專利名稱：具有免疫刺激劑活性的植物提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有免疫刺激劑活性的植物提取物。
背景技術(shù)：
已通過如下程序生產(chǎn)了生物活性的多糖，即搗碎馬鈴薯球莖的芽、用沸水進(jìn)行提取、在20℃維持16-18小時(shí)、分離提取物、放置不少于20日、根據(jù)分子量進(jìn)行分級(jí)分離和提取具有超過10000道爾頓分子量的物質(zhì)，隨后進(jìn)行濃縮和干燥(RU 2108800 C1，A61K 35/78，20.04.1998)。在該途徑中產(chǎn)生的物質(zhì)具有抗病毒和抗細(xì)菌活性。
已通過如下程序生產(chǎn)了具有免疫刺激活性的多糖，即用含水的甲醛處理植物材料、置于含水的酸中、用含水的草酸銨提取果膠多糖并凍干。將新鮮的水生有花植物如浮萍屬(Lemna spp)雜草的任何物種和高等植物如Oberna behen(L)精細(xì)剪切的“水面上”部分用作原材料(RU2149642 C1，A61K 35/78，27.05.2000)。
L.A.Chekanovskaya和A.V.Generalov公開了來自馬鈴薯Solanumtuberosum芽的提取物和生物活性制劑“γ-植物”特征，參見Chem.Pharm Journal(2000) 34(3)51-56。其生產(chǎn)包括搗碎原材料、用沸水進(jìn)行提取、對(duì)水相提取物進(jìn)行離心、用丙酮進(jìn)行濃縮和沉淀、精制和干燥終產(chǎn)物。精制是常規(guī)的，且包含透析、在AcA44上的凝膠過濾、離子交換層析和在最終階段的HPLC。用該方法產(chǎn)生的物質(zhì)是分子量為70kD的糖蛋白，該糖蛋白包含90％的糖類和10％的蛋白質(zhì)。γ-植物中的糖類部分由70％葡萄糖、3.7％阿拉伯糖、2.08％木糖、6.84％半乳糖、0.58％甘露糖、1％氨基糖(aminosaccharide)和5.1％糖醛酸組成。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，可從薯蕷科、車前科或茄科搗碎的植物原材料中提取具有免疫刺激、抗病毒和抗細(xì)菌活性的新物質(zhì)。具體地，將水相提取物進(jìn)行離心，然后在氯化鈉存在時(shí)用96％的乙醇濃縮和沉淀。將沉淀溶解并再次用鹽或酸進(jìn)行沉淀，并將這樣獲得的粗酸性肽聚糖用堿或堿金屬鹽的飽和溶液進(jìn)行處理；將純化的酸性肽聚糖用凝膠層析進(jìn)行精制，然后進(jìn)行干燥。
這種依賴于特定操作順序的方法得到了具有強(qiáng)的免疫刺激、抗病毒和抗細(xì)菌活性的新物質(zhì)，且該物質(zhì)是分子量為1200-40000kD且葡萄糖對(duì)糖醛酸的重量比例為1到2-4的水溶性酸性肽聚糖。一種藥物組合物可包含該肽聚糖連同一種或多種藥物可接受的填充物和/或載體。
優(yōu)選實(shí)施方案描述給定的方法優(yōu)選應(yīng)用植物的葉、莖、根、球莖和/或芽?？蓱?yīng)用植物在其發(fā)育到成熟的任何階段的不同部分。
在次級(jí)沉降過程中，優(yōu)選地將溴棕三甲銨和氯化鈣用作鹽?？蓪⒂袡C(jī)或無機(jī)酸或酸性非有機(jī)鹽用作酸性劑。次級(jí)沉降使得粗酸性肽聚糖能夠同各種伴隨的多糖和蛋白質(zhì)相分離。
酸性肽聚糖產(chǎn)物可用如凝膠層析進(jìn)行純化；TSK HW-75F、瓊脂糖2B或4B CL是適當(dāng)?shù)膶游鰟?br> 新物質(zhì)的肽部分構(gòu)成了全部肽聚糖分子質(zhì)量的13±3％。用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用勞里方法測(cè)量了肽的量(Lowry等人，J.Biol.Chem(1951)193265-275)。獲得了如表1所示的分析(顯示了5種主要的氨基酸)。
表1
分子的多糖部分發(fā)現(xiàn)由下面成分組成半乳糖醛酸 18±6％葡萄糖 9±3％半乳糖 5.5±2％甘露糖 0.7±0.25％阿拉伯糖3.8±1.3％鼠李糖 1.9±0.9％酸性糖根據(jù)在濃縮硫酸中與3，5-二甲基苯酚的顏色反應(yīng)確定(Usov等人，Botanica Marina(1995)，3843-51)。應(yīng)用糖醛酸的氣液層析法(GLC)發(fā)現(xiàn)在酸性肽聚糖中半乳糖醛酸主要以3-甲基甲硅烷基衍生物的形式存在(Albersheim，Methods Enzymol.(1987)1183-40)。用多元醇乙酸鹽形式的糖的GLC分析探測(cè)中性糖(Ablersheim，同上)。
