專利名稱：對(duì)cd122的抗體的制作方法
對(duì)CD122的抗體
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序列清單參考
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在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞的一個(gè)亞群上表達(dá)的⑶122為525氨基酸 長(zhǎng)度的 I 型膜蛋白(Zamai 等，J. Biol. Regul. Homeost. Agents 15:95-97(2001))。CD 122分子是白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素15(IL-15)這兩個(gè)I型細(xì)胞因子的受體的必不可少的一部分。⑶122，也稱為IL-2和IL-15受體的β鏈，與其他的受體亞成分結(jié)合，以產(chǎn)生顯示精確的細(xì)胞因子特異性和親和性的受體。在細(xì)胞表面上功能性地與CD122的聯(lián)合的分子包括⑶25 (也被稱為的IL-2受體α鏈或IL_2Ra )、⑶132(也稱為為共同Y或Y c鏈)和IL-15受體a鏈(也可簡(jiǎn)稱為IL_15Ra ;還未分配CD名稱)(Waldmann，Nat.Rev. Immunol. 6 :595-601 (2006))。CD 122 與 CD 132 結(jié)合形成的受體顯示出對(duì) IL-2 (KD = InM)和IL-15(KD = IOnM)兩者的中間水平的親和性(中間親和性受體)。⑶122與⑶25及⑶132的共同結(jié)合產(chǎn)生的受體特別對(duì)IL-2具有高親和性(KD= IOpM)，而⑶122與IL-15Ra及CD132的結(jié)合可產(chǎn)生對(duì)IL-15有高親和性的受體(KD = IOpM) (Ma, A.，等，Annu. Rev. Immunol. 24 :657-679 (2006))。
IL-2和IL-15共同分擔(dān)刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，但在維護(hù)免疫系統(tǒng)方面卻各具獨(dú)特的活性。IL-2通過(guò)引發(fā)已激活的T細(xì)胞凋亡而限制T細(xì)胞反應(yīng)性，而IL-15對(duì)于NK細(xì)胞的發(fā)育及⑶8+記憶T細(xì)胞的發(fā)育和維護(hù)均必不可少(Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 6 595-601 (2006))。這兩種細(xì)胞因子在其與各自的受體相互作用方法中也體現(xiàn)它們的根本區(qū)別。當(dāng)可溶的IL-2細(xì)胞因子與細(xì)胞表面上中度或高親和力的IL-2受體相互作用時(shí)，IL-2信號(hào)發(fā)生。該可溶的細(xì)胞因子的遞送，其中分泌自相同或不同細(xì)胞的細(xì)胞因子與單一細(xì)胞表面全部受體亞成分相互作用，是除IL-15外，所有I型細(xì)胞因子傳輸其信號(hào)的機(jī)制。相反，IL-15信號(hào)發(fā)生的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)將結(jié)合于細(xì)胞表面IL-15Ra的IL-15呈遞到另一個(gè)表達(dá)⑶122和⑶132分子的細(xì)胞。這也被稱為反式呈遞。反式呈遞是這樣一種機(jī)制，與IL_15Ra受體亞成分或其片段結(jié)合的IL-15，以可溶的或結(jié)合于一個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)存在，能被呈遞至一個(gè)可表達(dá)剩余受體亞成分(⑶122和⑶132)的另一細(xì)胞，隨后導(dǎo)致信號(hào)發(fā)生。分離的IL-15Ra或其片段對(duì)IL-15的親和性很高(KD = IOpM)，并認(rèn)為IL-15與IL-15Ra在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)結(jié)合，然后以復(fù)合物的形式傳遞到細(xì)胞表面以反式呈遞到細(xì)胞表面能表達(dá)⑶122和⑶132的其他細(xì)胞。當(dāng)IL-15與表達(dá)在同一細(xì)胞的⑶122，⑶132和IL_15Ra結(jié)合時(shí)，順式呈遞即發(fā)生。絕大多數(shù)的IL-15信號(hào)發(fā)生是通過(guò)反式呈遞進(jìn)行，順式呈遞的作用很小，而呈遞可溶性的IL-15所產(chǎn)生的信號(hào)幾乎沒(méi)有或完全沒(méi)有(Stonier與Schluns，Immunol. Lett. 127 :85-92(2010) ；Ma 等，Annu. Rev. Tmmunol. 24 :657-679(2006) ；Dubois等，Immunity 17 :537-547(2002))
和與I型細(xì)胞因子共享基本結(jié)構(gòu)、一些功能活性及某些受體亞成分一樣，IL-2和IL-15分別與免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)。比如，通過(guò)使用單克隆抗體靶向IL-2受體(CD25)的α鏈來(lái)抑制IL-2活性，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)策略，目前被批準(zhǔn)用于急性腎移植排斥反應(yīng)(Vincenti 等，New Engl. J. Med. 338 :161_5 (1998))。另外，抗-CD25 方法的治療益處也被報(bào)道于應(yīng)對(duì)哮喘(Busse 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178 :1002-1008 (2008))、葡萄膜炎(Yehet 等，J. Autoimmun. 31 :91-97(2008))和多發(fā)性硬化癥(Rose 等，Neurology, 69 785-789(2007))的臨床試驗(yàn)，這提示出IL-2參與了這些過(guò)程。IL-15特異性的單克隆抗體已被報(bào)道在臨床試驗(yàn)中有積極的治療效果，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Baslund et al. , ArthritisRheum. 52 :2686-2692 (2005))，并且據(jù)報(bào)道在銀屑病(Villadsen 等，J. Clin. Invest. 112 1571-1580(2003))、腹腔疾病(Maiuri 等，Gastroenterology 119 :996-1066(2000))和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Bo et等，Scand. J. Immunol. 69 :119-129(2009))的動(dòng)物模型中具有療效。小鼠的抗人CD122單克隆抗體已產(chǎn)生自接種了人T細(xì)胞系的小鼠，隨后通過(guò)多種技術(shù)被認(rèn)·定為對(duì)IL-2受體β鏈具有特異性。這些抗⑶122的單克隆抗體可抑制IL-2依賴性的具有中間親和力IL-2受體的細(xì)胞增殖，但它們不能有效地抑制IL-2依賴性的具有高度親和力IL-2受體的細(xì)胞增殖。此外，還未曾報(bào)道過(guò)能有效地抑制IL-15反式呈遞的抗⑶122的單克隆抗體。
一種抗 CD122 的抗體，Mik-β I (Tsudo 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1982-1986(1989))，已作為治療T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病的方法被用于測(cè)試(Morris等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103 :401-406 (2006))。Mik- β I 亦被人源化，且此形態(tài)HuMik-β I (Hakimi 等，J. Immunol. 151 :1075-1085(1993))已被報(bào)道可延長(zhǎng)非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的心臟同種異體移植物的存活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體，其可特異性地結(jié)合于⑶122，然后阻止IL-2及IL-15與包含⑶122及⑶132的受體結(jié)合。一些抗體阻止IL-2與包含⑶122，⑶132及⑶25的受體結(jié)合。一些抗體阻止反式呈遞于IL-15Ra的IL-15與包含⑶122及⑶132的受體結(jié)合。一些抗體阻止IL-15與包含⑶122，⑶132及IL_15Ra的受體結(jié)合。當(dāng)抗體相對(duì)于IL-2或IL-15提供不大于100倍摩爾的量時(shí),一些抗體阻止上述環(huán)境中任何或全部結(jié)合的30%。
