囊劑、輸液和注射用的溶液、可飲用的形式或噴霧劑。
就所需的給藥形式而言,除了該活性組分之外,該新型藥劑合適地含有常規(guī)載體和稀釋劑。就局部外用給藥而言,可以使用藥用賦形劑如乙醇、異丙醇、乙氧基化蓖麻油、乙氧基化氫化蓖麻油、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚硬脂酸乙二酯、乙氧基化脂肪醇、液體石蠟、礦脂和羊毛脂。就內(nèi)部給藥而言,合適的賦形劑例如有乳糖、丙二醇、乙醇、淀粉、滑石粉和聚乙烯基吡咯烷酮。
還可以含有抗氧化劑如生育酚和丁基化的羥基苯甲醚和丁基化羥基甲苯、味道改進(jìn)添加劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和潤滑劑。
除活性組分外包含于制劑中的物質(zhì)以及生產(chǎn)藥物制劑所用的物質(zhì),是毒理學(xué)可接受的并且可以與各種活性組分相容。藥用制劑是以常規(guī)方式生產(chǎn)的,例如通過將活性組分與其它常規(guī)載體和稀釋劑混合。
試驗(yàn)用正常血壓的Sprague-Dawley大鼠和兩個(gè)動(dòng)脈高血壓的動(dòng)物模型,Okamoto種的自發(fā)高血壓大鼠(SHR)和鹽敏性Dahl大鼠(DS)進(jìn)行研究。
將雄性SHR大鼠(n=8)及其對照組、雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY),(n=8),8-10周齡,體重為180-260g,給食正常大鼠飼料,自由接近自來水。雄性DS大鼠(n=10)及其正常血壓對照、鹽抗性Dahl大鼠(DR,n=10),6-7周齡且體重為100-150g,在清除率試驗(yàn)之前接受22-25天補(bǔ)充有4wt%氯化鈉的大鼠飼料,同樣地自由接近自來水。
清除率試驗(yàn)通過腹膜內(nèi)注射硫噴妥鈉(80mg/kg體重;來自Byk Gulden,Konstanz,DE的Trapanal)將這些大鼠麻醉并將它們放置在溫?zé)岬胤揭员闶怪蹦c的溫度為37.1℃。為了便于自發(fā)呼吸而實(shí)施氣管切開術(shù)。將兩根導(dǎo)管導(dǎo)入右頸靜脈。將林格氏鹽水(111mmol NaCl,30mmolNaHCO3,4.7mmol KCl)通過第一根導(dǎo)管以1.5-3.0ml/h的速度注入,相當(dāng)于0.8%體重。在整個(gè)試驗(yàn)中,將溶于林格氏溶液中的[3H]-菊粉(1.2μCi/ml)通過第二根導(dǎo)管以0.6ml/h的速度注入,以便測定腎小球?yàn)V過速率。
將一套管針插入左頸動(dòng)脈中以采血樣并連續(xù)測定全身血壓。通過膀胱導(dǎo)管取出尿樣品。在該操作持續(xù)80-100分鐘期間讓大鼠休息之后,測定兩個(gè)各自20分鐘的連續(xù)清除階段以確定其基線。然后將林格氏鹽水的注入換成兩個(gè)分別為0.01-0.1μg/kg體重/分鐘的劑量注入D3受體激動(dòng)劑R(+)-7-羥基-2-二丙基氨基四氫萘溶于林格氏溶液的溶液。然后再次注入林格氏溶液,并在10分鐘之后進(jìn)行清除階段。在每個(gè)20分鐘清除階段的10分鐘之后取出180μl血樣。
通過腎[3H]-菊粉清除的方式測定腎小球?yàn)V過速率(GFR)。在該試驗(yàn)期間連續(xù)地測定平均動(dòng)脈血壓(MAP)和心率(HR)。在結(jié)束清除率試驗(yàn)之后,取出腎,放血并稱重。通過重量法測定尿量。將血樣離心并測定血細(xì)胞比容。使用由Eppendorf,Hamburg供應(yīng)的ELEX6361設(shè)備通過火焰光度法測定尿和血漿中的鈉濃度。通過液相閃爍法測定3H-菊粉放射活性。
結(jié)果顯示,在自發(fā)高血壓大鼠、正常血壓WKY大鼠和鹽抗性Dahl大鼠中對給藥選擇性D3受體激動(dòng)劑產(chǎn)生一致且劑量依賴性反應(yīng)。在這三組中的尿鈉增加、利尿和腎小球?yàn)V過速率增加與鹽敏性Dahl大鼠的結(jié)果明顯相反。在這種動(dòng)物中沒有觀察到因多巴胺D3受體刺激引起的腎功能變化。
多巴胺D3-mRNA和[3H]-7-OH-DPAT在腎組織中結(jié)合的研究為得到腎組織先將大鼠麻醉,使用無菌操作材料將腎暴露、取出、稱重并去掉被膜。
用RT-PCR測定腎組織中的多巴胺D3-mRNA(RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng))在冷至4℃的HEPES下用無菌解剖刀沿前后向?qū)蓚€(gè)Dahl種(DS和DR)、和SHR和WKY大鼠的腎分開(Terada等,1993)。將腎分成大小相等的3個(gè)橫片并且最初在液氮中搖蕩冷凍于1.5ml Eppendorf管中然后在-80℃下貯藏直到進(jìn)一步制備RNA。通過Chomczynski和Sacchi的方法(1987)分離RNA。對此將組織在有酸性苯酚/氯仿混合物的情況下勻化并離心。上面水相含有該RNA。將其用異丙醇從殘余苯酚中純化并用乙醇沉淀的。然后可以加到DEPC-H2O中并在量化之后用于RT-PCR。所有步驟都是在無菌條件下進(jìn)行的,并預(yù)防RNA酶污染。