如在下文中報(bào)道的結(jié)果所顯示的，本發(fā)明的物質(zhì)具有各種有益的性質(zhì)。它可用于人或其他哺乳動(dòng)物或動(dòng)物疾病的治療(包括預(yù)防)，該疾病可由任何增強(qiáng)的抗體合成或活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK-細(xì)胞、粒細(xì)胞或細(xì)胞因子或干擾素合成來改善。這種疾病是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在應(yīng)用中，該物質(zhì)一般將制備為包含可接受的載體的藥物組合物。適當(dāng)?shù)妮d體(可為液體的)的例子是本領(lǐng)域中眾所周知的，且將根據(jù)所需給藥途徑進(jìn)行選擇。途徑和同樣的劑量可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)通常的因素進(jìn)行選擇，該因素如疾病的嚴(yán)重性、患者的狀況、其他治療等。對(duì)這些因素的指南由下文的實(shí)施例提供。
下面的實(shí)施例闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1使來自薯蕷科的山藥(dioscorea)(D.cuacasia Lipsky)根部分的植物細(xì)胞生長于培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)，通過過濾分離細(xì)胞物質(zhì)，并將上清液濃縮、用蒸餾水進(jìn)行透析及冷凍干燥。
將500ml蒸餾水加入到從培養(yǎng)液中產(chǎn)生的5g干燥混合物中。在室溫進(jìn)行3小時(shí)的提取。用離心將不溶的沉淀除去。將上清液濃縮到200ml的體積；將200mg氯化鈉溶解于其中，然后添加600ml 96％的乙醇。通過在4000rpm離心30分鐘提取沉淀。然后將沉淀用50ml 96％的乙醇洗滌、離心并在氣流中干燥。
通過在室溫混合1小時(shí)而將如上所述獲得的1g干產(chǎn)物在200ml蒸餾水中稀釋。向該溶液中加入5ml 10％的三氯乙酸溶液。將結(jié)果所得的沉淀即酸性粗肽聚糖通過離心進(jìn)行分離，并用水進(jìn)行洗滌。然后加入50ml蒸餾水，且在混合的同時(shí)，逐滴加入25％的氨溶液直到實(shí)現(xiàn)沉淀的完全溶解。
將產(chǎn)生的溶液引入到TSK HW-75F柱中以進(jìn)行凝膠層析。用水使級(jí)分從柱子中洗脫。收集分子量在1200和40000kD之間的第一個(gè)高分子量峰。將該級(jí)分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮并凍干。
酸性肽聚糖的產(chǎn)量為39mg。葡萄糖與糖醛酸的重量比例為1∶3。肽含量為11.2％。
實(shí)施例2將100g來自薯蕷科的山藥(Q.cuacasia Lipsky)新鮮的莖搗碎。加入500ml蒸餾水，并將搗碎的產(chǎn)物在30-40℃進(jìn)行5小時(shí)的提取。將混合物用機(jī)械壓力擠壓，并將水相提取物收集、透析并用蒸發(fā)器將其濃縮至100ml體積。向濃縮物中加入100mg氯化鈉，然后也加入300ml 96％的乙醇。通過在4000rpm離心30分鐘提取沉淀。然后將沉淀用30ml 96％的乙醇洗滌、離心并在氣流中干燥。
通過在室溫混合1小時(shí)而將上面獲得的1g干燥沉淀在200ml蒸餾水中稀釋。去除不溶性部分并向上清液添加5ml濃縮的HCl。將結(jié)果所得的沉淀通過離心進(jìn)行分離并在水在中進(jìn)行洗滌。然后加入50ml蒸餾水，且在混合的同時(shí)，逐滴加入25％的氨溶液直到實(shí)現(xiàn)沉淀的完全溶解。
用水使級(jí)分從柱子中洗脫。收集分子量在1200和40000kD之間的第一個(gè)高分子量峰。將該級(jí)分在蒸發(fā)器中濃縮并然后凍干。
酸性肽聚糖的產(chǎn)量為16mg。葡萄糖與糖醛酸的重量比例為1∶2.2。肽含量為14.7％。
實(shí)施例3將100g來自車前科(P.major L.)的新鮮收獲的車前草葉在500ml蒸餾水中搗碎，并在30-40℃加熱的同時(shí)進(jìn)行4小時(shí)的提取。將混合物用機(jī)械壓力擠壓，并將水相提取物收獲、透析并用蒸發(fā)器將其濃縮至100ml體積。向濃縮物中加入100mg氯化鈉，然后也加入300ml 96％的乙醇。通過在4000rpm離心30分鐘提取沉淀。然后將沉淀用30ml96％的乙醇洗滌、離心并在氣流中干燥。
通過在室溫混合1小時(shí)而將1g干產(chǎn)物在200ml蒸餾水中稀釋。去除不溶性部分并向上清液添加5ml濃縮的HCl。將產(chǎn)生的沉淀通過離心進(jìn)行分離并在水在中進(jìn)行洗滌。然后加入50ml蒸餾水，且在混合的同時(shí)，逐滴加入25％的氨溶液直到實(shí)現(xiàn)沉淀的完全溶解。
將結(jié)果所得的溶液引入到TSK HW-75F柱中以進(jìn)行凝膠層析。用水使級(jí)分從柱子中洗脫。收集分子量在1200和40000kD之間的第一個(gè)高分子量峰。將該級(jí)分在蒸發(fā)器中濃縮并然后凍干。
酸性肽聚糖的產(chǎn)量為16mg。葡萄糖與糖醛酸的重量比例為1∶2.7。肽含量為13.8％。
實(shí)施例4除應(yīng)用200ml濃的NH4NO3或(NH4)2SO4溶液代替5ml濃HCl以提取酸性肽聚糖之外，重復(fù)實(shí)施例3。
終產(chǎn)物產(chǎn)量為14mg。葡萄糖與糖醛酸的質(zhì)量相關(guān)性為1∶2.4。肽含量為15.8％。
