專利名稱：：免疫耐受誘導劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫耐受誘導劑，尤其涉及含有粘膜結合分子的誘導劑，該試劑與特異性的耐受原相連接。本發(fā)明還涉及在抗特異性抗原(包括半抗原)的個體中誘導免疫耐受的方法。本發(fā)明背景以及對現(xiàn)有技術的討論通過給脊椎動物生物體注射引入下文中稱作抗原(Ag)(包括半抗原)的外源物質可以誘導免疫反應，其特征在于產(chǎn)生了能與所說Ag相互作用的特異性抗體(B淋巴細胞的產(chǎn)物)和/或生成了效應性T淋巴細胞，并在與所述Ag相遇的位點產(chǎn)生了被稱作淋巴因子的可溶性介體?？贵w和T淋巴細胞在抗敵對Ag的保護方面確實起著重要作用，但它們也參與導致宿主組織被破壞的有害過程。此為自身免疫疾病的情況，其中抗體和/或T淋巴細胞與病人自身組織Ag反應并損傷之。這也是變態(tài)反應的情況，此反應的特征在于對某一環(huán)境因素的超常免疫反應，它可導致破壞組織的炎癥反應。另外，這在慢性炎癥反應中的情況也是如此，此反應是由于在某些感染(如結核病、血吸蟲病)中或隨后引入外源顆粒(如石棉)時不能有效排除外源物質而產(chǎn)生的。在免疫增殖反應中情況也是如此，此反應在體內引入同種異體移植物之后發(fā)生并可導致排異現(xiàn)象。開發(fā)有效治療由不希望的或組織損傷性免疫反應(如同種異體移植排異、自身免疫疾病、對有害衍生物或外界抗原的組織損傷必變態(tài)反應)所引起疾病之方法的主要目的之一是將有害免疫過程的強度特異性地抑制或降低至可接受的水平而不影響免疫系統(tǒng)其余部分。免疫耐受的主題涉及確保不存在對人體自身組分(“自身抗原”)或對任何所給外源物質的損傷性免疫反應的所有機制。誘導免疫耐受的長期確認方法是口服抗原，這是由Wells以雞蛋白質最先的闡明的(Wells，H.1911.StudiesontheChemistryofanaphylaxisIII.Experimentswithisolatedproteins，especiallythoseofhen′segg.J.Infect.Dis.9147)。這種常稱作“口服耐受”的現(xiàn)象(因為最初是由口服Ag的作用證明的)的特征在于喂給或吸入抗原的動物當重新暴露于由全身途徑(如注射)引入的所說抗原時會變成不應性的或降低了產(chǎn)生全身免疫反應的能力。概況地說，抗原結合劑粘膜或粘膜組織(如腸、肺、口腔、生殖道、鼻或眼)內可誘導全身免疫耐受現(xiàn)象。與此相反，將抗原引入非粘膜組織(即例如皮膚或血液，指的是全身免疫接種)經(jīng)常會導致具有上述特征的免疫反應，即全身免疫反應。這種現(xiàn)象對于由粘膜途徑引入的Ag是高度特異性的，在這種意義上，低反應性只能在注射過所說喂給或吸入Ag之后才能被證明，而在注射過結構不相關的Ag之后不能被證明(假如后者以前未在粘膜位點被遇到的話)。據(jù)信吸入的抗原在腸相關的淋巴樣組織中由包括腸上皮細胞和Peyer氏patchM細胞的專門化細胞吸收和加工(Owen.R.L.，andP.Nemanic.1978.AntigenprocessingstructuresofthemammalianintestinaltractanSEMstudyoflymphoepithelialorgans.ScanningElectronMicrosc.2367-378)。據(jù)信吸入的抗原由氣管上皮中類似的細胞攝入(RichardsonJ.BouchardRandFergusonCC.1976.Uptakeandtransportofexogenousproteinsbyrespiratoryepithelium.Lab.Invest35307-314)。當抗原與腸和肺粘膜局部微環(huán)境中的輔佐細胞、同種T輔助細胞和/或B淋巴細胞相互作用之后，會發(fā)生免疫反應，其特征在于可受幾個因素影響，包括抗原的特性、所涉及輔佐細胞和淋巴細胞的類型以及宿主的遺傳背景。然而，吸入抗原也會導致免疫耐受狀態(tài)的產(chǎn)生，此種情況的特征在于即使通過非粘膜途徑(如非腸道注射)將起初在消化道粘膜或呼吸道粘膜中遇到的抗原再次引入生物體也不會在非粘膜組織產(chǎn)生免疫反應。由于這種現(xiàn)象對最初攝入或吸入的抗原而言特異性很強，因此不會影響抗其它抗原的全身免疫反應的產(chǎn)生，其用途已成為越來越有吸引力的策略。以預防并可能治療與抗非粘膜組織中遇到的特異抗原而產(chǎn)生的不適當?shù)暮?或超常免疫反應相關的由之引起的疾病。粘膜誘導的全身耐受現(xiàn)象可涉及所有類型的免疫反應，已知全身引入Ag可誘導這些免疫反應，如抗體的產(chǎn)生，抗所述Ag的細胞介導的免疫反應的產(chǎn)生。因此建議使用粘膜誘導的免疫耐受策略以防止或降低對化學藥物的變態(tài)反應強度(Chase，MW.1946.Inhibitionofexperimentaldrugallergybypriorfeedingofthesensitizingagent.Proc.Soc.Exp.Boil.61257-259)。它也可能防止或降低對全身引入的可溶性蛋白質抗原以及顆?？乖?如通過口服紅細胞引入實驗動物和人的紅細胞)之免疫反應的強度(ThomasHCandParrotDMV1974.Theinductionoftolerancetosolubleproteinantigensbyoraladministration.Immunology27631-639；Mattingly，J.andWaksmanB.1978.Immunologicalsuppressionafteroraladministrationofantigen.SpecificsuppressorcellsfoundinratPryer′spatchesafteroraladministrationofsheeperythrocytesandtheirsystemicmigration.J.Immunol.1211878；Bierme.S.J.，Blanc，M.，Abbal，M.，F(xiàn)ournie，A.1979.OralRhtreatmentforseverelyimmunizedmothers.Lancet，1605-606)。使用粘膜誘導的全身耐受現(xiàn)象可降低或抑制抗外源抗原以及自身抗原的免疫反應，自身抗原也即宿主組織所衍生的組分。因此通過將自身抗原粘膜沉積于腸(經(jīng)喂給)或呼吸道(經(jīng)抗原霧化或鼻內滴注)粘膜即可降低多種動物系統(tǒng)中實驗誘導的自身免疫疾病強度。因此已證明口服II型膠原(在關節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)的占優(yōu)勢的膠原類型)可抑制或降低實驗性自身免疫關節(jié)炎的強度，在嚙齒類動物的某些品系中通過注射II型膠原以及Freund氏完全佐劑或僅注射結核分枝桿菌(前者佐劑的成分)可誘導此病(Thompson，HSGandStaines，NA，1986，GastricadministrationoftypeIIcollagendelaystheonsetandseverityofcollagen-inducedarthritisinrats.Clin.Exp.Immunol.64581；Nagler-Anderson.C.，BoberLA，Robinson，ME.SiskindGW，ThorbeckeGJ.1986.SuppressionoftypeIIcollagen-inducedarthritisbyintragastricadministrationofsolubletypeIIcollagen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA837443；Zhang，JZ，Lee，CSY，Lider，O.andWeinerHL.1990.SuppressionofadjuvantarthritisinLewisratsbyoraladministrationoftypeIIcollagen.J.Immunol.1452489-2493)。同樣，口服S-抗原(一種視網(wǎng)膜自身抗原，當注射給動物時可誘導一種形式的眼色素層視網(wǎng)膜炎)也可以抑制實驗形式的自身免疫眼色素層視網(wǎng)膜炎(Nussenblatt，RB，Caspi，RR，MahdiR.Chan，CC，Roberge，R.