一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO 73)42,43和/或133殘基被丙氨酸取代和/或65殘基被蘇氨酸取代和/或70殘基被賴氨酸取代。一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見(jiàn)SEQID NO 73)42和/或43殘基被丙氨酸取代和/或65殘基被蘇氨酸取代。一些單克隆抗體與⑶122的結(jié)合可被如下情況阻止⑶122氨基酸序列(見(jiàn)SEQ ID NO :73)65殘基被蘇氨酸取代和/或70殘基被賴氨酸取代和/或133殘基被丙氨酸取代。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中65殘基。一些抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中133殘基。一些抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42、43、65、70和/或133殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中42、43和65殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，包括SEQ ID NO :73序列中65、70和133殘基。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，后者位于SEQ ID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I中。一些單克隆抗體特異性地與一個(gè)⑶122的抗原表位結(jié)合，后者位于SEQ ID NO 73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I和2中。SEQ ID NO 73的39或41殘基被取代為丙氨酸時(shí)，一些單克隆抗體與CD122的結(jié)合被檢測(cè)到不被阻止。
一些抗體與抗體ABC2或ABClOl競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合⑶122，其中ABC2的特征在于一個(gè)成熟的SEQID NO 30的輕鏈可變區(qū)和一個(gè)成熟的SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)，ABClOl其特征在于一個(gè)成熟的SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)的和一個(gè)成熟的SEQ ID NO 35的重鏈可變區(qū)。一些 抗體結(jié)合于與ABC2或ABClOl相同的⑶122上的抗原表位。一些抗體包含三個(gè)輕鏈⑶Rs和三個(gè)重鏈CDRs，其中每個(gè)CDR至少有90%的序列與來(lái)自于ABC2 (SEQ ID NOS :27-29輕鏈和22-24重鏈)或ABClOl (SEQ ID NOS :37-39輕鏈，32-34重鏈)的相應(yīng)CDR相同。
一些抗體是嵌合的、人源化的、飾面(veneered)的或人的。一些抗體具有人IgGl κ同種型(isotype)。一種抗體可以是完整的抗體或單鏈抗體，F(xiàn)ab或F(ab’ )2片段。
本發(fā)明還提供人源化或嵌合的ABC2抗體，其特異地與CD122結(jié)合，其中ABC2是特征為一個(gè)成熟的SEQ ID NO :30的輕鏈可變區(qū)和一個(gè)成熟的SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)的小鼠抗體。一些這樣的抗體包括一條人源化輕鏈和人源化的重鏈，該人源化輕鏈包括所述ABC2輕鏈的三個(gè)CDRs (SEQ ID NO :30)，該人源化的重鏈包括所述ABC2重鏈的三個(gè)CDRs (SEQID NO 25)。
一些抗體包括一條與SEQ ID NO :42至少90%相同的人源化的輕鏈和一條與SEQ IDNO :41至少90%相同的人源化的重鏈。通過(guò)Kabat編號(hào)，殘基T、I、A、I、A和Y分別占據(jù)某些抗體位點(diǎn)1128、!148、!149、冊(cè)8、!193和1^71。通過(guò)Kabat編號(hào)，殘基G占據(jù)某些抗體位點(diǎn)H42。一些抗體中，輕鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 27-29 且重鏈 CDRs 是 SEQ ID NOS :22-24。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了人源化的或嵌合的ABClOl抗體，其特異性結(jié)合于CD122，其中ABClOl的特征在于一個(gè)成熟的SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)和成熟的SEQ ID NO 35的重鏈可變區(qū)。一些這樣的抗體包括一條人源化輕鏈和一條人源化重鏈，其中所述輕鏈包含SEQID NO :40的三個(gè)⑶Rs，所述重鏈包括SEQ ID N0:35的三個(gè)⑶Rs。一些這樣的抗體包含一條與SEQ ID NO :44至少90%相同的成熟的人源化輕鏈可變區(qū)和一條與SEQ ID NO :43至少90 %氨基酸序列相同的成熟的人源化重鏈可變區(qū)。通過(guò)Kabat編號(hào)，殘基Y、T、M、Q、I、R和K分別占據(jù)這樣一些抗體位點(diǎn)H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49。一些這樣的抗體中，輕鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 37-39 且重鏈 CDRs 是 SEQ ID N0S. 32-34。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，該組合物由包括任何上述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在患者體內(nèi)抑制不希望的免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用任何上述抗體的有效方案。在一些方法中，病人有一種自身免疫性疾病，如，例如，多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、牛皮癬、腹腔疾病或葡萄膜炎。在一些方法中，患者有哮喘或過(guò)敏。在一些方法中，病人有移植物抗宿主疾病。在一些方法中，病人有宿主抗移植物疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在患者體內(nèi)治療癌癥的方法，包括給患者施用任何上述抗體的有效方案。在一些方法中，所述癌癥表達(dá)可檢測(cè)到的⑶122。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一個(gè)SEQ ID NO 73中的不超過(guò)100個(gè)的連續(xù)殘基的分離片段，其包括一個(gè)或多個(gè)43、65和133殘基。一些分離的片段包括SEQ ID NO :73的43和65殘基。一些分離的片段包括SEQ ID NO 73的65和133殘基。一些分離的片段包括10個(gè)或更少的連續(xù)的SEQ ID NO :73中的殘基。一些這樣的分離的片段連接到一個(gè)載體，該載體可幫助誘發(fā)應(yīng)對(duì)所述片段的抗體的產(chǎn)生，并且/或者該載體作為一個(gè)組合物的組件與佐劑一起以幫助誘發(fā)應(yīng)對(duì)所述片段的抗體的產(chǎn)生。


圖I. ABC2和ABClOl對(duì)IL-15反式呈遞的影響。
圖2. ABC2和ABClOl對(duì)通過(guò)高親和性IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響。
圖3. ABC2 VH的一致cDNA序列及對(duì)應(yīng)的推測(cè)的氨基酸序列。