實(shí)施例5將5kg來自茄科的馬鈴薯(S.tuberosum)芽用10L水搗碎并在室溫于攪拌的同時(shí)進(jìn)行2小時(shí)的提取。將混合物用機(jī)械壓力擠壓。將水相提取物透析并用10kD中空纖維柱體通過超濾而濃縮至1升。
向濃縮物中加入1g氯化鈉，然后也加入300ml 96％的乙醇。通過在4000rpm離心30分鐘提取沉淀。然后將沉淀用30ml 96％的乙醇洗滌、離心并在氣流中干燥。
在室溫?cái)嚢?小時(shí)的同時(shí)將10g干產(chǎn)物在1升蒸餾水中稀釋。去除不溶性部分并向上清液添加150ml 5％的氯化鈣。將酸性粗肽聚糖沉淀通過離心進(jìn)行分離。然后將其于50℃進(jìn)行攪拌的同時(shí)溶解于氯化鈉飽和溶液中，直到聚合物完全溶解。
將結(jié)果所得的溶液引入到TSK HW-75F柱中以進(jìn)行凝膠層析。用水使級(jí)分從柱子中洗脫。收集分子量在1200和40000kD之間的第一個(gè)高分子量峰。將該級(jí)分在蒸發(fā)器中濃縮并然后凍干。
酸性肽聚糖的產(chǎn)量為170mg。葡萄糖與糖醛酸的重量比例為1∶4。
實(shí)施例6
除應(yīng)用馬鈴薯球莖及將9％的溴棕三甲銨溶液用作次級(jí)沉降中的鹽之外，重復(fù)實(shí)施例4。酸性肽聚糖的產(chǎn)量為114mg。葡萄糖與糖醛酸的質(zhì)量相關(guān)性為1∶3.5。肽含量為16％。
實(shí)施例7將如在實(shí)施例3中獲得的21.4mg酸性肽聚糖在0.1M三氟乙酸中于100℃進(jìn)行2小時(shí)的部分水解。將水解過程中形成的沉淀通過離心(13000rpm，2分鐘)獲得，用三氟乙酸和水進(jìn)行洗滌，然后凍干。沉淀的產(chǎn)量(編碼為L-1)為1.5mg。將去除沉淀后剩余的可溶性物質(zhì)通過真空蒸發(fā)進(jìn)行干燥，然后溶于乙醇中并進(jìn)行干燥以去除痕量的三氟乙酸。將剩余物溶于3ml水中，并將不溶性材料通過離心進(jìn)行沉淀，用水進(jìn)行洗滌并凍干。
沉淀的產(chǎn)量(L-2)為1.5mg。沉淀L-1和L-2的總產(chǎn)量為酸性肽聚糖起始質(zhì)量的約14％。人們發(fā)現(xiàn)沉淀為脂質(zhì)。
沉淀的甲醇分解進(jìn)行如下。將0.8mg L-1和0.9mg L-2樣品分別與1ml無水甲醇混合，然后向每一個(gè)上述反應(yīng)混合物加入0.1ml乙酰氯(冰冷的)。將反應(yīng)混合物在接合的玻璃安瓿中于100℃加熱4小時(shí)，這將導(dǎo)致沉淀的完全溶解。將反應(yīng)混合物通過真空蒸發(fā)進(jìn)行干燥，然后加入1ml氯仿，并用氣液層析法(GLC)和層析質(zhì)譜儀(chromatomassspectrometer)進(jìn)行檢查。
兩個(gè)樣品(L-1和L-2)的GLC-光譜相同；每一個(gè)光譜具有2個(gè)信號(hào)。GLC在Carlo Fractovap Series 4200上進(jìn)行(氣體載體He、注射器溫度280℃、柱-Ultra-1(25m×0.2mm×0.33μm))。
質(zhì)譜顯示棕櫚酸和硬脂酸的甲基酯以2∶1的比例存在。應(yīng)用離子型Capture ITD-700(Finnigan MAT、電子命中70EV、質(zhì)量范圍m/z 39-450、掃描速度1次掃描/秒、保留累積240秒)質(zhì)譜儀。
實(shí)施例8抗體合成的活化本實(shí)施例顯示酸性肽聚糖(APG)同時(shí)與外源抗原的注射導(dǎo)致對(duì)注射的抗原特異性的抗體生產(chǎn)的實(shí)質(zhì)強(qiáng)化。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用小鼠CBA、C57BI/6、(CBA×C57BI/6)F1和BALB/c。將牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(EA)和綿羊紅細(xì)胞(SE)用作對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種的抗原。
通過離心(1000rpm、10分鐘)將去纖維蛋白的綿羊血液紅細(xì)胞在50-倍體積的Hank氏溶液中洗滌，然后重懸于相同的溶液中。通過腹膜內(nèi)給予2ml SE、200μg BSA或50μg EA而對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。后兩種抗原注射兩次，在免疫接種之間有2-4星期的間隔。
在使用前2-3小時(shí)，將適當(dāng)量的APG溶于Hank氏溶液或生理鹽水中。將APG以1-1000μg的劑量給予小鼠。當(dāng)用BSA、EA或SE對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種時(shí)，將APG與抗原同時(shí)給予。