，Lider，O.，Weiner，HL.1990，InhibitionofS-antigeninducedexperimentalautoimmuneuveoretinitisbyoralinductionoftolerancewithS-antigen.J.Immunol，1441689-1695)。實驗性自身免疫腦炎是慢性復發(fā)性脫髓鞘疾病，在嚙齒動物的某些品系中通過注射純化的髓鞘堿性蛋白質或粗制的脊髓組織勻漿以及佐劑可誘導此病，如果通過口服(喂給)或呼吸道(煙霧劑)途徑給予動物MBP或MBP片段即可部分或完全抑制此病(BitarDMandWhitacreCC.1988.Suppressionofautoimmuneencephalomyelitisbytheoraladministrationofmyelinbasicprotein.CellImmunol.112364；HigginsPJandWeinerHL.1988.Suppressionofexperimentalautoimmuneencephalitisbyoraladministrationofmyelinbasicproteinanditsfragments.J.Immunol.140440-445；WeinerHL.Al-SabbaghAandSobelR.1990.Antigendrivenperipheralimmunetolerancesuppressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE)byaerosoladministrationofmyelinbasicprotein.FASEBJ(Abstr.)4(7)2102)。另外據(jù)報道口服胰島素可抑制小鼠自身免疫糖尿病(ZhangZJ.DavidsonL.EisenbarthGandWeinerHL.1991，Suppressionofdiabetesinnonobesediabeticmicebyoraladministrationofporcineinsulin.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)8810252-10256)。最近發(fā)現(xiàn)口服乙酰膽堿受體之后可達到抑制實驗性自身免疫重癥肌無力的目的(WankZY.QiaoJandLinkH.1993，Suppressionofexperimentalautoimmunemyastheniagravisbyoraladministrationofacetylcholinereceptor.J.Neuroimmunol.44209-214)。還證明了小鼠經(jīng)腸施用血吸蟲卵可防止肝和腸肉芽腫反應的產(chǎn)生或降低其強度，此反應是T細胞介導的慢性炎癥免疫反應，在寄生蟲血吸蟲侵染的過程中，血吸蟲卵周圍會產(chǎn)生此反應(WeinstockJV.BlumAMandKassabJT.1985.Inductionofgranulomamodulationinmurineschistosomiasismansonibyentericexposuretoschistosomeeggs.J.Immunol.135560-563)。同樣，已建議口服抗原以防止和/或治療對普通變應原(如居室灰塵成分或存在于禾本科植物花粉中的物質)的變態(tài)反應(RebienW.PuttonenE.MaaschHJ.StixEandWahnU.1982.Clinicalandimmunologicalresponsetooralandsubcutaneousimmunotherapywithgrasspollenextracts.Aprospectivestudy.Eur.J.Pediatry138341-344；WortmannF.1977.OralhyposensitizationofChildrenwithpollinosisorhousedustasthma.AllergoletImmunopathol.515-26)。盡管上述例子表明粘膜服用外源以及自身抗原可提供一便利的方法從誘導特異性的免疫耐受，但實踐中的困難始終局限了大規(guī)模治療人的方法以及獸醫(yī)藥的實用性。實際上，如果粘膜誘導的免疫耐受在臨床上有廣泛的實用性，那么它對疾病過程自身已確定的病人和/或可能已存在組織破壞性免疫細胞的病人必須也是有效的。當考慮到在遭受或傾向于自身免疫疾病，變態(tài)狀態(tài)或對持續(xù)存在衍生物的慢性炎癥反應的病人中誘導耐受的策略時，這一點尤其重要。粘膜誘導耐受的最新方法在抑制確定狀態(tài)的全身免疫敏感作用表達的方面取得了有限的成功(HanssonDG，VazNM.RawlingsLAandLynchJM.1979.Inhibitionofspecificimmuneresponsesbyfeedingproteinantigens，II.Effectsofpriorpassiveandactiveimmunization，J.Immunol.12222612266)。最重要地，由于目的在于誘導抗有害病原體之免疫應答的粘膜疫苗的相似性，通過粘膜使用大多數(shù)抗原以誘導全身免疫耐受需要相當量的耐受原/抗原，除非耐受原/抗原在長時間內重復施用，否則免疫耐受的期限相對較短?？赡艿慕忉屖谴蠖鄶?shù)抗原在進入粘膜組織前被廣泛降解和/或以不充足的量被吸收。因此可大膽地假定只有具備已知的粘膜結合特性的分子(粘膜結合分子的例子列于下表I，也可見于文獻中，如MirelmanD.1986.Microbiallectinsandagglutinins，Propertiesandbiologicalactivity.pp.84-110，Wiley，NewYork)通過粘膜途徑，如口服途徑被施用時可誘導局部和全身免疫反應，而不會誘導全身免疫耐受(deAizpuruaHJandRussell-JonesGJ.1988.Oralvaccination.IdentificationofClassesofproteinsthatprovokeanimmuneresponseuponoralfeeding.J.Exp.Med.167440-451)。一個值得注意的例子是霍亂毒素。它是目前已知的最強的粘膜免疫原之一(ElsonCOandEaldingW.1984.Generalizedsystemicandmucosalimmunityinmiceaftermucosalstimulationwithcholeratoxin.J.Immunol.1322736)，當通過口服途徑將其與一非相關抗原同時施用時也可防止誘導對所述抗原的全身免疫耐受(ElsonCOandEaldingW.1984.Choleratoxindidnotinduceoraltoleranceinmiceand.abrogatedoraltolerancetoanunrelatedantigen.J.Immunol.1332892)。根據(jù)這些研究成果，建議粘膜施用與粘膜結合分子，如霍亂毒素或其粘膜結合片段霍亂毒素B區(qū)單位連接的抗原以誘導局部和全身免疫反應而不是全身耐受(MckenzieSJandHalseyJF.1984.CholeratoxinBsubunitasacarrierproteintostimulateamucosalimmuneresponse.J.Immunol.1331818-1824；NedrudJG.LiangX，HagueNandLammME.1987，Combinedoral/nasalimmunizationprotectsmicefromSendaiVirusinfection.J.Immunol.1393484-3492；CzerkinskyC.RussellMW.LyckeN.LindbladMandHolmgrenJ.1989，OraladministrationofastreptococcalantigencoupledtocholeratoxinBsubunitevokesstrongantibodyresponsesinsalivaryglandsandextramucosaltissues.Infect.Immun.571072-1077；deAizpuruaHJandRussell-JonesGJ.1988.OralVaccinationIdentificationofclassesofproteinsthatprovokeanimmuneresponseuponoralfeeding.J.Exp.Med.167440-451；LehnerT.BergmeyerLA.PanagiotidiC.TaoL.BrookesR.KlavinskisLS.WalkerP.Walker.J.WardRGetal.1992.Inductionofmucosalandsystemicimmunitytoarecombinantsimianimmunodeficiencyviralprotein.Science258(5036)1365-1369)。