圖4. ABC2 VL的一致cDNA序列及對(duì)應(yīng)的推測(cè)的氨基酸序列。
圖5. ABClOl VH的一致cDNA序列及對(duì)應(yīng)的推測(cè)的氨基酸序列。
圖6. ABClOl VL的一致cDNA序列及對(duì)應(yīng)的推測(cè)的氨基酸序列。
圖7.成熟的ABC2 VH，人源化的ABC2 VH (HuABC2 VH)及人受體DA430129 VH區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。
圖8.側(cè)翼有SpeI及HindIII位點(diǎn)的設(shè)計(jì)的HuABC2 VH基因的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列。
圖9.成熟的ABC2VL，人源化的ABC2 VL (HuABC2 VL)及人受體M29469 VL區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。
圖10.側(cè)翼有NheI及EcoRI位點(diǎn)的設(shè)計(jì)的HuABC2 VL基因的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列。
圖 11.成熟的 ABC101VH，人源化的 ABClOl VH (HuABClOl VH)及人受體 DA936142 VH區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。
圖12.側(cè)翼有SpeI及HindIII位點(diǎn)的設(shè)計(jì)的HuABClOl VH基因的核苷酸及推測(cè)的氨
基酸序列。
圖 13.成熟的 ABClOl VL，人源化的 ABClOl VL (HuABClOl VL)及人受體 Z46622 VL VH區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。
圖14.側(cè)翼有NheI及EcoRI位點(diǎn)的設(shè)計(jì)的HuABClOl VL基因的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列。
圖15. pHuABC2及pHuABClOl表達(dá)載體的原理構(gòu)造。
圖16. HuABC2及HuABClOl對(duì)IL-15反式呈遞的影響。
圖17. HuABC2和Hu ABC101對(duì)通過(guò)高親和性IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響。
圖 18. ABC2, ABC10U ABCl 16 和 Mik-β I 與多種 CD 122 結(jié)構(gòu)的結(jié)合。
圖19. ABC2、ABC101、ABCl 16和Mik-β I與多種人CD122的單氨基酸取代突變體的結(jié)合。
圖20.在GM-CSF、IL-2或IL-15/IL-15Ra復(fù)合物存在下，可表達(dá)野生型或突變型⑶122的TF-I轉(zhuǎn)染子的生長(zhǎng)。
定義
單克隆抗體或其他生物實(shí)體，如⑶122的一個(gè)片段通常以分離的形式提供。這意味著抗體或其他生物實(shí)體通常是源自產(chǎn)物或提純物的干擾蛋白或其他污染物的至少50% w/w的純度，但不排除這樣的可能，即所述的抗體與過(guò)量的一種(或多種)藥物上可接受的載體 或其他介質(zhì)結(jié)合，以方便其使用。通常分離的單克隆抗體或其他的生物實(shí)體劑是純化后剩余的優(yōu)勢(shì)大分子種類。
單克隆抗體與其靶抗原的的特異性結(jié)合意味著親非和力至少有106、107、108、109或IOkiM'特異性結(jié)合可檢測(cè)到更高的量級(jí)，且可從非特異性結(jié)合至少一個(gè)不相關(guān)靶標(biāo)的情況中區(qū)分。特異性結(jié)合能產(chǎn)生于特定官能團(tuán)或特定空間配合(例如，鎖和鑰匙型)之間形成的鍵，而非特異性結(jié)合產(chǎn)生于范德華力。然而特異性結(jié)合并不必然意味著單克隆抗體只結(jié)合一個(gè)且只有一個(gè)祀標(biāo)。
當(dāng)CD122中的突變抑制了抗體與CD122的特異性結(jié)合，該結(jié)合強(qiáng)度(無(wú)論是由復(fù)合信號(hào)、親和常數(shù)或其他測(cè)量方法)檢測(cè)結(jié)果較CD122(SEQ ID NO :73)的野生型形式低(例如，降低至超過(guò)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，SEM)，且可比野生型形式的結(jié)合低50%或10%。所述結(jié)合的減少也可以通過(guò)與陽(yáng)性對(duì)照抗體的結(jié)合對(duì)比而進(jìn)行評(píng)估，如實(shí)施例中使用的市售的L5抗FLAG 抗體，該陽(yáng)性對(duì)照抗體結(jié)合于鏈接到CD122的FLAG 多肽。例如，如果抗體與突變CD 122的結(jié)合強(qiáng)度低于抗FLAG抗體與鏈接的FLAG 多肽的結(jié)合強(qiáng)度的50%或更優(yōu)地低于10%，則所述突變可抑制抗⑶122抗體的結(jié)合。
基本的抗體結(jié)構(gòu)單元是由亞基組成的四聚體。每個(gè)四聚體包含兩對(duì)相同的多肽鏈，每對(duì)多肽鏈有一個(gè)“輕”鏈(約25kDa)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個(gè)可變區(qū)來(lái)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別，可變區(qū)約100至110或更多的氨基酸。該可變區(qū)最初被表達(dá)時(shí)連接到一個(gè)可分裂的信號(hào)肽上。沒(méi)有信號(hào)肽的可變區(qū)，有時(shí)也被稱為成熟的可變區(qū)。因此，例如，成熟的輕鏈可變區(qū)，意味著沒(méi)有輕鏈信號(hào)肽的輕鏈可變區(qū)。每條鏈的羧基末端部分被定義為恒定區(qū)，主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能。
輕鏈被分類為為K或λ輕鏈。重鏈被分類為γ、μ、α、δ或ε ,并定義對(duì)應(yīng)抗體的同種型(isotype)分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)一個(gè)約12個(gè)或12個(gè)以上的氨基酸的“J”區(qū)連接，同時(shí)重鏈還包括一個(gè)約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸“D”區(qū)。
每個(gè)輕/重鏈對(duì)的成熟可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，一個(gè)完整的抗體具有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除雙功能抗體或雙特異性抗體外，所述兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。所述的鏈都表現(xiàn)出相同的通用結(jié)構(gòu)或相對(duì)保守的骨架區(qū)(FR)，其通過(guò)3個(gè)高變區(qū)連接，所述的高變區(qū)也叫互補(bǔ)決定區(qū)或CDRs。源自每個(gè)輕/重鏈對(duì)的兩條鏈的CDRs是由框架區(qū)對(duì)準(zhǔn)，以結(jié)合到特定的抗原表位。從N-末端至C-末端，輕鏈和重鏈均包括結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、⑶R3和FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配與Kabat《免疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)的序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)(國(guó)立衛(wèi)生研究院，Bethesda,MD, 1987和 1991)中的定義或 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987) ;Chothia 等，Nature 342 878-883(1989)的定義是一致的。Kabat的還提供了一種廣泛使用的編號(hào)慣例(Kabat編號(hào))，其中，不同重鏈或不同輕鏈之間的相應(yīng)殘基被分配了相同的編號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的抗體和其所結(jié)合的片段。通常情況下，片段與產(chǎn)生它們的完整的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特定的靶標(biāo)，包括單獨(dú)的重鏈和輕鏈Fab、Fab'、F (ab' )2、F (ab) C、Dabs、納米體和Fv。片段可以產(chǎn)生自重組DNA技術(shù)完整的免疫球蛋白酶分離或化學(xué)分離。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括雙特異性抗體。雙特異性抗體或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。