用SE進(jìn)行免疫接種的小鼠中免疫反應(yīng)的強(qiáng)度根據(jù)抗體形成細(xì)胞(AFC)數(shù)目確定，該細(xì)胞在脾細(xì)胞懸浮液中用Jerne和Nordin(1963)的方法進(jìn)行探測(cè)。AFC在免疫接種后4-5日進(jìn)行探測(cè)。對(duì)小鼠血清中EA或BSA特異性的抗體的存在用固相酶免疫測(cè)定(EIA)進(jìn)行探測(cè)。對(duì)BSA特異性的抗體同種型通過EIA用對(duì)小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3特異性的次級(jí)兔抗體進(jìn)行確定。
用BSA和APG進(jìn)行免疫接種后對(duì)小鼠血清中BSA特異性的抗體水平(EIA-效價(jià))達(dá)到了1∶20000，而對(duì)單獨(dú)應(yīng)用BSA免疫接種的反應(yīng)水平非常低且僅達(dá)到了1∶500。如果抗原與APG聯(lián)合，那么對(duì)BSA的次級(jí)免疫反應(yīng)期限也增加。在該情況中，IgG1、IgG2a和IgG3抗體同種型占優(yōu)勢(shì)。在APG影響下，對(duì)BSA特異性的IgM和IgG2b生產(chǎn)以較低的程度增加。佐劑作用主要依賴于APG的劑量。10μg APG的劑量對(duì)于增強(qiáng)對(duì)SE的原發(fā)免疫反應(yīng)最適，而1μg APG的劑量對(duì)于刺激對(duì)BSA的次級(jí)免疫反應(yīng)最適。
APG對(duì)BaBb/c小鼠中EA-特異性抗體生產(chǎn)的影響由表2中所示的數(shù)據(jù)證明。脂肽為Pam3Cys-Ser-Lys4，即一種眾所周知的免疫佐劑。
表2
實(shí)施例9組織巨噬細(xì)胞的活化本實(shí)施例顯示從腹膜腔溢泌物中收獲的小鼠組織巨噬細(xì)胞可通過在APG存在時(shí)的體外培養(yǎng)而強(qiáng)烈活化。該活化可在其形態(tài)學(xué)(細(xì)胞改變了其大小和形狀)以及在其代謝和酶活性中觀察到。
用3ml培養(yǎng)基199對(duì)(CBA×C57BI/6)F1小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。在注射后5分鐘內(nèi)收集腹膜溢泌物。將10-15只小鼠的溢泌物收獲入相同的硅滲化離心管中，并于1000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸，并將其濃度調(diào)節(jié)到每ml中有2-2.5mln腹膜溢泌物細(xì)胞(PEC)。
巨噬細(xì)胞的氧化自由基生產(chǎn)將1ml PEC細(xì)胞懸浮液傾倒入化學(xué)發(fā)光圖(chemiluminograph)試管中，并于37℃在氣氛中5％CO2的潤濕空氣中溫育2小時(shí)。溫育后，用培養(yǎng)基199將非貼壁的細(xì)胞洗掉。然后將1ml含有濃度為每ml中0-50μgAPG的完全培養(yǎng)基(RPMI-1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和10μg/ml艮他霉素)在附著試管的貼壁細(xì)胞上部?jī)A倒入每一個(gè)試管中。然后將試管溫育24小時(shí)。溫育后，用0.5ml緩沖溶液(pH7.2)代替培養(yǎng)基，該緩沖溶液從Hank氏溶液(無苯酚紅)制備，補(bǔ)充了5mM葡萄糖、10mM HEPES-緩沖液和0.62mM魯米諾(Sigma Chemical Co.)。
將貼壁的巨噬細(xì)胞的氧化自由基生產(chǎn)估計(jì)為自發(fā)的和酵母多糖(zymozan)-誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光水平。3個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總和表示為每分鐘每1mln細(xì)胞中脈沖的平均數(shù)目。在APG存在時(shí)貼壁巨噬細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)的溫育不影響其自發(fā)化學(xué)發(fā)光的水平，但相當(dāng)大地增加了(達(dá)到50％)細(xì)胞對(duì)酵母多糖反應(yīng)而產(chǎn)生氧化代謝物的能力，該酵母多糖是一種是微生物細(xì)胞壁成分。巨噬細(xì)胞化學(xué)發(fā)光能力的增加在0.2μg/ml APG時(shí)即已經(jīng)開始，且在5.5μg/ml APG時(shí)達(dá)到其最大值。劑量依賴性充分與APG濃度相關(guān)，這導(dǎo)致由其形態(tài)學(xué)改變估計(jì)的巨噬細(xì)胞的最大活化。
巨噬細(xì)胞膜上5’-核苷酸酶(5’-NTDase)的活性對(duì)5’-NTDase酶水平的探測(cè)是估計(jì)巨噬細(xì)胞活化的高說明性的方法之一。已知在免疫調(diào)制劑影響下該酶活性的降低充分與其免疫增強(qiáng)和抗感染功效相關(guān)。