本發(fā)明的描述已確定的看法是粘膜施用與粘膜結合分子連接的抗原可誘導局部和全身免疫反應，與此相反，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過各種粘膜(口腔、鼻內、陰道、直腸)途徑施用的抗原，當與粘膜結合分子連接時，可增強對所說抗原全身免疫耐受的誘導。因此本發(fā)明涉及免疫耐受誘導劑，它包含與特異性耐受原連接的粘膜結合分子。術語“免疫耐受”此處定義為宿主對特異性耐受抗原免疫反應性的降低。在本發(fā)明書和權利要求書中將這種耐受抗原稱作耐受原，這與確立的專有名詞是一致的。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述粘膜結合分子選自衍生于細菌毒素，細菌菌毛、病毒粘附蛋白和植物凝血素的粘膜結合結構的粘膜結合分子。所說細菌毒素的粘膜結合結構優(yōu)選自含有霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的組中，在優(yōu)選的實施方案中，所述粘膜結合結構是毒素的結合片段，尤其是霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞單位?？捎糜诒景l(fā)明的免疫耐受誘導劑的粘膜結合分子，其類與型的例子列于表I。表I粘膜結合分子類與型的例子A.細菌毒素及其結合亞單位或片段例如霍亂毒素、霍亂B亞單位；大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)、LTB亞單位；百日咳桿菌毒素、亞單位S2、S3、S4和/或S5；百喉毒素、DTB片段志賀毒素、志賀樣毒素及B亞單位B.細菌菌毛例如大腸桿菌；K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/II；(CS1、CS2和/或CS2)、CFA/IV(CS4、CS5和/或CS6)、P菌毛等；霍亂弧菌毒素-共調節(jié)毛(TCP)、甘露糖敏感型血細胞凝集素(MSHA)、黑角藻糖敏感型血細胞凝集素(FSHA)等百日咳桿菌絲狀血細胞凝集素；C.病毒吸附蛋白質例如流感和仙臺病毒血細胞凝集素HIVgp120D.動物凝血素和凝血素樣分子例如免疫球蛋白鈣-依賴型(C-型)凝血素；可溶性乳糖結合(S-型)凝血素；選擇蛋白；收集蛋白；螺旋pomatia血細胞凝集素E.植物凝血素例如伴刀豆球蛋白A小麥胚凝集素植物血細胞凝集素相思豆毒蛋白蓖麻毒蛋白在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明免疫耐受誘導劑中與粘膜結合分子連接的特異耐受原選自包括半抗原的特異抗原，此抗原在個體中可導致不希望的免疫反應。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所說抗原選自含有蛋白質、肽類、糖類、脂類和核酸的組中。所指的不希望的免疫反應與全身性抗體的產(chǎn)生和/或延遲型超敏感性相關，經(jīng)常還與自身免疫疾病，變態(tài)反應性疾病，組織或細胞移植物排異事件和/或急性或慢性炎癥反應或疾病相關。在根據(jù)本發(fā)明的免疫耐受誘導劑中，特異的耐受原和粘膜結合分子直接或間接相互連接。在本發(fā)明的實施方案中，所述耐受原和所述粘膜結合分子在下組成員之一的協(xié)助下間接地相互連接，該組包含間隔分子、含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保護性載體或所說間隔分子與所述耐受原/抗原(包括半抗原)的雜合分子，該雜合分子可以經(jīng)表達融合基因或核苷酸序列得到。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述間隔分子選自對所說耐受原或含有耐受原的載體以及所述粘膜結合分子中任一者或兩者具有結合親和力的分子。這種間隔分子的特殊例子是抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，間隔分子是GM1的神經(jīng)節(jié)苷脂、半乳糖基-N-乙?；?氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神經(jīng)酰胺的霍亂毒素結合結構或衍生于這些結構。在本發(fā)明的免疫耐受誘導劑中，只要所述耐受原和所述分子可行使它們各自的功能，特異的耐受原與粘膜結合分子連接的方式就不重要。因此，用簡單的化學方法即可將它們直接相互連接。將諸如霍亂毒素B亞單位(CTB)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)的蛋白質連接到脂類、半抗原、糖類、核酸以及包括抗體和合成肽類的其它蛋白質上的化學方法是本技術已知的(例見CarlssonJetal1978.Biochem.J.173723-737；CumberJAetal.1985.MethodsinEnzymology112207-224，WaldenPetal.1986.J.Mol.CellImmunol.2191-197；GordonRDetal.1987.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84308-312；AvrameasSandTernynckT.1969.Immunochemistry653；JosephKC.KimSU.StieberA.GonatasNK.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA752815-2819；MiddlebrookJLandKohnLD(eds).1981.Receptor-mediatedbindingandinternalizationoftoxinsandhormones.AcademicPress.NewYork.pp311-350)。耐受原基因也可與CTB(或LTB)基因融合(SanchezJ.SvennerholmA-MandHolmgrenJ.1988.Geneticfusionofanon-toxicheat-stableenterotoxin-relateddeca-peptideantigentocholeratoxinBsubunit.FEBSLetters241110-114)，然后可在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)，如細菌、酵母或病毒中表達所得的嵌合基因。另外，耐受誘導劑可含有編碼耐受原的核酸序列(DNA或RNA)或合成多聚核苷酸的片段，利用宿主粘膜組織細胞確保將相應的基因轉錄和/或翻譯成成熟蛋白質的能力?？蓪⒌玫降哪褪茉c粘膜結合分子化學連接(RohrbaughMLandMcGowanJJ.1993.Gene-transferfortherapyandprophylaxisofHIV-1infection.Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol685.pp697-712；NabelGJandFelgnerPL.1993.Directgene-transferforimmunotherapyandimmunization.TrendsinBiotechnologyVol11No.5.pp211-215；RobinsonHL.HuntLA.WebsterRG.1993.Protectionagainstalethalinfluenza-viruschallengebyimmunizationwithahemagglutinin-expressingplasmidDNA.Vaccine11957-960；MartinonF.KrishnanS.LenzenG.MagneR.GomardE.GruilletJG.LevyJPandMeulienP.1993.Eur.J.Immunol.231719-1722)。