術(shù)語(yǔ)“抗原表位”是指位于抗原上的能與抗體結(jié)合的位點(diǎn)?？乖砦豢捎梢粋€(gè)或多個(gè)蛋白三級(jí)折疊的并列的連續(xù)的氨基酸或不連續(xù)的氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的抗原表位(也稱為線性表位)通常暴露于變性劑后受影響，而由三級(jí)折疊形成的抗原表位(也稱為構(gòu)象表位)通常經(jīng)變性劑處理后不受影響。抗原表位的獨(dú)特空間構(gòu)象中通常包括至少為3個(gè)，更通常為5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。抗原表位獨(dú)特空間構(gòu)象的測(cè)定方法包括，例如，X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振，見(jiàn)，例如 Methods in Molecular Biology, Vol. 66,Glenn E. Morris,Ed. (1996)中的抗原表位定位標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)流程(Epitope Mapping Protocols)。。
識(shí)別相同或重疊抗原表位的抗體可被簡(jiǎn)單的免疫分析法檢定，該免疫分析法顯示一個(gè)抗體相對(duì)于另一個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原的能力。抗體的對(duì)應(yīng)抗原表位也可以是確定的結(jié)合于抗原的抗體的X-射線晶體學(xué)(以鑒定接觸殘基)?；蛘?，如果可減少或消除一種抗體結(jié)合的抗原所有氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有相同的抗原表位。如果可減少或消除一種抗體結(jié)合的抗原某些氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有重疊的抗原表位。
抗體間的競(jìng)爭(zhēng)由試驗(yàn)分析來(lái)確定，其中被測(cè)的抗體抑制參照抗體與共有抗原的特異結(jié)合(見(jiàn)，如Junghans等，Cancer Res. 50 :1495,1990)。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)分析中，若過(guò)量的被測(cè)試抗體(例如，至少2x、5x、10x、20x或IOOx)抑制至少50%，但優(yōu)選為75%、90%或99%參照抗體的結(jié)合，則被測(cè)試抗體與參照抗體競(jìng)爭(zhēng)。由競(jìng)爭(zhēng)法確定的抗體(競(jìng)爭(zhēng)性抗體)包括與參照抗體具有相同結(jié)合抗原表位的抗體，及與一個(gè)毗鄰抗原表位(由于空間位阻發(fā)生，該毗鄰抗原表位充分接近與參照抗體結(jié)合的抗原表位)結(jié)合的抗體。
術(shù)語(yǔ)“患者”包括接受預(yù)防或治療處理的人類和其他哺乳動(dòng)物測(cè)試體。
為了對(duì)氨基酸替換的保守性和非保守性進(jìn)行分類，氨基酸分組如下組I (疏水性側(cè)鏈)甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸亮，氨酸、異亮氨酸；組II (中性親水性側(cè)鏈)半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III (酸性側(cè)鏈)天冬氨酸、谷氨酸；組IV(基本側(cè)鏈)天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；組V(影響鏈定位的殘基)甘氨酸、脯氨酸；組VI (芳香側(cè)鏈)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替換涉及同一類氨基酸之間的替換，非保守替換構(gòu)成一類氨基酸的成員被另一類氨基酸的成員替換。
序列一致性百分率根據(jù)Kabat編號(hào)法則對(duì)抗體序列進(jìn)行最大比對(duì)。如果受試抗體區(qū)域(如一條輕鏈或一條重鏈的完整的成熟可變區(qū))與一個(gè)參照抗體的相同序列比對(duì)，比對(duì)后，受試抗體與參照抗體相同序列百分率為受試抗體與參照抗體中占據(jù)相同位置的氨基酸數(shù)量除以兩個(gè)區(qū)域的比對(duì)位置的總數(shù)，缺口不算在內(nèi)，乘以100以轉(zhuǎn)換成百分率。
“包括”的一個(gè)或多個(gè)例舉元素的組合物或方法還囊括其它沒(méi)有特別例舉的元素。例如，一個(gè)包括抗體的組合物，該組合物可以僅含有該抗體，也可與其它成分相結(jié)合。詳細(xì)說(shuō)明
I.概要
本發(fā)明提供單克隆抗體，該抗體特異性地結(jié)合⑶122，⑶122是IL-2和IL-15的受體的一個(gè)組分。所述單克隆抗體實(shí)質(zhì)上可以抑制IL-2和IL-15介導(dǎo)的功能，這是通過(guò)抑制這些細(xì)胞因子與它們的受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。所述單克隆抗體可以用于抑制不需要的免疫反應(yīng)或治療癌癥，以及其他應(yīng)用。
II.革巴#〒
除非另有說(shuō)明，CD122是指人CD122。一個(gè)示例性的人類序列被指定為Swiss Prot注冊(cè)號(hào)P14784。其中已知的自然等位基因的變異性包括10L —V :dbSNP rs57770674、83 S —F，dbSNP rs2228143 和 391 D — E :dbSNP rs228942。完整的人 CD122 序列具有 551 個(gè)氨基酸，其中氨基酸1-26為一個(gè)信號(hào)肽。約27-240殘基構(gòu)成胞外結(jié)構(gòu)域。約241-265殘基構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu)域，約266-551殘基構(gòu)成胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的所述抗體結(jié)合到位于CD122胞 外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的抗原表位。
突變殘基通過(guò)SEQ ID N0:73定義，SEQ ID NO :73為無(wú)信號(hào)序列的完整的CD122序列。如果在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中實(shí)際使用的CD122不同于SEQ ID NO :73 (例如，N-端截短的SEQ ID NO:73)，則突變體為當(dāng)與SEQ ID NO 73進(jìn)行最大匹配時(shí)，任何形式所使用的⑶122的相應(yīng)殘基。
如背景中討論的，⑶122與⑶132、⑶25和/或IL-15Ra的結(jié)合形成受體。簡(jiǎn)言之，⑶122和⑶132的組合構(gòu)成的受體對(duì)IL-2和IL-15具有中等親合力。⑶122、⑶132和⑶25的組合構(gòu)成的受體對(duì)IL-2具有高親和力，而⑶122、⑶132和IL_15Ra的構(gòu)成的受體對(duì)IL-15具有高親和力。
除非另有指明，否則⑶132、⑶25和/或IL-15Ra是指這些蛋白質(zhì)的人類形式。人⑶132的一個(gè)示例性人類序列被指定為Swiss Prot注冊(cè)號(hào)P31785，這是一種含369個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中約殘基1-22是信號(hào)肽，23-262是胞外結(jié)構(gòu)域，263-283是跨膜結(jié)構(gòu)域，284-369是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