在15μl混合物中將500ng的總RNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。接下來的RT-PCR所用的引物按照文獻(xiàn)或者借助基因數(shù)據(jù)庫中的公開序列進(jìn)行選擇并通過MWG-生物技術(shù)公司(Ebersberg)合成。通過Wong等(1994)所述的“引物滴下”法進(jìn)行D3受體mRNA表達(dá)的相對定量。在第一階段,將靶序列通過特定次循環(huán)擴(kuò)增,以便在第二階段中,在β-肌動(dòng)蛋白的情況下加入擴(kuò)增管家基因用的引物對,并且使該P(yáng)CR繼續(xù)其它循環(huán)。
在各種樣品的PCR之后比較信號(hào)強(qiáng)度顯示,在DS大鼠中的表達(dá)與其對照、DR大鼠中的表達(dá)存在顯著差異。DS大鼠顯示表達(dá)顯著降低約60%。各用三只大鼠,每只進(jìn)行三次RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行研究(n=3/9)。將WKY與SHR直接比較證實(shí)表達(dá)略有增加,但沒有達(dá)到顯著水平。然而將DS大鼠與WKY和SHR大鼠比較顯示,D3-mRNA表達(dá)的顯著差異更大。
7-OH-DPAT結(jié)合在正常和高鹽膳食之后將兩個(gè)Dahl種(DS和DR)的動(dòng)物的腎在麻醉下取出之后直接于緩沖溶液(TRIS 25mM/HEPES 40mM(pH4.7)、蔗糖320mM、BDTA 0.5mM)中勻化并在1000xg下離心15分鐘(4℃)。棄去上清液之后,將離心丸再次懸浮于緩沖液中并再次離心。將第二次的上清液在100,000xg下離心30分鐘(4℃)。將最后的離心丸再次懸浮于沒有蔗糖和EDTA的緩沖液中并在-80℃下貯藏直到進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。用100mg膜蛋白進(jìn)行結(jié)合研究。用0.5-50nM[3H]-7-OH-DPAT進(jìn)行飽和試驗(yàn),使用10μM未標(biāo)記的7-OH-DPAT測定非特異性結(jié)合。特異性結(jié)合是通過總結(jié)合減去非特異性結(jié)合計(jì)算得到的。
表示配體對其受體的親和力的離解常數(shù)(KD)未顯示出顯著差異并且對兩個(gè)Dahl種而言都為約10nM。而在DS中的特異性結(jié)合(bmax)比在DR中顯著的低。其差異當(dāng)大鼠預(yù)先接受高鹽膳食時(shí)更清楚。在這種情況下,DS大鼠的特異性結(jié)合僅為DR動(dòng)物的值的50%。
在鹽抗性Dahl大鼠中通過抑制多巴胺D3受體誘導(dǎo)鹽依賴性動(dòng)脈高血壓將正常膳食下的鹽抗性Dahl大鼠(DR)用多巴胺D3拮抗劑5-氨基-3-(4-(4-(2-叔丁基-6-三氟甲基)嘧啶-4-基)哌啶-1-基)-2-甲基丁-2-烯-1-基巰基)-4-甲基-1,2,4(4H)-三唑以40mg/kg/天的劑量經(jīng)飲用水處理1周。在這周之前和結(jié)束時(shí)通過尾體積法(Schwanzplethysmometrie)測定動(dòng)脈血壓。然后隨意給動(dòng)物喂食高鹽膳食(飼料中4%重量NaCl)。在開始試驗(yàn)之后每周測定動(dòng)脈血壓并持續(xù)4周。
實(shí)驗(yàn)表明,正常鹽膳食下用多巴胺D3拮抗劑處理動(dòng)物對血壓沒有引起變化(值為約100mmHg)。然而,在高鹽膳食下處理時(shí)動(dòng)脈壓逐漸增加,在第29天平均最大值為148mmHg,仍未達(dá)到最高狀態(tài)。
權(quán)利要求
1.多巴胺D3受體激動(dòng)劑用于生產(chǎn)診斷和治療鹽依賴性高血壓的藥物產(chǎn)品的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途,其中將R(+)-7-羥基-2-二丙基氨基四氫萘用作多巴胺D3受體激動(dòng)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及多巴胺D
文檔編號(hào)A61K31/137GK1387450SQ00815203
公開日2002年12月25日 申請日期2000年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月4日
發(fā)明者B·米爾鮑爾 申請人:艾博特股份有限兩合公司
產(chǎn)品知識(shí)
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