專利名稱：用復(fù)合酶酶解牡蠣制備具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用復(fù)合酶分步定向酶解牡蠣制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶抑制劑是一類具有腫瘤抑制活性的物質(zhì)，目前牛肺胰蛋白酶抑制劑和人尿胰蛋白酶抑制劑已經(jīng)被開發(fā)成腫瘤的輔助藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。國外已有人以太平洋褶柔魚、鰹魚、河豚魚、對蝦、白姑魚、長蛇鯔魚等水產(chǎn)品為原料，分別從其肝臟、卵、表皮粘液和肌肉中分離到了蛋白酶抑制劑，所得產(chǎn)品主要應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療。但是，迄今尚未見從蛋白水解物中提取蛋白酶抑制劑的報道。目前存在的問題主要是天然胰蛋白酶抑制劑的含量非常有限，而且提取比較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用復(fù)合酶定向酶解牡蠣制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種用復(fù)合酶分步定向酶解牡蠣制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是將牡蠣肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl緩沖液打漿，按照550～650U/g肉的比例加入風(fēng)味堿性蛋白酶，恒溫攪拌，在45～55℃下酶解1～2小時，然后滅酶，冷卻；用鹽酸調(diào)pH至5-6，按照650-750U/g肉的比例加入菠蘿蛋白酶，攪拌，45-55℃下恒溫酶解1-2小時，滅酶，冷卻，離心，取上清液經(jīng)過10k超濾膜和Sephadex G-25柱層析分離純化后，凍干。
本發(fā)明以低值的牡蠣為原料，利用風(fēng)味堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶復(fù)合酶解制備具有胰蛋白酶抑制活性的肽，所得產(chǎn)物活性高，對商品胰蛋白酶活性的抑制率可達67％。
具體實施例方式將牡蠣肉加入2～4倍，最好是3倍肉重的Tris-HCl緩沖液(0.05M、pH8.5)中打漿，體系最初pH為8～9，最好是8.5。按照550～650U/g肉，最好是600U/g肉的比例加入風(fēng)味堿性蛋白酶(Alcalase)，在45～55℃，最好是50℃下恒溫攪拌，酶解1～2小時，最好是1小時，然后100℃滅酶，冷卻至40-50℃，最好45℃；用鹽酸調(diào)pH至5-6，最好是5.5，按照650-750U/g肉，最好是700U/g肉的比例加入菠蘿蛋白酶，攪拌，在45-55℃，最好是50℃下恒溫酶解1-3小時，最好是2小時，然后100℃滅酶，冷卻至常溫，4000r/min以上的轉(zhuǎn)速下離心，取上清液經(jīng)過10k超濾膜和Sephadex G-25柱層析分離純化后，凍干即得到具有胰蛋白酶抑制活性的肽(分子量≤10k)。
權(quán)利要求
一種用復(fù)合酶分步定向酶解牡蠣制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是將牡蠣肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl緩沖液打漿，按照550～650U/g肉的比例加入風(fēng)味堿性蛋白酶，恒溫攪拌，在45～55℃下酶解1～2小時，然后滅酶，冷卻；用鹽酸調(diào)pH至5-6，按照650-750U/g肉的比例加入菠蘿蛋白酶，攪拌，45-55℃下恒溫酶解1-2小時，滅酶，冷卻，離心，取上清液經(jīng)過10k超濾膜和Sephadex G-25柱層析分離純化后，凍干。
全文摘要
一種用復(fù)合酶分步定向酶解牡蠣制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是將牡蠣肉加入2～4倍肉重的Tris－HCl緩沖液(0.05M、pH8.5)打漿，按照550～650U/g肉的比例加入風(fēng)味堿性蛋白酶，恒溫攪拌，在45～55℃下酶解1～2小時，然后滅酶，冷卻；用鹽酸調(diào)pH至5－6，按照650－750U/g肉的比例加入菠蘿蛋白酶，攪拌，45－55℃下恒溫酶解1－2小時，滅酶，冷卻，離心，取上清液經(jīng)過10k超濾膜和Sephadex G－25柱層析分離純化后，凍干。本發(fā)明以低值的牡蠣為原料，利用風(fēng)味堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶復(fù)合酶解制備具有胰蛋白酶抑制活性的肽，所得產(chǎn)物活性高，對商品胰蛋白酶活性的抑制率可達67％。
文檔編號A61P35/00GK1724683SQ20051004415
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
發(fā)明者曾名湧, 崔海英, 劉尊英, 董士遠 申請人:中國海洋大學(xué)