為了確定APG對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞5’-NTDase水平的影響，用0.5ml生理鹽水中30μg的APG對(duì)(CBA×C57BI/6)F1小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。用0.5ml不含APG的生理鹽水對(duì)對(duì)照小鼠進(jìn)行注射。注射后24小時(shí)，通過用5ml培養(yǎng)基199對(duì)每一個(gè)小鼠腹膜進(jìn)行洗滌而收獲腹膜溢泌物細(xì)胞。將10ml體積中的PEC懸浮液置于100mm培養(yǎng)皿中，然后于37℃和5％CO2溫育2小時(shí)。將非貼壁細(xì)胞去除，而用乳膠刮刷從培養(yǎng)皿表面收集貼壁細(xì)胞，然后將PEC的濃度調(diào)節(jié)到50μl體積中2mln細(xì)胞。將該體積的懸浮液置于96-孔微量滴定板上的孔中，然后加入5’-腺甘單磷酸作為5’-NTDase的底物，并將細(xì)胞在上述條件下溫育60分鐘。根據(jù)鉬試劑的色彩強(qiáng)度用光度測(cè)定法(λ620nm)測(cè)量酶活性，該鉬試劑是在溫育后置于所有孔中的。結(jié)果表示為每1mln PEC的光密度單位和對(duì)照水平百分比的相對(duì)5’-NTDase活性。APG存在時(shí)5’-NTDase的活性為對(duì)照水平的16％。
實(shí)施例10人免疫系統(tǒng)的活化本實(shí)施例顯示APG對(duì)在人外周血中循環(huán)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的體外影響。
人NK-細(xì)胞的活化應(yīng)用三色激光細(xì)胞計(jì)量術(shù)發(fā)現(xiàn)作為APG對(duì)人NK-細(xì)胞影響結(jié)果的活化標(biāo)記。肝素化的血液通過應(yīng)用“Vacutainer”系統(tǒng)(由BectonDickinson生產(chǎn))對(duì)健康供體的靜脈穿刺獲取。將APG制劑在培養(yǎng)基RPMI-1640中稀釋到1mg/ml的濃度，并通過0.22mcm的濾器過濾而滅菌。在培養(yǎng)基RPMI-1640中制備0.016-100μg/ml APG的因子2系列濃度，并將其以0.2ml的體積置于48-孔Nunc培養(yǎng)平板的孔中。作為負(fù)對(duì)照，應(yīng)用0.2ml不含APG的RPMI-1640。將0.2ml肝素化的血液加入到每一個(gè)孔中。將樣品于37℃和5％CO2溫育3-48小時(shí)。溫育后，將0.05ml血液樣品置于1.2ml的塑料管中。插入了5μl下面的抗體抗-CD16-FITC(Sorbent)、抗-CD69-藻紅素(Pharmingen)、抗-CD3-PerCR(Becton Dickinson)。將管子搖動(dòng)5秒，然后于室溫暗溫育20分鐘。將1ml裂解-固定溶液(Becton Dickinson)加入到每一個(gè)試管中，然后使其在室溫放置15分鐘。將試管在300g離心10分鐘，去除上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于0.5ml等滲溶液中。
應(yīng)用激光活化的熒光細(xì)胞熒光光度計(jì)(cytofluorimeter)(FACSCalibur，由Becton Dickinson生產(chǎn))和應(yīng)用Cell Quest軟件顯示不存在APG時(shí)僅有7％的NK-細(xì)胞表達(dá)CD69(一種活化標(biāo)記)，但如果在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在10μg/ml APG，那么實(shí)際上所有的(96％)NK-細(xì)胞均活化并表達(dá)CD69。
在APG影響下NK-細(xì)胞的溶細(xì)胞活性的增加應(yīng)用Ficoll(Pharmacia)密度梯度離心(室溫30分鐘，300g)從肝素化的血液中獲得了單核級(jí)分。將細(xì)胞用培養(yǎng)基199洗滌并于2mln/ml懸浮于完全培養(yǎng)基(CM)中，該完全培養(yǎng)基包含RPMI-1640，并補(bǔ)充了10％胎牛血清、20mM Hepes緩沖液(pH7.4)和10μg/ml艮他霉素。將1ml細(xì)胞懸浮液置于12-孔Nunc培養(yǎng)平板的每一個(gè)孔中，然后將1ml CM(對(duì)照)、1ml 20μg/ml的APG溶液或1ml白細(xì)胞介素-2(IL-2，20ME/ml，一種標(biāo)準(zhǔn)的NK-細(xì)胞活化劑)加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。將培養(yǎng)物于37℃在5％CO2的空氣中溫育3小時(shí)。溫育后，將細(xì)胞收集于離心管中，通過離心(10分鐘，300g)進(jìn)行沉淀，并以每1mlCM中5mln細(xì)胞的濃度重懸。將回收的細(xì)胞用作溶細(xì)胞效應(yīng)物。將效應(yīng)物細(xì)胞在CM中連續(xù)2-倍稀釋的三份引入(0.1ml體積)到96-孔圓底培養(yǎng)平板的孔中。將10,000個(gè)K562細(xì)胞系來源的3H-尿苷-標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞加入到每一個(gè)培養(yǎng)孔中。使效應(yīng)物和目標(biāo)細(xì)胞的混合物于37℃在5％CO2的空氣中溫育4小時(shí)。溫育后，用Titertek Cell Harvester 550將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到濾紙上，然后用Wallac 1409meter對(duì)放射性水平進(jìn)行計(jì)數(shù)。