⑶25的示例性的人類序列被指定Swiss Prot P01589，它有272個(gè)殘基，其中約殘基1-21是信號(hào)肽，22-240是胞外結(jié)構(gòu)域，殘基241-259是跨膜結(jié)構(gòu)域，殘基260-272是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
IL-15Ra的示例性的人類序列被指定Swiss Prot Q13261，它有267個(gè)殘基，其中約殘基1-30是信號(hào)肽，31-205是胞外結(jié)構(gòu)域，殘基206-228是跨膜結(jié)構(gòu)域，殘基229-267是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
除非以其他方式從上下文可知，參照上述受體之一意味著至少指蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，通常也指完整的蛋白質(zhì)，而不是可裂解的信號(hào)肽。
如背景中討論的，上述受體與IL-2和IL-15結(jié)合，其中后者可以表現(xiàn)為順式或反式。除非另從上下文可知，這些分子是指這些蛋白質(zhì)的人類形式。人IL-2的示例性序列被指定為Swiss Prot P60568，它是一種含153個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中氨基酸1-20是信號(hào)肽。人IL-15的示例性序列的被指定為Swiss Prot P40933，它是一種含162個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中氨基酸1_29是彳目號(hào)妝。除非另從上下文可知，參照IL-2或IL-15意味著是已經(jīng)去除信號(hào)肽的成熟蛋白。III.本發(fā)明的抗體
A.結(jié)合特異性和功能特性
本發(fā)明提供能與CD122蛋白內(nèi)的抗原表位結(jié)合的單克隆抗體。指定的抗體ABC2和ABClOl就是2個(gè)這樣的示例性的小鼠抗體。ABC2和ABClOl均可特異性結(jié)合人類⑶122。本發(fā)明中ABC2、ABClOl和一些其它的抗體，其特征在于，其進(jìn)一步可特異性結(jié)合到獼猴⑶122，且不能有效地與小鼠和狗⑶122結(jié)合。結(jié)合到⑶122被證明為單獨(dú)結(jié)合⑶122和/或上面討論的并入了 CD122的受體。本發(fā)明的單克隆抗體，其特征在于，單克隆抗體作為一個(gè)單一試劑，可以阻止并入了 CD122的受體與IL-2和IL-15的結(jié)合及隨后作為應(yīng)答的細(xì)胞增殖的信號(hào)。
優(yōu)選的抗體可以抑制IL-2和IL-15結(jié)合到并入了 CD122的低和高親和力受體，也可抑制IL-15的順式和反式結(jié)合。這樣的抗體區(qū)別于以前報(bào)道對(duì)⑶122的抗體，包括Mik-β I和其人源化形式。如實(shí)施例8中所示，HuMik-β I僅示出了抑制可溶型IL-15介導(dǎo)的細(xì)胞 (該細(xì)胞具有CD122)增殖的弱能力，且不能檢測(cè)出抑制IL-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖(該細(xì)胞具有高親和力IL-2受體，包括⑶122)的能力。Mik-β I、其人源化形式和其它已知的抗⑶122抗體來(lái)也缺乏任何或至少實(shí)質(zhì)的能力來(lái)抑制以反式呈遞呈現(xiàn)的IL-15。
抑制可以用結(jié)合試驗(yàn)來(lái)證明，其中，細(xì)胞上表達(dá)的并入了 CD122的受體，在被測(cè)試抗體的存在下，與IL-2或IL-15結(jié)合?？商鎿Q地，或另外地，抑制也可以用如下方法證明，即在IL-2或IL-15存在下于合適細(xì)胞上表達(dá)并入了⑶122的受體，然后測(cè)試單克隆抗體對(duì)IL-2或IL-15介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的效果。抑制IL-15可以在這樣的模式下順式或反式測(cè)試。體現(xiàn)抑制的示例性的測(cè)定模式在實(shí)施例中有描述。任選地，所試抗體的抑制也通過(guò)與下述物質(zhì)進(jìn)行比較而證明，即不結(jié)合CD122或其受體聯(lián)合組件的不相關(guān)對(duì)照抗體、或IL-2及IL-15、或不含抗體的載體。
實(shí)質(zhì)性抑制意味著至少抑制25、30、40、50或75% (如25-75%或30-70% )的由IL-2或IL-15介導(dǎo)的結(jié)合、細(xì)胞的增殖和/或其他功能活性。抑制通常在如下條件下可證明，即相對(duì)于IL-2或IL-15配體，抗體不超過(guò)100倍摩爾過(guò)量(例如，2_50或2_10或2_5倍摩爾過(guò)量)。對(duì)于功能測(cè)定，在抗體存在條件下，IL-2或IL-15通常呈現(xiàn)為可充分刺激功能活性所需的最低劑量水平?？贵w通常為50ηΜ-5 μ M之間的濃度。優(yōu)選的抗體顯示可抑制IL-2與低或高親和力受體(或兩者)相互作用的至少40%，對(duì)以順式和反式呈現(xiàn)的IL-15的抑制則至少為40%。抑制程度也可以被量化為50%增殖抑制濃度(IC50)，如實(shí)施例2和實(shí)施例8中描述的，所述的增殖是由IL-15反式介導(dǎo)至TF-I β細(xì)胞所致?？贵w的濃度低于2 μ g/ml,且優(yōu)選地,低于I μ g/ml,如O. 1-1或O. 5-1 μ g/ml是優(yōu)選的。如實(shí)施例8中描述的，能抑制IL-2介導(dǎo)的TF-I α β增殖(該細(xì)胞具有高親和力IL-2受體)50%的抗體濃度優(yōu)選地低于 100 或 50 μ g/ml,如 10-50 μ g/ml。
從這些結(jié)果中可明顯發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體的IC50取決于被抑制的相互作用的性質(zhì)。對(duì)于具有高親和力IL-2受體的細(xì)胞，相比于抑制IL-15的反式呈遞，抗⑶122抗體對(duì)IL-2的抑制更困難(即，相同的所需抗體的濃度更高)。對(duì)于只具有中等親合力IL-2受體的細(xì)胞，相比于抑制可溶性IL-2或IL-15，抑制IL-15反式呈遞更困難(即，相同的所需抗體的濃度更高)。
在動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中，優(yōu)選的抗體也能抑制免疫性失調(diào)或癌癥。在實(shí)施例中討論了動(dòng)物模型中對(duì)抗移植物抗宿主疾病的測(cè)試活性。動(dòng)物模型的一些其他示例在背景技術(shù)部分中討論。其中一個(gè)這樣的模型是由Villadsen等人(同上)描述的SCID/牛皮癬模型。在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的器官移植中，可與猴CD122交叉反應(yīng)的抗人CD122抗體可被測(cè)試(Tinubu等人，同上)。腫瘤動(dòng)物模型被廣泛使用，其中人類腫瘤細(xì)胞被注入到免疫缺陷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，如小鼠或大鼠。
本發(fā)明的某些抗體可結(jié)合到與一個(gè)抗體(被指定為ABC2或ABC101)相同的或覆蓋的抗原表位。這些抗體的成熟的可變區(qū)的重鏈和輕鏈被分別指定為SEQ ID NO S. 25和30，及35和40。其它具有該結(jié)合特征的抗體能通過(guò)以下方法獲得用CD122或含有所期望抗原表位的CD122的一部分來(lái)免疫小鼠,然后篩選能結(jié)合CD122的抗體,可選擇地,可與ABC2或ABClOl競(jìng)爭(zhēng)的抗體。通過(guò)該試驗(yàn)認(rèn)定的抗體可將之篩選以用于抑制IL-2和IL-15的相互作用，這在實(shí)施例中和其他部分有所描述。也可對(duì)突變形式的CD122抗原的相應(yīng)抗體進(jìn)行篩選，以鑒定出能顯示與ABC2或ABClOl具有相同或相似結(jié)合屬性的抗體(結(jié)合于突變改變集合)。所述的突變可以是位于貫穿CD122胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分(具有抗原表位)的每次一個(gè)殘基的丙氨酸替換(若丙氨酸已有，或者為絲氨酸)，或更廣泛的多個(gè)空間間隔上的替換。