另一種可選擇的呈遞形式為將耐受原或其核酸前體摻入保護性載體(如脂質體或等量的可生物降解的載體)中。粘膜結合物質已經(jīng)或將要吸附到載體上以使含有耐受原的載體有效結合到粘膜表面以改善耐受原的效力。以這種呈遞形式，耐受原可以是游離的或與其它分子相連接。本發(fā)明還涉及在抗特異性抗原(包括半抗原)的個體中誘導免疫耐受的方法，所述抗原在所述個體中可引起不希望的免疫反應，該方法包括經(jīng)粘膜途徑給所述個體施用免疫有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫耐受誘導劑?？稍趥€體中引起不希望的免疫反應并在本發(fā)明的免疫耐受誘導劑中可形成特異耐受原的特異抗原的例子是胰島素或其片段，包括合成肽類或相應的核酸遺傳信息?？赏ㄟ^粘膜途徑施用本發(fā)明的免疫耐受誘導劑以防止或抑制對胰島素的免疫反應，因此可防止或治療自身免疫糖尿??；髓鞘堿性蛋白質或其片段，包括合成肽類或相應的核酸遺傳信息，本發(fā)明的試劑可用于防止或抑制對髓鞘堿性蛋白質的免疫反應，因此可防止或治療多發(fā)性硬化癥。單鏈或雙鏈DNA施用本發(fā)明的試劑可抑制對自身DNA的免疫反應以防止和/或治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，此病的免疫學特點是產(chǎn)生了抗自身DNA的自身抗體；抗體或其片段，包括合成肽類或相應的核酸遺傳信息。本發(fā)明的試劑可用于防止對所述抗體的免疫反應；抗體可以是IgG分子或其片段，然后經(jīng)由粘膜途徑施用含完整IgG或其片段作為耐受原的免疫耐受誘導劑以防止或降低對IgG分子的免疫反應，患有風濕性關節(jié)炎和相關疾病的病人情況即為如此，這些疾病的特征在于存在與自身IgG分子反應的稱為類風濕因子的自身抗體。γ球蛋白或其片段，包括合成的肽類或相應的核酸遺傳信息，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止或降低對所述γ球蛋白的免疫反應，情況同靜脈注射γ球蛋白之前一樣有利；移植抗原或其片段，包括合成的肽類或相應的核酸遺傳信息，或表達所述移植抗原的細胞，如紅血細胞、血小板或淋巴細胞，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止或降低對所述移植抗原的免疫反應，因此可防止排異和/或延長同種異體移植體的存活期；如豚草花粉的變態(tài)反應性物質，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止和/或降低對所述變應性物質的免疫反應，因此可預防或治療變態(tài)反應，細菌毒素或其片段，包括合成肽類或相應的核酸遺傳信息，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止對所述毒素的免疫反應，該毒素是在導致炎癥和組織損傷的全身位點處遇到的；這種情況的例子是由全身施用內毒素(由革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的一組脂多糖)和某些外毒素(如葡萄球菌腸毒素)而誘導的敗血癥樣中毒性休克綜合癥。在這種情況下，粘膜施用本發(fā)明試劑中與粘膜結合分子相連接的所說毒素或其片段可以避免組織損傷性免疫反應的產(chǎn)生。實驗本發(fā)明通過使用CTB和LTB作為粘膜結合分子，使用綿羊紅血細胞(SRBC)和人γ-球蛋白(HGG)作為抗原/耐受原來舉例說明。而本發(fā)明不以任何方式限于抗SRBC或HGG的耐受誘導，這些抗原分別被選作顆粒和可溶性抗原的模型，因為它們是關于抗體形成和細胞介導的免疫反應方面鑒定得最好的口服耐受的，典型的延遲型超敏(DTH)反應使后一反應成為代表。在自身免疫疾病、變態(tài)反應性反應，移植物排異和其它炎癥疾病的產(chǎn)生中已涉及到這些類型的免疫反應。使用髓鞘堿性蛋白質和同種異體鼠胸腺細胞可進一步舉例說明本發(fā)明，當前者與CTB連接并經(jīng)口服時可抑制實驗性自身免疫腦炎，后者與CTB連接并經(jīng)口服時可延長同種異體移植體的存活期。提供下列實驗目的是闡明本發(fā)明，而不會以任何方式限制本發(fā)明范圍。材料和方法小鼠近交的Balb/c雌性小鼠，得自瑞典。Gteborg大學醫(yī)學微生物學及免疫學系的動物管理所，所使用的小鼠為6-8周齡。粘膜結合分子CTB和LTB的純化在缺失霍亂毒素基因并經(jīng)編碼CTB亞單位的質粒轉染的霍亂弧菌突變體菌株中生產(chǎn)重組霍亂毒素B亞單位(CTB)(SanchezJ.andHolmgrenJ.1989.RecombinantsystemforoverexpressionofcholeratoxinBsubunitinVibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86481-485)。類似地，在缺失霍亂毒素基因并經(jīng)編碼大腸桿菌LTB的質粒轉染的霍亂弧菌突變體菌株中生產(chǎn)大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LTB)的重組B亞單位(HirstT.R.SanchezJ.KaperJ.B.，HardyS.J.S.andHolmgrenJ.1984.MechanismoftoxinsecretionbyVibriocholeraeihvestigatedinstrainsharbouringplasmidsthatencodeheat-labileenterotoxinsofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA817752-7756)。在這些表達系統(tǒng)中，CTB和LTB以分泌蛋白質的形式從細菌培養(yǎng)基中被回收。以每分鐘8000rev的轉速離心細菌培養(yǎng)物20分鐘，收集上清液，用稀HCl調節(jié)pH值至4.5。在23℃用六偏磷酸鹽(終濃度為2.5g/l)沉淀2小時后以每分鐘8000rev的轉速離心，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)溶解沉淀物，并對0.01M磷酸緩沖鹽水(pH7.2)透析。然后以每分鐘15000rev的轉速離心透析液以除去殘留的不溶性物質，經(jīng)由0.22μm濾網(wǎng)(Millipore，Bedford，MA)過濾進一步澄清上清液，最后通過SephadexG-100柱(Pharmacia，Sweden)經(jīng)標準的凝膠過濾層析純化CTB和LTB。人γ球蛋白(HGG)的純化用(NH4)2SO4溶液(終濃度40％體積∶體積)經(jīng)順序沉淀從人血清庫中純化HGG，然后在預先經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉，NaCl0.1M、pH8.5)平衡的SephacrylS-300HR柱(Pharmacia，Sweden)上進行凝膠過濾層析，將所得HGG制品稀釋至15mg/ml。與CTB連接的綿羊紅血細胞(SRBC-CTB)的制備將綿羊紅血細胞(SRBC)貯存于4℃下的Alsevier氏溶液中直至使用，使用前，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(0.01M磷酸鈉、0.15MNaCl、pH7.4)以每分鐘3000rev的轉速離心10分鐘將SRBC洗滌3次，然后重新懸浮于PBS中以使細胞濃度為5×109SRBC/ml。為了便于CTB與SRBC的連接，先將SRBC與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂連接。按1∶2(體積/體積)的比例在收集的SRBC中加入含有300nmol/mlGM1神經(jīng)節(jié)苷脂(SigmaChemicalCo.，StLouis，MO)的PBS溶液，37℃下在振蕩水浴中保溫2小時。