使效應(yīng)物細(xì)胞在APG存在時(shí)溫育3小時(shí)后，29％的NK-細(xì)胞表達(dá)CD69，這意味著該細(xì)胞已活化。這種APG-活化的效應(yīng)物細(xì)胞對(duì)K562腫瘤目標(biāo)細(xì)胞的溶細(xì)胞活性的研究顯示在APG影響下NK-細(xì)胞殺傷目標(biāo)細(xì)胞能力的巨大增加。這在低的效應(yīng)物-目標(biāo)比例時(shí)更明顯，特別是在6.25和12.5的比例時(shí)，NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解能力在APG影響下增加3倍。APG在活化NK細(xì)胞中比IL-2更有效，不管該活化是根據(jù)CD69的表達(dá)還是對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的殺傷活性進(jìn)行估計(jì)的。
粒細(xì)胞的活化對(duì)不同類型細(xì)胞上活化標(biāo)記表達(dá)的研究顯示APG誘導(dǎo)粒細(xì)胞上CD69的表達(dá)。粒細(xì)胞的活化在APG存在時(shí)體外溫育24小時(shí)后明顯。在該時(shí)間，60％的粒細(xì)胞表達(dá)CD69。
實(shí)施例11細(xì)胞因子合成和分泌的活化本實(shí)施例顯示APG活化人血細(xì)胞中細(xì)胞因子的生產(chǎn)。例如，APG起始了白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生。
肝素化的血液通過應(yīng)用Vacutainer系統(tǒng)(Becton Dickinson)對(duì)健康供體的靜脈穿刺獲取。將APG制劑在培養(yǎng)基RPMI-1640中稀釋到1mg/ml的濃度，并通過0.22μm的濾器過濾而滅菌。在培養(yǎng)基RPMI-1640中制備了0.016-100μg/ml APG的因子2系列濃度，并將其以0.2ml的體積置于48-孔培養(yǎng)平板的孔中。作為負(fù)對(duì)照，應(yīng)用0.2ml不含APG的RPMI-1640。然后將0.2ml肝素化的血液加入到每一個(gè)孔中。
將樣品于37℃和5％CO2溫育3-48小時(shí)。溫育后，將0.2ml培養(yǎng)基收集于0.5ml離心試管中，并于10000rpm離心15分鐘。將上清液于-70℃冷凍并用于確定分泌的細(xì)胞因子。將在培養(yǎng)孔中剩余的細(xì)胞輕輕用移液管吸取并轉(zhuǎn)移到1.2ml塑料試管中以用流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞活化標(biāo)記。培養(yǎng)物上清液中的IL-1β濃度用EIA進(jìn)行確定。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書應(yīng)用Immunotech(法國)生產(chǎn)的IL-1β試劑盒。TNF-α和IL-8分別用購自Innogenetics(比利時(shí))的EIA試劑盒進(jìn)行測(cè)量。顏色強(qiáng)度用由Dynatech(瑞士)制造的自動(dòng)光度計(jì)(450nm)閱讀器進(jìn)行測(cè)量。
應(yīng)用三色激光活化的流式細(xì)胞儀(FACS Callbur，BectonDickinson，美國)在人血液?jiǎn)魏思?xì)胞中探測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。將肝素化的血液用RPMI-1640進(jìn)行1∶1的稀釋，該RPMI-1640含有各種濃度的APG且也含有10μg/ml布雷非爾德菌素A(Sigma，美國)，即一種真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)分泌的抑制劑。將樣品于37℃和5％CO2溫育5小時(shí)。溫育后，獲取0.1ml懸浮液，并添加1ml裂解-固定溶液(BectonDickinson)。使混合物在室溫放置15分鐘。將試管進(jìn)行離心(300g，10分鐘)，去除上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于0.5ml細(xì)胞透化混合物中(Becton Dickinson)。將該懸浮液于室溫放置10分鐘。該程序使得細(xì)胞內(nèi)部能夠顯色。在添加了5ml含有0.5％牛血清和0.1％疊氮化鈉的等滲液體后，將細(xì)胞通過離心(300g，10分鐘)進(jìn)行沉淀，并將上清液去除。將5μl抗體添加入細(xì)胞沉淀中。為了確定單核細(xì)胞中的IL-1β，應(yīng)用了下面的抗體混合物抗-IL-1β-FITC(Caltag Lab.)、抗-CD14-PE(Caltag Lab.)、抗-CD45-PerCR(Becton Dickinson)。細(xì)胞內(nèi)的確定類似，但在各個(gè)標(biāo)記的抗體混合物中應(yīng)用FITC-標(biāo)記的抗-TNF-α。