SEQ ID NO 73殘基42,43和65的突變可抑制ABC2特異性地結(jié)合CD 122 (例如，實(shí)施例中描述的，< 10%的陽(yáng)性對(duì)照抗FLAG抗體的結(jié)合)。同樣，SEQ ID NO :73殘基65、70和133的突變可抑制ABClOl特異性結(jié)合到CD122。由于相對(duì)極少的殘基可影響結(jié)合，且所述的殘基在空間的分布比一個(gè)典型的線性表位(例如3-20個(gè)連續(xù)氨基酸)分布更廣泛，這些結(jié)果顯示，ABClOl并且很可能ABC2結(jié)合到構(gòu)象表位?；蛘?，一個(gè)或多個(gè)影響結(jié)合的殘基可不直接接觸抗體而別構(gòu)調(diào)節(jié)。65號(hào)殘基突變?yōu)樘K氨酸可以抑制結(jié)合，而突變?yōu)楸彼岵灰种平Y(jié)合的現(xiàn)象表明，該殘基對(duì)結(jié)合的影響是變構(gòu)調(diào)節(jié)的。結(jié)合抗原表位(該表位包括SEQ IDNO73的42、43、65、70和133殘基中的一個(gè)或更多個(gè)殘基)的其他抗體，且特別地，結(jié)合抗原表位(該表位包括42、65和133殘基中的一個(gè)或更多個(gè)殘基)的抗體，很可能共享ABC2及ABClOl的結(jié)合屬性。因此，當(dāng)一種抗體，其特異性結(jié)合可被SEQ ID NO :73殘基42、43和65中一個(gè)或多個(gè)突變抑制，或特別地，被42和65殘基的突變抑制，則該抗體共享ABC2的相似屬性。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個(gè)抗原表位，該抗原表位包括SEQ ID NO:73的42、43和/或65殘基或者由其組成。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個(gè)抗原表位，該抗原表位包括42和43殘基或者由其組成，且在其中殘基65別構(gòu)影響抗體的結(jié)合。所述的抗原可以是線性的，例如一個(gè)抗原表位(例如，2-5，3-5，3-10，3-15，3-20, 5-10，5-15或5-20個(gè)連續(xù)氨基酸)包括指定的氨基酸(42、43和65)中的一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)，或由其組成，所述的抗原表位也可以是構(gòu)象表位，其包括指定的氨基酸中的一個(gè)，兩個(gè)或全部三個(gè)，或由其組成。特異性結(jié)合可以被突變(SEQID NO 73的殘基65、70和133中一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)突變)阻止的抗體很可能與ABClOl共享相似的抑制屬性。一些這樣的抗體可結(jié)合到一個(gè)抗原表位，該抗原表位具有SEQ ID NO : 73的65或133殘基，或65和133殘基。這樣的抗原表位可以是線性表位(例如，2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15或5-20個(gè)連續(xù)氨基酸)，其包括指定的氨基酸出5、70和133)中的一個(gè)，兩個(gè)或全部三個(gè)，或由其組成。某些本發(fā)明的抗體可特異性結(jié)合于CD122，該結(jié)合實(shí)質(zhì)上并不被取代SEQ ID NO 73的殘基39或41 (取代為丙氨酸)阻止(例如，實(shí)施例中描述的，至少陽(yáng)性對(duì)照抗體結(jié)合的50%)。(39和41殘基的突變抑制Mik-β I抗體的結(jié)合。)。任何上述抗體類型包括這樣的抗體，該抗體特異性結(jié)合到抗原表位(該表位不包括SEQ ID NO 73的殘基39或41)，或換句話說(shuō)，該抗體與⑶122的結(jié)合并不能被殘基的取代檢測(cè)性地抑制(在實(shí)施例中，高于陽(yáng)性對(duì)照抗FLAG抗體50%的
口口乂 O
結(jié)合到抗原表位的抗體，所述的抗原表位含有一個(gè)或多個(gè)特定殘基，可以通過(guò)免疫處理CD122的片段(該片段含有這些一個(gè)或多個(gè)特定殘基)而產(chǎn)生。片段可以例如具有不超過(guò)SEQ ID NO :73的100、50、25、10或5個(gè)連續(xù)的氨基酸。通常有這樣的片段至少有SEQ IDNO 73中的5個(gè)，6個(gè)，7個(gè)，8個(gè)或9個(gè)連續(xù)的殘基。這些片段可以被鏈接到載體，這有利于誘發(fā)應(yīng)對(duì)該片段的抗體反應(yīng)的產(chǎn)生，且/或與一個(gè)佐劑結(jié)合以幫助誘發(fā)上述反應(yīng)。結(jié)合到所希望殘基的抗體也可通過(guò)如下方法產(chǎn)生免疫處理一個(gè)全長(zhǎng)CD122(信號(hào)序列除外)或纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域I和/或2的全長(zhǎng)胞外結(jié)構(gòu)域(信號(hào)序列除外)。然后，這樣的抗體可以被篩選以差異性地結(jié)合人和鼠的雜交CD 122，或與特定殘基突變的突變型對(duì)比，被篩選以差
異性結(jié)合野生型⑶122。針對(duì)人和鼠的雜交⑶122的篩選可以定位結(jié)合于⑶122內(nèi)特定結(jié)構(gòu)域(例如纖維連接蛋白III結(jié)構(gòu)域I和/或2)的抗體。針對(duì)突變體的篩選更精確地定義了結(jié)合特異性，以允許認(rèn)定這樣一些抗體，其結(jié)合可以通過(guò)殘基43、43、65、70和/或133的突變而受抑制，且與示例抗體共享抑制屬性。
具有選定的的鼠抗體的結(jié)合特異性的抗體(如ABC2或ABC101)也可以用多種噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)。見(jiàn)Winter，WO 92/20791。此方法是特別適合用于生產(chǎn)人抗體。在該方法中，選定的鼠抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)作為起始材料使用。例如，如果輕鏈可變區(qū)被選作起始材料，一個(gè)噬菌體文庫(kù)被構(gòu)建，其中的組分顯示相同的所述輕鏈可變區(qū)(即鼠起始材料)和不同的重鏈可變區(qū)。所述的重鏈可變區(qū)能例如產(chǎn)生自一個(gè)重排的人重鏈可變區(qū)的文庫(kù)。對(duì)⑶122顯示強(qiáng)特異性結(jié)合(例如，至少108，優(yōu)選至少IO9M4)的噬菌體被篩選。所述的來(lái)自該噬菌體的重鏈可變區(qū)然后作為起始材料用于進(jìn)一步構(gòu)建一個(gè)噬菌體文庫(kù)。在這個(gè)文庫(kù)中，每個(gè)噬菌體顯示相同的重鏈可變區(qū)(即第一個(gè)顯示文庫(kù)認(rèn)定的區(qū)域)和不同的輕鏈可變區(qū)。所述的輕鏈可變區(qū)能例如產(chǎn)生自一個(gè)重排的人輕鏈可變區(qū)的文庫(kù)。同理，對(duì)CD122顯示強(qiáng)特異性結(jié)合的噬菌體被篩選。所生成的抗體通常與鼠起始材料有相同或相似的抗原表位特異性。
其它抗體可以通過(guò)突變編碼示例抗體(如ABC2或ABC101)重鏈和輕鏈的cDNA的方式獲得。本發(fā)明還包括這樣一些單克隆抗體，它們與ABC2或ABClOl的成熟重和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少有90%、95%或99%相同，且保持其功能特性，和/或由于少部分功能上不重要的氨基酸替換(如保守性替換)，缺失，或插入，不同于單獨(dú)的抗體。本發(fā)明還包括這樣一些單克隆抗體，它們具有至少一個(gè)，更優(yōu)地為6個(gè)CDR(S)(由Kabat定義)，它們與ABC2 或 ABClOl 相應(yīng)的 CDRs 具有 90%、95%、99%或 100%相同。
B.非人抗體