用PBS洗滌3次以除去過量GM1后，將包裹有GM1的紅細胞重新懸浮于PBS中以使細胞濃度為5×109SRBC/ml并與重組CTB(SanchezJ.andHolmgrenJ.1989RecombinantSystemforoverexpressionofcholeratoxinBsubunitinVibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86481-485)(終濃度為50μg/ml)混合。37℃下在振蕩水浴中保溫2小時以使CTB與GM1包裹的SRBC結合，然后用PBS將紅細胞懸液洗滌兩次以除去未與細胞結合的CTB，并重新懸浮以使每mlPBS中含1×1010個細胞。為了確定CTB分子已與GM1-連接的SRBC結合并仍可以結合另外的GM1分子，可以使用固相血細胞吸附試驗，該試驗使用了固定于塑料孔上的GM1。用含有0.1％(重量/體積)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的PBS將紅細胞懸液的等分試樣稀釋至終濃度為1％(收集的體積/體積)，并在塑料微量滴定析(Costar)被GM1包被的U形孔中加入該等分試樣。室溫(22℃)下保溫之后，檢測孔中血細胞吸附的出現(xiàn)。未被GM1包被的對照孔中無血細胞吸附現(xiàn)象，在與紅血細胞保溫的過程中，在被GM1包被的孔中加入無細胞CTB則可以劑量依賴的方式阻止血細胞吸附現(xiàn)象，借此可確定測定法的特異性。與LTB連接的綿羊紅血細胞(SRBC-LTB)的制備按上述SRBC與CTB連接的方法將被GM1包被的SRBC(5×109GM1-SRBC/ml)與重組LTB(50μg/ml)連接。與CTB連接的人γ-球蛋白(HGG-CTB)的制備分別以1∶5和1∶10摩爾比將CTB和HGG與N-琥珀酰亞胺基(3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)Carlsson，J.，H.Drewin，andR.Axen.1978.Proteinthiolationandreversibleprotein-proteinconjugation，N-succinimidyl3-(2-pyridyl-dithio)propionateanewheterobifunctionalreagent.Biochem.J.173723-737.1)在HGG中加入SPDP，23℃下將混合物攪拌保溫30分鐘，在經(jīng)用醋酸鹽緩沖液(0.1M醋酸鈉、0.1MNaCl、pH4.5)平衡的SephadexG-25柱上(Pharmacia，Sweden)凝膠過濾以除去過量的SPDP。23℃下用二硫蘇糖醇(DTT)(終濃度為50mM)將SPDP衍生化的HGG還原20分鐘，使所得制品流過經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉、NaCl0.1M、pH8.5)平衡的SephadexG-25柱以除去過量的DTT以及在還原SPDP-衍生化的HGG過程中釋放的吡啶-2-硫酮。用磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉、NaCl0.1M、pH8.5)將CTB稀釋至2mg/ml，用HGG按上述但以5∶1(SPDP∶CTB)的摩爾比制備SPDP衍生化的CTB。將所得制品流過經(jīng)相同緩沖液預平衡的SephadexG-25柱以除去過量的未反應的SPDP。以等摩爾比混合SPDP衍生化的HGG和CTB，于23℃保溫16小時。用SephacrylS-300柱凝膠過濾除去游離的CTB和/或HGG以純化所得的CTB-HGG連接物。使用ELISA顯示出所得連接物具有GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結合能力并同時保留了CTB和HGG的血清學反應性，所述ELISA使用Gm1(SigmaStLouis.MO)作為固相捕捉系統(tǒng)(Svennerholm，A.-M.andJ.Holmgren.1978.IdentificationofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinbymeansofagangliosideimmunosorbentassay(GM1-ELISA)procedure.Curr.Microbiol.119-23。使用CTB和HGG的單克隆和多克隆抗體作為檢測試劑(見下文)。在預先被GM1神經(jīng)苷脂包被的聚苯乙烯孔以及經(jīng)抗HGG的兔多克隆IgG抗體包被的孔中將連接物與純化的CTB-和HGG-SPDP衍生物的系列兩倍稀釋物保溫，然后，依次使用與辣根過氧化物酶(HRP)連接的兔抗-HGG或鼠單克隆抗-CTB抗體(大致稀釋于含0.05％吐溫20的PBS中)以及酶底物以檢測結合于固相的HGG和CTB。參照用已知量的SPDP衍生化抗原校正的標準曲線以測定游離和結合的HGG和CTB的量。一般說來，上述SPDP連接步驟和純化方法生產(chǎn)出的制品所含的游離HGG量可忽略不計，游離CTB的量低于10％。免疫方法用SRBC免疫接種首次全身免疫接種用含107SRBC的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的左右足墊。二次全身免疫接種首次免疫接種五天后，用含108SRBC的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的右后足墊以攻擊小鼠。用HGG免疫接種接種前，于63℃加熱30分鐘以聚集HGG。首次全身免疫接種將0.2ml乳化于Freund氏完全佐劑(Difco，StLouis.MO)中的聚集HGG(500μg)皮下注射到小鼠肋間以施用給小鼠。二次全身免疫接種首次免疫接種五天后，用含1mgHGG的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的左右足墊以攻擊小鼠。口服耐受誘導方法在用SRBC首次全身免疫接種之前或之后的不同時間，將單一劑量或每天連續(xù)劑量的SRBC或SRBC-CTB施用給小鼠。每種劑量含有于0.5mlPBS中的2.5×109個SRBC或SRBC-CTB，這些劑量是通過使用嬰兒導管喂養(yǎng)管的胃內途徑施用的。對照動物僅施用0.5mlPBS。為誘導對HGG的耐受，可在用HGG首次全身免疫接種前一周，經(jīng)胃內導管將單一口服劑量的未連接的HGG或與CTB連接的HGG施用給小鼠，所試驗的未連接的HGG劑量為1mg和5mg，與CTB連接的HGG劑量為60μg。對延遲型超敏(DTH)反應的評價對SRBC的DTH在用SRBC二次全身免疫接種前以及2、4、24和48h之后立即用刻度厚度測量器(Oditest.H.C.Kplin.Schluchtern.Essen.Germany)測量右足墊的厚度。通過從攻擊后不同時間所得值中減去攻擊前所得值可測定各個動物的DTH反應強度。對HGG的DTH按上述對SRBC的方式評價對注射于右足墊的HGG的DTH反應強度。血清抗體反應的評價血清抗-SRBC抗體反應經(jīng)施用于左足墊的SRBC首次全身免疫接種之前和二次全身免疫接種1-2周后，立即從各個小鼠的尾靜脈中收集血樣并于室溫下凝集60分鐘，于56℃下加熱血清45分鐘以使補體失活，然后通過直接和間接血凝測定法檢測抗SRBC的抗體水平。對于直接血凝測定法，可在微量滴定板的U形底孔中用含有0.1％(重量體積)牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA)制備血清樣品的系列2倍稀釋液。在所有孔中加入50μl0.5％(收集體積/體積)SRBC于PBS-BSA中的懸液，將培養(yǎng)板于室溫下保溫1小時，再于4℃下保溫過夜，然后檢查孔中的血細胞凝集現(xiàn)象。為了檢測已與SRBC結合但未血凝的抗體，可在對應于直接血凝測定法中血清稀釋液陰性的孔中加入25μl含有熱失活(56℃，45分鐘)的兔抗小鼠IgG和小鼠IgA的抗血清(最終稀釋度1∶50)混合物的PBS。然后振蕩培養(yǎng)板以使SRBC重新懸浮，并在4℃下靜止保溫2小時。再檢查孔中的血細胞凝集現(xiàn)象。測定直接導致或加入抗小鼠抗血清(在間接血凝測定法中)之后導致血凝現(xiàn)象的任何所給小鼠血清的相互最高稀釋度并將之定義為所述小鼠血清的抗-SRBC抗體的效價。