結(jié)果顯示APG刺激TNF-α、IL-1β和IL-8由單核細(xì)胞的生產(chǎn)，且該單核細(xì)胞是細(xì)胞外培養(yǎng)基中這些細(xì)胞因子的來源。事實(shí)上，如果將布雷非爾德菌素A添加到溫育培養(yǎng)基中且因此阻斷蛋白質(zhì)分泌，并用流式細(xì)胞儀記錄單核細(xì)胞內(nèi)這些細(xì)胞因子的累積，那么其在培養(yǎng)基中的濃度就為背景水平。無布雷非爾德菌素A時(shí)，單核細(xì)胞中細(xì)胞因子的累積是不明顯的，這是因?yàn)樗鼈儾粩噍敵龅郊?xì)胞外部，因此培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的濃度急劇增加，這直接依賴于APG的濃度。劑量依賴性曲線顯示隨APG-濃度在體外從40到400ng/ml的增加，單核細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-8生產(chǎn)為指數(shù)增長。
實(shí)施例12干擾素合成的誘導(dǎo)在體外用人細(xì)胞系進(jìn)行了APG的干擾素誘導(dǎo)活性的研究，該人細(xì)胞系即L-41(成纖維樣細(xì)胞)和J-96(單核細(xì)胞樣細(xì)胞系)。干擾素誘導(dǎo)的強(qiáng)度通過APG對(duì)用腦心肌炎病毒(encephalo-myocarditis virus)(EMV)感染的人細(xì)胞系的抗病毒活性進(jìn)行估計(jì)。將每100μl體積20,000個(gè)細(xì)胞置于96-孔平底培養(yǎng)平板的每一個(gè)孔中。將培養(yǎng)基199用于J-96細(xì)胞的培養(yǎng)，而使L-41用Eagle’s最小培養(yǎng)基進(jìn)行生長；兩種培養(yǎng)基均補(bǔ)充了10％胎牛血清、300μg/ml L-谷氨酰胺和100單位/ml的青霉素。
將一種雙鏈微生物DNA制劑，Ridostin(Vector，俄羅斯)用作參考的干擾素誘導(dǎo)劑。將APG和Ridostin的干擾素誘導(dǎo)功效根據(jù)其在體外保護(hù)L-41和J-96細(xì)胞不受EMV的細(xì)胞病原性影響的能力進(jìn)行估計(jì)。干擾素誘導(dǎo)能力表示為保護(hù)50％的細(xì)胞不被病毒致死的化合物的最小有效濃度(CPD50)。
在細(xì)胞培養(yǎng)物中將檢驗(yàn)的制劑的因子2系列稀釋制備為0-100μg/ml的APG或Ridostin終濃度。感染的細(xì)胞的生存力和病毒的細(xì)胞病原性作用在感染后24小時(shí)用光學(xué)顯微鏡(Leitz，放大200×)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在每一種情況下3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于表3和4中。
表3用100LD100EMV感染的L-41細(xì)胞培養(yǎng)物中APG的干擾素誘導(dǎo)功效
表4用100LD100EMV感染的J-96細(xì)胞培養(yǎng)物中APG的干擾素誘導(dǎo)功效
實(shí)施例13抗細(xì)菌防御的活化應(yīng)用小鼠的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的實(shí)驗(yàn)性感染檢驗(yàn)APG為抗細(xì)菌防御的增強(qiáng)劑。該實(shí)驗(yàn)在體重為12-14g的兩種性別的小鼠上進(jìn)行。在感染前24小時(shí)將不同劑量的APG(3.3μg、10μg或30μg)進(jìn)行皮下注射。用102、103、104或105個(gè)微生物細(xì)胞(每只小鼠)對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。在20日中記錄死亡率。根據(jù)動(dòng)物存活的增加(％)、導(dǎo)致50％死亡的感染劑量(ID50)和攻擊后壽命的延長估計(jì)該制劑的保護(hù)功效。結(jié)果顯示于表5中。
表5APG對(duì)小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌感染抗性的影響
*-表示ID50及其顯示0.05概率時(shí)的界限(括弧中的)。