其他應(yīng)對(duì)CD122的非人單克隆抗體，例如，鼠、豚鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、兔或大鼠，其生產(chǎn)可以通過(guò)，例如，免疫動(dòng)物來(lái)獲得，該免疫可以使用⑶122或它們的片段、具有⑶122的細(xì)胞，任選地，以上討論過(guò)的共同表達(dá)其共受體蛋白的細(xì)胞。見(jiàn)Harlow & Lane, Antibodies, ALaboratory Manual (CSHP NY, 1988)(以引用的方式并入本文中)。這樣的免疫原能天然獲得、通過(guò)肽合成法獲得或重組表達(dá)。任選地，所述免疫原的操作能通過(guò)混合或與載體蛋白絡(luò)合。任選地，所述免疫原的操作能通過(guò)佐劑。如下文所述，多種類型的佐劑可以被使用。弗氏完全佐劑及隨后使用弗氏不完全佐劑對(duì)于免疫試驗(yàn)動(dòng)物是優(yōu)選的。兔子和豚鼠通常用來(lái)制作多克隆抗體。小鼠通常用于制備單克隆抗體。抗體被篩選用于與CD122的特異性結(jié)合。所述的篩選可以通過(guò)測(cè)定抗體與一組⑶122刪除突變的結(jié)合而進(jìn)行，然后測(cè)定哪一種刪除突變結(jié)合了該抗體。結(jié)合可以通過(guò)例如Western blot、FACS或ELISA被分析。
C-人源化抗體
人源化抗體是一種基因工程抗體，其中來(lái)自于非人“供體”抗體的CDRs被轉(zhuǎn)移到人“受體”的抗體序列上(見(jiàn)，例如 Queen，US 5, 530, 101 and 5, 585, 089 ；ffinter,US 5,225,539，Carter, US 6, 407, 213, Adair, US 5, 859, 205 6，881，557，F(xiàn)oote，US 6,881,557)。所述受體抗體序列可以是，例如，一個(gè)成熟的人抗體序列，這樣的序列的組合物，人抗體序列的共有序列，或一個(gè)種系的區(qū)域序列。因此，人源化抗體是這樣一種抗體，該抗體具有全部或?qū)嵸|(zhì)上源于供體抗體的某些或所有的CDRs，及可變區(qū)框架序列和恒定序列，如果存在，完全或?qū)嵸|(zhì)上源于人抗體序列。同樣地，人源化的重鏈具有至少一個(gè)，兩個(gè)和通常所有三個(gè)CDRs， 其完全或?qū)嵸|(zhì)上源自一個(gè)供體抗體的重鏈，及重鏈可變區(qū)框架序列和重鏈恒定區(qū)，如果存在的話，基本上源自人重鏈可變區(qū)框架和恒定區(qū)序列。同樣地，人源化輕鏈具有至少一個(gè)，兩個(gè)和通常所有三個(gè)CDRs，其完全或?qū)嵸|(zhì)上源于一個(gè)供體抗體的輕鏈，及輕鏈可變區(qū)框架序列和輕鏈恒定區(qū)，如果存在的話，基本上源自人輕鏈可變區(qū)的框架和恒定區(qū)序列。除了納米抗體和dAbs外，人源化抗體包括人源化重鏈和人源化輕鏈。當(dāng)各自CDRs的相應(yīng)殘基(由Kabat定義)至少有85 %、90 %、95 %或100 %是相同時(shí)，人源化抗體的一個(gè)CDR實(shí)質(zhì)上源自相應(yīng)的非人類抗體CDR。當(dāng)85、90、95或100%相應(yīng)殘基(由Kabat定義)相同時(shí)，抗體鏈的可變區(qū)框架序列或抗體鏈的恒定區(qū)實(shí)質(zhì)上分別源自人可變區(qū)框架序列或人恒定區(qū)序列。
雖然人源化抗體通常并入6個(gè)源自鼠抗體的CDRs (優(yōu)選由Kabat定義)，它們也可以被制成少于全部⑶Rs的抗體(例如，至少為3、4或5),⑶Rs源自鼠抗體(如Pascalis等，J. Immunol. 169 :3076, 2002 ；Vajdos 等，Journal of Molecular Biology, 320 415-428, 2002 ；Iwahashi 等，Mol. Tmmunol. 36 :1079-1091,1999 ；Tamura 等，Journal ofImmunology, 164 :1432-1441,2000)
在一些抗體中，只有CDRs的一部分，即用于結(jié)合所需要的CDR殘基的子集，稱為特異性決定殘基(SDRs)，需要在人源化抗體中保留以供結(jié)合使用。不接觸抗原的且不在SDRs內(nèi)的⑶R殘基，可以通過(guò)以往的研究加以認(rèn)定(例如在⑶R H2中的殘基H60-H65常常不是必需的)，或在位于 Chothia 超變量環(huán)之外的 Kabat CDRs 區(qū)域(Chothia, J. Mol. Biol. 196 :901,1987),或用分子建模和或以經(jīng)驗(yàn)為主地,或如Gonzales等在Mol. Immunol. 41 :863, 2004中所描述的。人源化抗體的某些位置的一個(gè)或更多供體CDR殘基空缺或全部供體CDR消失，占據(jù)在該位置上的氨基酸可以是占據(jù)受體抗體序列的相應(yīng)位點(diǎn)(根據(jù)Kabat編碼)的氨基酸。受體的CDR中的供體氨基酸替換數(shù)目反映了競(jìng)爭(zhēng)平衡的考慮。這種替換對(duì)于減少人源化抗體中鼠氨基酸的數(shù)目從而減少潛在的免疫原性是有潛在優(yōu)點(diǎn)的。然而，所述的替換也可能導(dǎo)致親和性變化，要優(yōu)先避免親和力顯著減少。CDRs內(nèi)的替換位點(diǎn)和替換氨基酸的選擇可以依據(jù)經(jīng)驗(yàn)。
人受體抗體序列可以任選地選自于眾多已知的人抗體序列，以提供人受體序列的可變區(qū)框架和相應(yīng)的供體抗體鏈的可變區(qū)框架的高度序列同一性(例如,65-85%的同一性)。源自人可變區(qū)框架殘基的某些氨基酸可被選擇以用于替換，該替換是基于它們對(duì)CDR構(gòu)象和/或?qū)乖慕Y(jié)合的影響。檢測(cè)這種影響可以通過(guò)如下方法進(jìn)行建模、檢測(cè)特定位置的氨基酸的特征、或經(jīng)驗(yàn)觀測(cè)替換帶來(lái)的影響、或誘變特定的氨基酸。
例如，當(dāng)鼠的可變區(qū)框架殘基和一個(gè)選定的人可變區(qū)框架殘基之間的氨基酸不同，人框架氨基酸可以被源自鼠抗體的等效框架氨基酸取代，只要氨基酸可被合理地預(yù)期
(1)與抗原直接非共價(jià)結(jié)合，
(2)毗鄰CDR區(qū)域，
(3)否則與CDR區(qū)相互作用(例如在一個(gè)CDR區(qū)內(nèi)約6A )。
其他替換候選是在那個(gè)位點(diǎn)通常不作為人免疫球蛋白的受體人框架氨基酸。這些氨基酸可被源自鼠供體抗體同等位置的氨基酸替換，或被源自更典型的人免疫球蛋白同等位置的氨基酸替換。其他替換候選是在那個(gè)位點(diǎn)通常不作為人免疫球蛋白的受體人框架氨基酸。
本發(fā)明的一個(gè)示例性的人源化抗體是ABC2的人源化形式，其特征在于一個(gè)SEQ ID NO:42的成熟的輕鏈可變區(qū)的和一個(gè)SEQ ID N0:41的成熟的重鏈可變區(qū)，且被指定為HuABC2。本發(fā)明還提供HuABC2的變異型。這樣的變異型通常由少數(shù)(例如，典型地不超過(guò)1、2、3、5或10)替換、缺失或插入而造成與HuABC2序列的不同。這種差異通常發(fā)生在框架中，但也可發(fā)生在CDRs。例如，只有在H28、H48、H49、H68、H93和L71位點(diǎn)的替換子集可以被制備。人源化的單克隆抗體(mAb)中許多不接觸CDRs的框架殘基能適應(yīng)源于供體鼠mAb或其他鼠或人抗體的相應(yīng)位置的氨基酸的替換，且甚至許多潛在的CDR-接觸殘基也服從替換或CDRs內(nèi)的的氨基酸可以被改變。一個(gè)示例性的CDR替換是將一個(gè)CDR內(nèi)的一個(gè)殘基替換為用于提供可變區(qū)框架的占據(jù)人受體序列相應(yīng)位置的殘基。
通常，在變異的人源化ABC2序列內(nèi)的替換關(guān)于被替換的HuABC2氨基酸是保守的。優(yōu)選地，發(fā)生在HuABC2內(nèi)的替換(不論是否保守)對(duì)結(jié)合親和力或人源化mAb效價(jià)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的效果，即，它抑制包括⑶122的受體與IL-2和IL-15之間相互作用的能力(例如，展示的實(shí)施例和背景中描述的分析方法中的一些或所有變型的人源化ABC2抗體“效價(jià)”本質(zhì)上是相同的，即，實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，與HuABC2 “效價(jià)”相同)。優(yōu)選地，成熟的變型的輕鏈和重鏈V區(qū)的序列至少90 %，更優(yōu)地，至少95 %，并且最優(yōu)選地，至少98 %相同于各自的HuABC2成熟的輕鏈和重鏈V區(qū)?；蛘?，特別是那些與ABC2的可變區(qū)框架序列具有高度序列一致性的其他人抗體受體序列，也適合提供人源化抗體可變區(qū)框架序列。