血清抗-HGG抗體反應通過標準固相ELISA測定抗HGG的血清IgM和IgG抗體水平，該ELISA使用被HGG包被的聚苯乙烯微乳作為固相捕捉系統(tǒng)，使用與HRP連接的經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠IgG和小鼠IgM的抗體(SouthernBiotechnologyAssociates，Birmingham，AL)作為檢測試劑。用含0.05％吐溫20的PBS制備小鼠血清的系列5倍稀釋液，于23℃在被HGG包被的孔中保溫2小時，用含0.05％吐溫20的PBS洗滌5次后，加入大致稀釋的抗小鼠IgM或IgG的HRP-抗體。兩小時后，用PBS沖洗培養(yǎng)板，通過加入發(fā)色團底物即可顯示出固相結合酶的活性，該底物含有ABTS藥片(SouthernBiotechnologyAssociates)，此藥片溶解于檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中(pH5.0并含有H2O2)。30分鐘后用自動分光光度計(Titerscan，F(xiàn)lowLaboratories)監(jiān)測吸光值，將給出的吸光值至少兩倍于對照孔值(只暴露于緩沖液中而無血清)的相互最高稀釋度定義為鼠血清的抗-HGG抗體效價。體外淋巴細胞增殖試驗將得自二次全身免疫接種后1-2周的淋巴細胞于Iscove氏培養(yǎng)基(GibcoEurope.U.K.)中切碎并壓過無菌尼龍篩-目屏以產(chǎn)生單細胞懸液。將細胞洗滌兩次并以2×106個細胞/ml的濃度重新懸浮于Iscove氏培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補加了5％熱滅活的胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺(1％)、丙酮酸鈉(1％)、非必需氨基酸(1％)、2-疏基乙醇(5×10-5M)和慶大霉素(20μg/ml)。在含有預先滴定量SRBC(總體積為200ml)的平底微量滴定(Nunc，Denmark)孔中加入淋巴結細胞，然后于37℃在5％CO2的空氣中將培養(yǎng)板保溫3天，在最后16小時的過程中用3H胸苷(2.0mCi/mM，Amersham，Stockholm)脈沖培養(yǎng)物，使用96孔自動細胞收集器(Inotech，Basel，Switzerland)收集各個孔中的細胞，用氬-激活的閃爍計數(shù)器(Inotech)測量放射性核苷酸的摻入。3H-胸苷摻入的水平計算為受激指數(shù)(S.I.)＝淋巴結細胞的CPM+僅僅淋巴結細胞的SRBC/CPN。實施例1口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以預防早期和晚期延遲型超敏(DTH)反應在給小鼠左后足墊注射SRBC的首次全身免疫接種前1至8周給小鼠喂單一劑量的SRBC-CTB、僅喂SRBC或鹽水。注射后5天，攻擊小鼠右后足墊以產(chǎn)生DTH反應。只喂給SRBC的小鼠產(chǎn)生的DTH反應的強度與只喂給鹽水的對照小鼠記錄到的強度差不多(表2)，相反，在所有記錄時間處，喂給與粘膜結合分子CTB連接的SRBC之小鼠記錄到的DTH反應有相當程度的降低，因此，用SRBC攻擊后2小時，即對應子對照(只喂給鹽水)動物中所見DTH反應早期峰出現(xiàn)的時間，在預先喂給單一劑量SRBC-CTB的小鼠中未發(fā)現(xiàn)足墊腫脹。另外，與喂給鹽水的對照動物以及僅喂給SRBC的動物相比，攻擊后24小時的小鼠之晚期DTH反應峰顯著降低。在第二套實驗中，給小鼠喂單一劑量或每天連續(xù)劑量的SRBC-CTB或SRBC，最后一次口服后一周，如上所述在小鼠左足墊全身注射SRBC，5天后再在左足墊注射以致敏和攻擊動物，已發(fā)現(xiàn)需要每天口服SRBC達3-4周才能使抑制24小時DTH反應的水平同一服用一劑與CTB連接的SRBC所達到的水平相當(表3)。然而應指出在4周的期間內用SRBC連續(xù)喂給達20次之久對DTH反應早期(2-4小時)的產(chǎn)生并無影響，這與喂給單一劑量與CTB連接的SRBC而不會產(chǎn)生早期DTH反應的動物中所看到的情況相反。實施例2在免疫小鼠中通過口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應為了測定粘膜施用與CTB連接的抗原是否可抑制預先被所述抗原全身致敏之動物的DTH反應，首先用SRBC注射小鼠的左后足墊以誘導首次全身免疫狀態(tài)，四天后，喂給小鼠單一口服劑量的與CTB相連接的SRBC，只喂給SRBC或鹽水。后一次喂給后兩天，第二次用SRBC注射小鼠的右足墊以產(chǎn)主DTH反應。在再次全身免疫接種后的不同時間監(jiān)測后期的DTH反應。僅喂給SRBC的小鼠所產(chǎn)生的DTH反應與僅喂給鹽水的對照動物中所見的DTH反應沒有區(qū)別，而喂給了與CTB連接之SRBC的小鼠對SRBC的早期和晚期DTH反應顯著降低。因此，這表明口服與CTB連接之SRBC甚至可在預先被SRBC全身致敏的動物中誘導對全身注射SRBC所致的早期和晚期DTH反應的抑制。實施例3口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制淋巴細胞增殖為了測定口服與CTB連接的抗原是否可導致淋巴結細胞對所述抗原的增殖反應有所降低，給小鼠喂單一劑量與CTB連接的SRBC，然后用SRBC注射左足墊(首次全身體內免疫接種)。一周后，檢查小鼠淋巴結細胞體外暴露于同種抗原(SRBC)之后的增殖能力。與僅喂給鹽水的對照動物和僅喂給單一劑量SRBC的動物相比，得自喂給與CTB連接之SRBC的動物的淋巴結細胞當與SRBC一起培養(yǎng)時，增殖反應降低(表4)。這種降低對服用的抗原而言是特異性的，因為在喂給SRBC-CTB、僅喂給SRBC或鹽水的動物中，淋巴結細胞對促細胞分裂劑伴刀豆球蛋白A的增殖反應差不多(表4)。實施例4口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制血清抗體反應為了測定口服與CTB連接的抗原是否可導致對全身服用抗原的抗體反應有所降低，在用SRBC注射左后足墊以進行首次全身免疫接種前1至8周，給小鼠喂單一劑量的SRBC-CTB、只喂SRBC或鹽水。注射后5天，攻擊小鼠的右后足墊，一周后從尾靜脈收集血液，內直接和間接血細胞凝集試驗測定抗SRBC的血清抗體水平。如表5所示，與僅喂給鹽水或單一劑量SRBC的動物相比，喂給了單一劑量SRBC-CTB的動物抗SRBC的血清抗體反應有所降低。必需每天口服SRBC達3周才能使其抑制對全身服用SRBC的血清抗體反應的水平同只服用與CTB連接之SRBC所能達到的水平差不多(表5)。實施例5口服與大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應為了測定粘膜服用與其它粘膜結合分子，即大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的SRBC是否也可抑制對全身服用的SRBC的DTH反應，在用SRBC首次足墊注射前一周，給小鼠喂單一劑量的SRBC-LTB或鹽水。為進行對比，給另一組小鼠喂SRBC-CTB，首次注射后5天，用SRBC攻擊所有小鼠的對側足墊以產(chǎn)生DTH反應。攻擊后24小時，喂給了SRBC-LTB的小鼠與喂給鹽水的對照小鼠相比，記錄下的DTH反應顯著降低(表6)。然而，喂給了SRBC-LTB的小鼠的早期(2-4小時)DTH反應并未降低，這與喂給了SRBC-CTB的小鼠在攻擊后2-4小時無DTH反應而在24-48小時DTH反應顯著降低的情況相反(表6)。這些研究成果表明口服與LTB連接的SRBC可誘導對全身注射的SRBC之晚期DTH反應的抑制，但不會影響這種反應的早期成分。實施例6口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的HGG以抑制對人γ球蛋白(HGG)的早期和晚期延遲型超敏(DTH)反應為了測定經(jīng)粘膜施用與CTB連接的抗原是否可抑制對可溶性蛋白質抗原的DTH反應，在使用于Freund氏完全佐劑中的HGG皮下注射以進行首次全身免疫接種前一周，給各組小鼠喂單一劑量與CTB連接的HGG，僅喂HGG或鹽水。