人們也已發(fā)現(xiàn)APG成功地增加了雞對(duì)葡萄球菌的抗感染防御。進(jìn)一步地，應(yīng)用APG的免疫調(diào)節(jié)可增加抗細(xì)菌化學(xué)療法的功效。在用1.5×109金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)攻擊后20分鐘，將一種抗細(xì)菌制劑，nifulin以10mg/kg的劑量經(jīng)口引入雞中。與攻擊的對(duì)照組中的40％相比，應(yīng)用nifulin的治療將雞的存活率增加到70％。APG和nifulin的聯(lián)合保護(hù)了100％的感染的雞。
實(shí)施例14抗病毒防御的活化應(yīng)用1型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)(HSV-1)感染的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诎咨墙恍∈笾醒芯苛薃PG的抗病毒作用。結(jié)果顯示APG的預(yù)防和治療性作用。在攻擊前48小時(shí)用每只小鼠3μgAPG的注射或者在攻擊前48和24小時(shí)分兩次用每只小鼠3-30μg的注射可保護(hù)40-60％的動(dòng)物不由于感染而死亡。
應(yīng)用VERO細(xì)胞培養(yǎng)物中的HSV-1感染研究了APG增加人細(xì)胞對(duì)病毒感染抗性的能力。已顯示APG可賦予VERO細(xì)胞對(duì)HSV-1導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的防護(hù)。
與未處理的VERO細(xì)胞相比，在用APG處理的VERO細(xì)胞中病毒復(fù)制得到急劇抑制。因此，如果在攻擊前24小時(shí)用APG對(duì)VERO細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，那么HSV-1效價(jià)將減少100-1000倍。如果在用HSV-1攻擊VERO細(xì)胞后給予該制劑，那么病毒的效價(jià)將減少70-100倍。
權(quán)利要求
1.一種具有免疫刺激性、抗病毒和/或抗細(xì)菌活性的物質(zhì)，該物質(zhì)可通過用水從薯蕷科、車前科或茄科搗碎的植物原材料中提取而獲得，且該物質(zhì)是分子量為1200-40000kD且葡萄糖對(duì)糖醛酸的重量比例為1到2-4的水溶性酸性肽聚糖。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的物質(zhì)，其中肽部分構(gòu)成了酸性肽聚糖總質(zhì)量的13±3％。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的物質(zhì)，該物質(zhì)以2.4∶1的比例含有10-15％的棕櫚酸和硬脂酸。
4.一種根據(jù)任何前述權(quán)利要求的物質(zhì)，用于治療性用途。
5.一種包含根據(jù)任何前述權(quán)利要求的物質(zhì)和藥物可接受的載體的藥物組合物。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，為液體形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由增強(qiáng)的抗體合成改善的病癥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的巨噬細(xì)胞改善的病癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的單核細(xì)胞改善的病癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的天然殺傷細(xì)胞(NK-細(xì)胞)改善的病癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的粒細(xì)胞改善的病癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的細(xì)胞因子合成改善的病癥。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的物質(zhì)用于制備藥物的用途，該藥物用于治療可由活化的干擾素合成改善的病癥。
全文摘要
一種具有免疫刺激、抗病毒和/或抗細(xì)菌活性的物質(zhì)，該物質(zhì)可通過用水從薯蕷科(Dioscoreaceae)、車前科(Plantaginaceae)或茄科(Solanaceae)科搗碎的植物原材料中提取而獲得，且該物質(zhì)是分子量為1200－40000kD且葡萄糖對(duì)糖醛酸的重量比例為1到2－4的水溶性酸性肽聚糖。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1602200SQ02824568
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月16日
發(fā)明者A·V·皮楚金, T·M·梅爾尼科娃, R·M·凱托夫, R·I·阿托萊克漢諾夫 申請(qǐng)人:董事研究有限責(zé)任合伙公司