此次注射后5天，用HGG攻擊小鼠右后足墊以產(chǎn)生DTH反應。攻擊后的檢查的所有時間處，僅喂給1mgHGG的小鼠所產(chǎn)生DTH反應的強度與僅喂給鹽水的對照小鼠差不多(表7)。喂給小鼠5mgHGG可在24-48小時處導致DTH反應降低但不會影響這些反應早期(2-4小時)相的強度。與此相反，在僅喂給15μg與CTB連接之HGG(比HGG的量低300多倍)的小鼠中監(jiān)測到的DTH反應具有類似的效果，它在24小時處而不是在早期時間(2和4小時)處比對照(喂給鹽水)動物的相應反應低很多。然而，給小鼠喂66μg與CTB連接的HGG可在所有記錄時間處導致顯著降低的DTH反應，因此，在喂給了66μg與CTB連接的HGG的小鼠中有效抑制了早期(2-4小時)和晚期(24-48小時)DTH反應。這些研究成果表明口服少量與粘膜結合分子CTB連接的可溶性蛋白質抗原可誘導對隨后用所述蛋白質抗原全身注射所產(chǎn)生的早期和晚期DTH反應的抑制。實施例7口服與CTB連接的髓鞘堿性蛋白質以抑制實驗性自身免疫腦炎(EAE)。髓鞘堿性蛋白質(MBP)的純化如Deibler等人所述(DeiblerGE.MartensonRE.KiesMW.1972，Largescalepreparationofmyelinbasicproteinfromcentralnervoustissueofseveralmammalianspecies，Prep.Biochem.2139-165)由豚鼠的脊髓和腦制得MBP。通過在約20kD處顯現(xiàn)單一的標準SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定MBP的純度，在類似于已描述的HGG與CTB連接的條件下，使用SPDP法將MBP與CTB連接。通過GM1-ELISA確證連接物中MBP的存在，該ELISA使用的血清來自被FCA中的MBP免疫的大鼠。使用標準固相夾心ELISA(對于MBP)和GM1-ELISA(對于CTB)將所試驗的CTB和MBP純化制品一一進行比較即可測定連接物中MBP和CTB的相對比例，這兩種EISA分別使用抗-MBP和GM1作為固相捕捉試劑，分別使用與HRP連接的大鼠抗-MBP抗血清和小鼠抗-CTB單克隆抗體以檢測捕捉到的MBP和CTB。實驗性自身免疫腦炎(EAE)的誘導為誘導EAE(KiesMW.MurphyJB.AlvordEC.1960，F(xiàn)ractonationofguineapigproteinswithencephalitogenicactivity.Fed.Proc.19207)，可在乙醚麻醉下，用總量為100微克且乳化于Freund氏完全佐劑(FCA)(Difco，Detroit，MI.USA)(1∶1.體積∶體積)中的豚鼠MBP注射8-10同齡(體重為170-240g)的雌性路易斯大鼠(ZentralInstitutfürVersuchstierzucht，Hannover，Germany)的兩只后足墊(大約有50微克MBP經(jīng)過足墊)。此次注射后，每天對動物如此注射達30天。每隔兩天，檢查動物臨床癥狀的出現(xiàn)及其測定的體重。使用標準臨床分級系統(tǒng)測定疾病的強度(MillerA.Lider0.AlsabbaghA.WeinerHL.1992，Suppressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyoraladministrationofmyelinbasicprotein.V.Hierarchyofsuppressionbymyelinbasicproteinfromdifferentspecies，J.Neuroimmunol.39243-250)0級無疾病1級尾部無力2級輕微的后肢麻痹3級嚴重的后肢麻痹伴有四肢外張4級影響到全部四只足墊的完全后肢麻痹5級死亡口服耐受方法在足墊注射MBP以誘導EAE之前，給各組動物施予下列試劑組1在足墊注射MBP(指的是第0天)前的第-7天給動物施用0.5mlMBP-CTB連接物，其相當于溶于0.6M碳酸氫鹽緩沖液中的20微克MBP和100微克CTB；組2在足墊注射MBP前的5個連續(xù)的時間，即第-11天、第-9天、第-7天、第-5天，第-3天，給動物施用0.5ml含有5mgMBP和10mg大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的0.6M碳酸氫鹽緩沖液以使對MBP的蛋白酶裂解降解的程度最低(WhitacreCC.GienapIE.OroszCG，BitarD.1991，Oraltoleranceinexperimentalautoimmuneencephalitis，III.Evidenceforclonalanergy.J.Immunol.1472155-63)組3按照組2限定的時間表，在5個連續(xù)的時間給動物施用0.5ml鹽水(對照)；組4按照組2限定的時間表，在5個連續(xù)的時間給動物施用0.5ml只含有10mg大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的0.6M碳酸氫鹽緩沖液(對照)?？诜cCTB連接的MBP以抑制EAE用乳化于FCA的MBP或僅用FCA注射動物組的后足墊，這些組各包括5只成年雌性路易斯大鼠。在足墊注射MBP＋FCA前11、9、7、5和3天，預先用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)喂養(yǎng)的對照動物(組4)，注射后12至14天所出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀最嚴重，所有動物都出現(xiàn)嚴重的麻痹現(xiàn)象(表8)。以單一劑量喂給少量20微克與CTB相連接之MBP的動物(組1)不出現(xiàn)(5只大鼠中的4只)或僅出現(xiàn)輕微的癥狀(在另一只大鼠中出現(xiàn)的與右后足墊輕癱相關的短暫尾部輕癱)(表8)。在5個連續(xù)時間喂給5mgMBP與STI的動物(MBP的總量為25mg，比組1動物MBP的劑量高1250倍)也不會產(chǎn)生嚴重的EAE病(組2)(表8)。因此，口服少量與CTB連接的MBP可抑制EAE。實施例8口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細胞以延長鼠同種異體移植的存活期鼠胸腺細胞與CTB的連接為增強CTB與鼠淋巴細胞的結合，首先于37℃下將5×107個胸腺細胞與10nmolGM1神經(jīng)節(jié)苷脂在總體積為0.5ml的Iscove氏最低必需培養(yǎng)基(IMEM)中混合2小時，從而使C57BL/6小鼠(主要組織相容性復合體(MHC)單倍體型H-2b)的胸腺細胞與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂衍生化。然后用無致熱原的無菌鹽水將細胞洗滌3次以除去未結合的GM1，37℃下以0.5ml的總體積與25微克CTB一起再保溫2小時。最后用鹽水洗滌細胞以除去未結合的過量CTB，保存于冰上直至使用。通過對與不同量GM1衍生化并暴露于不同濃度經(jīng)四甲基若丹明-標記的CTB(ListBiologicalLaboratoriesInc.，Campbell，CA.USA)中的鼠胸腺細胞進行流式細胞計數(shù)分析，測定出所需GM1和CTB的濃度應能使胸腺細胞達到最大飽和量。異位鼠心臟移植從新生(出生后不超過36小時)C57BL/6小鼠中收集供體心臟并沿著室間隔切開，將心臟的各一半插入6至8周齡Balb/c小鼠(MHC單元型H-2d)的一只耳或兩只耳背側部分的皮下囊處。為了進行比較，各組Balb/c受體小鼠接受同系Balb/c新生小鼠的心臟。每天用Tektronix心臟鏡測量移植物的電活性以評價移植體功能。排異時間被定義為心肌收縮完全停止已發(fā)生的那一天。口服耐受的方法同種異體移植植入之前和/或之后的不同時間，用嬰兒導管式喂養(yǎng)管給成年Balb/c受體小鼠喂體積為0.5ml的無致熱原鹽水，它可含有——在移植前3天和移植后1和4天，施予新生C57BL/6小鼠的未連接的胸腺細胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的未連接的胸腺細胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的與CTB連接的胸腺細胞；——在移植前片刻(30-60分鐘)施予新生C57BL/6小鼠的與CTB連接的胸腺細胞；——或僅施予鹽水?？诜c霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細胞以延長鼠異位心臟同種異體移植的存活期在H-2位點處接受了組織不相容的新生C57BL/6供體小鼠之異位心臟移植的Balb/c小鼠平均在8天內即對它們的移植物排異(表9)，與此相反，接受了H-2組織相容性心臟移植的小鼠可將有功能的移植物保持2個多月。在植入同種異體移植心臟前(-7、-4和-1天)和/或后(-3、+1和+4)口服作為供體小鼠的同種新生H-2組織不相容性小鼠的胸腺細胞不會延長，在某些情況下甚至會降低Balb/c小鼠受體的移植存活期(表9)。與此相反，在同種異體植入前(-7、-4和-1天)口服3劑量與CTB連接的胸腺細胞，則基本上可提高(平均為56％)心臟移植的存活率(表9)。而且，在移植前立即施用單一口服劑量的與CTB連接的C57BL/6胸腺細胞可在同種異體必臟移植的受體小鼠中延長(平均為39％)移植物存活期(表9)?？傊?，這些實驗結果表明口服與CTB連接的組織不相容性淋巴細胞可延長同種異體移植的存活期。表2.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以防止早期和晚期延遲型超敏反應星號表示試驗組(每組6只動物)和包括僅喂給鹽水的動物(7只小鼠)的對照組所測定的值之間有顯著差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t檢驗)表3.在免疫小鼠中通過口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應<p>星號表示試驗組(每組6只動物)和包括攻擊前用SRBC致敏但僅喂給鹽水的動物對照組(6只小鼠)所測定的值之間有顯著差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗)表4.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以抑制抗原特異性淋巴細胞增殖<*表示給SRBC-CTB的試驗動物和僅喂給SRBC或僅喂給鹽水的動物之間有顯著的差異(p＜0.01；Student′t試驗)表5.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的SRBC之后可抑制對SRBC的血清抗體反應<*表示給SRBC-CTB的試驗動物(n＝6只小鼠)和僅喂給SRBC(n＝6只小鼠)或鹽水(n＝5只小鼠)的動物之間有顯著的差異(p＜0.001；Student′t試驗)表6.口服與大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的綿羊紅血細胞(SRBC)以防止晚期延遲型超敏反應<>星號表示試驗組(每組7只小鼠)和僅喂給鹽水的對照動物(n＝6只小鼠)之間有顯著的差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗)表7.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的人γ-球蛋白(HGG)以防止早期和晚期延遲型超敏反應ξ皮下注射0.5mg于Freund氏完全佐劑中的熱一聚集HGG以使動物致敏，用1mg于鹽水中的HGG注射右足墊以攻擊動物。星號表示試驗組(組I-IV，n＝每組6只小鼠)和僅喂給鹽水的對照動物(組V，n＝6只小鼠)之間有顯著的差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗)表8.口服與CTB連接的髓鞘堿性蛋白質以抑制路易斯大鼠的實驗性自身免疫腦炎(EAE)a)臨床級別≥2表9.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細胞以延長鼠異位心臟同種異體移植的存活期a在標明的時間給成年Balb/c小鼠受體喂5×107個新生胸腺細胞或與CTB連接的胸腺細胞(每只小鼠25μg)，在第0天使小鼠接受心臟移植。b按下列方法計算移植存活期的相對增長(喂給了胸腺細胞之小鼠的平均排異時間減去喂給了鹽水之對照小鼠的平均排異時間，其差值除以喂給了鹽水之對照小鼠的平均排異時間)×100。從上述實施例可明顯看出本發(fā)明的免疫耐受誘導劑可有效抑制對全身免疫反應的誘導并可防止其表達。另外，該試劑還可使口服誘導耐受化的已報道方法所必需的抗原/耐受原的絕對量和/或劑量的數(shù)目降至最低。從上述實施例可推斷出，使用本發(fā)明的免疫耐受誘導劑可預防或延遲與延遲型超敏反應的早期和晚期相相關的炎癥免疫反應、自身免疫疾病(實施例8)和同種異體移植排異(實施例9)的產(chǎn)生。權利要求1.免疫耐受誘導劑，它包含與特異耐受原相連接的粘膜結合分子。2.根據(jù)權利要求1的試劑，其中所述粘膜結合分子選自衍生于細菌毒素的粘膜結合結構、細菌菌毛、病毒粘附蛋白質和植物凝集素的粘膜結合分子。3.根據(jù)權利要求2的試劑，其中所述細菌毒素的粘膜結合結構選自包含霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的組中。4.權利要求3的試劑，其中所述粘膜結合結構是毒素的結合片段。5.根據(jù)權利要求4的試劑，其中所述毒素的結合片段是霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞單位。6.根據(jù)權利要求1的試劑，其中所述特異耐受原選自特異抗原，包括半抗原，它可導致個體中不希望的免疫反應。7.根據(jù)權利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應與全身抗體的產(chǎn)生相關。8.根據(jù)權利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應與延遲型超敏反應相關。9.根據(jù)權利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應與自身免疫疾病、變應性疾病、組織或細胞移植排異事件和/或急性或慢性炎癥反應或疾病相關。10.根據(jù)權利要求6的試劑，其中所述抗原選自包含蛋白質、肽類、糖類、脂類和核酸的組中。11.根據(jù)權利要求1的試劑，其中所述耐受原和所述粘膜結合分子直接或間接相互連接。12.根據(jù)權利要求11的試劑，其中所述耐受原和所述粘膜結合分子在下組成員之一的幫助下間接地相互連接，該組包含間隔分子，含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保護性載體或所述間隔分子與所述耐受原/抗原(包括半抗原)的雜合分子，該雜合分子可以經(jīng)表達融合基因或核苷酸序列得到。13.根據(jù)權利要求12的試劑，其中所述間隔分子選自對所述耐受原或含有耐受原的載體以及所述粘膜結合分子中任一者或兩者具有結合親和力的分子。14.根據(jù)權利要求13的試劑，其中所述間隔分子是抗體。15.根據(jù)權利要求13的試劑，其中所述間隔分子是或衍生于GM1神經(jīng)節(jié)苷脂、半乳糖基-N-乙?；?氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神經(jīng)酰胺的霍亂毒素結合結構。16.在抗特異性抗原，包括半抗原的個體中誘導免疫耐受的方法，所述抗原在所述個體中可引起不希望的免疫反應，該方法包括經(jīng)粘膜途徑給所述個體用免疫有效量的根據(jù)權利要求1的試劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種免疫耐受誘導劑，它包含與特異性耐受原相連接的粘膜結合分子，另外，本發(fā)明還描述了在抗特異性抗原(包括半抗原)的個體中誘導免疫耐受的方法，該抗原在所述個體中可導致不希望的免疫反應，該方法包括通過粘膜途徑給所述個體施用免疫有效量的本發(fā)明的免疫耐受誘導劑。文檔編號A61K39/385GK1135182SQ94194189公開日1996年11月6日申請日期1994年10月7日優(yōu)先權日1993年10月8日發(fā)明者J·霍姆格倫,C·切爾金斯基申請人:多托爾公司