在一些變型的HuABC2中，至少1、2、3、4、5或所有6個(gè)受體-供體替換位點(diǎn)，其已在示例性抗體中提及(即H28、H48、H49、H68，、H93和L71)，優(yōu)選地分別被殘基T、I、A、I、A和Y替換(所述殘基占據(jù)鼠供體抗體重鏈的相應(yīng)位置)。在一些變型體中，H42被G替換。如果所述重鏈?zhǔn)荏w序列是DA430129cDNA (GenBank登錄號(hào))編碼的序列之外的序列，或所述輕鏈?zhǔn)荏w序列M29469cDNA (GenBank登錄號(hào))編碼的序列之外的序列，受體-供體替換對(duì)于特定可變框架區(qū)位點(diǎn)的特定占據(jù)可以是或不是必須的，這取決于占據(jù)特定位點(diǎn)的殘基是否在受體與供體之間相同。
本發(fā)明的另一示例性的人源化抗體是ABClOl的人源化形式，其特征為一個(gè)SEQ ID NO44的成熟的輕鏈可變區(qū)和一個(gè)SEQ ID NO :43的成熟的重鏈可變區(qū)的，且被指定HuABClOl。本發(fā)明還提供HuABClOl的變異型。這樣的變異型通常由少數(shù)(例如，典型地不超過(guò)1、2、3、5或10)替換、缺失或插入而造成與HuABClOl序列的不同。這種差異通常發(fā)生在框架中，但也可發(fā)生在CDRs。例如，只有在H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49位點(diǎn)的替換子集可以被制備。人源化抗體中許多不接觸CDRs的框架殘基能適應(yīng)源于供體鼠抗體或其他鼠或人抗體的相應(yīng)位置的氨基酸的替換，且甚至許多潛在的CDR-接觸殘基也服從替換或CDRs內(nèi)的的氨基酸可以被改變。一個(gè)示例性的CDR替換是將一個(gè)CDR內(nèi)的一個(gè)殘基替換為用于提供可變區(qū)框架的占據(jù)人受體序列相應(yīng)位置的殘基。
通常，在變異的人源化ABClOl序列內(nèi)的替換關(guān)于被替換的ABClOl氨基酸是保守的。優(yōu)選地，發(fā)生在ABClOl內(nèi)的替換(不論是否保守)對(duì)結(jié)合親和力或人源化mAb效價(jià)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的效果，即，它抑制包括⑶122的受體與IL-2和IL-15之間相互作用的能力(例如，展示的實(shí)施例和背景中描述的分析方法中的一些或所有變型的人源化ABClOl抗體“效價(jià)”本質(zhì)上是相同的，即，實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，與HuABC2 “效價(jià)”相同)。優(yōu)選地，成熟的變型的輕鏈和重鏈V區(qū)的序列至少90 %，更優(yōu)地，至少95 %，并且最優(yōu)選地，至少98 %相同于各自的HuABClOl成熟的輕鏈和重鏈V區(qū)?；蛘?，特別是那些與HuABClOl的可變區(qū)框架序列具有高度序列一致性的其他人抗體可變區(qū)框架受體序列，也適合提供人源化抗體框架。
在一些變型的HuABClOl中，至少1、2、3、4、5、6或所有7個(gè)受體-供體替換位點(diǎn)，其已在示例性抗體中提及(即H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49)，優(yōu)選地分別被殘基Y、T、M、Q、I、R和K替換(所述殘基占據(jù)小鼠供體抗體重鏈的相應(yīng)位置)。如果所述重鏈?zhǔn)荏w序列是DA936142cDNA(GenBank登錄號(hào))編碼的序列之外的序列，或所述輕鏈?zhǔn)荏w序列Z46622cDNA (GenBank登錄號(hào))編碼的序列之外的序列，受體-供體替換對(duì)于特定可變框架區(qū)位點(diǎn)的特定占據(jù)可以是或不是必須的，這取決于占據(jù)特定位點(diǎn)的殘基是否在受體與供體之間相同。
P-嵌合抗體與飾面抗體
本發(fā)明進(jìn)一步提供了非人類抗體，特別是實(shí)施例中的ABC2和ABClOl抗體，其嵌合形式與飾面形式(Veneered)。
嵌合抗體是這樣一種抗體，其中非人類抗體(例如，鼠)的輕鏈和重鏈的成熟的可變區(qū)與人輕鏈和重鏈恒定區(qū)結(jié)合。這樣的抗體，實(shí)質(zhì)上或完全保留鼠抗體的結(jié)合特異性，并且具有大約三分之二的人類序列。
飾面抗體是這樣一種類型的人源化抗體，該抗體保留一些通常所有非人抗體的CDRs和一些的非人可變區(qū)框架殘基，但將其他可變區(qū)框架殘基(可能對(duì)B或T細(xì)胞抗原表位有貢獻(xiàn)，例如暴露的殘基(Padlan, Mol. Immunol. 28 :489,1991)取代為源自人抗體序列相應(yīng)位點(diǎn)的殘基。其結(jié)果是這樣一種抗體，其中CDRs全部或?qū)嵸|(zhì)上來(lái)源于非人抗體，且非人抗體的可變區(qū)框架則由于取代而變得更人源化。本發(fā)明包括ABC2或ABC101抗體的飾面形式。
E-人的抗體
人類抗CD122的抗體用下面的多種技術(shù)來(lái)描述。有些人抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選，通過(guò)Winter的(如上)噬菌體展示法篩選，或以其他方式，以獲得與特定小鼠抗體(如實(shí)施例中小鼠單克隆抗體之一)具有相同抗原表位特異性。具有特定抗原表位特異性的人抗體也可以通過(guò)只用⑶122的一個(gè)片段作為目標(biāo)抗原來(lái)篩選，和/或用⑶122的缺失突變體集合作為抗原來(lái)篩選。
人抗體的制造方法包括的三源雜交瘤方法，Oestberg等，Hybridoma 2 361-367 (1983) ;Oestberg，美國(guó)專利 No. 4，634，664 ;和 Engleman 等，美國(guó)專利 4，634，666，轉(zhuǎn)基因小鼠的使用，其中包括人免疫球蛋白基因(見(jiàn)，如Lonberg等，W093/12227(1993) ；US5，877，397，US 5，874，299，US 5，814，318，US 5，789，650，US 5，770，429，US 5，661，016，US5，633，425，US 5，625，126，US 5，569，825，US 5，545，806，Nature 148，1547-1553 (1994)，Nature Biotechnology 14,826(1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991))和卩遼菌體展示方法(見(jiàn)，如 Dower 等，WO 91/17271 和 McCafferty 等，WO 92/01047, US 5，877，218，US5，871，907，US 5，858，657，US 5，837，242，US 5，733，743 和 US 5,565,332)。
F.恒定區(qū)選擇
嵌合抗體、人源化抗體(包括面飾抗體)，或人抗體的重和輕鏈可變區(qū)可以被連接到人恒定區(qū)的至少一部分。在某種程度上，恒定區(qū)的選擇取決于抗體依賴性補(bǔ)體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是否是所期望的。例如，人類的同種型IgGl和IgG3具有補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性但人類同種型IgG2和IgG4不具有。輕鏈恒定區(qū)可以是λ或κ?？贵w可以表達(dá)為含有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體、表達(dá)為單獨(dú)的重鏈和輕鏈、表達(dá)為Fab，F(xiàn)abi , F(ab/ )2,和Fv，或單鏈抗體，其中重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域通過(guò)間隔區(qū)鏈接。
人恒定區(qū)在不同個(gè)體間顯示同種異型(alIotypic)的變化和同族同種異型的(isoallotypic)變化，即恒定區(qū)在不同個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可以不同。同種異型和同族同種異型的(isoallotypic)區(qū)別在于血清識(shí)別一個(gè)結(jié)合于一個(gè)或多個(gè)其他同種型(isotype)的非多態(tài)性區(qū)域的同族同種異型(isoallotype)。關(guān)于人的恒定區(qū),包括具有天然的的同種異型的恒定區(qū)，或具有在多態(tài)性位點(diǎn)被置換殘基占據(jù)了的天然同種異型的恒定區(qū)。
在輕鏈和/或重鏈的氨基端或羧基端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如重鏈C-末端的賴氨酸，可能會(huì)丟失或在某一部分或全部分子上衍生化?？稍诤愣▍^(qū)制備替換，以減少或增加效應(yīng)子功能，如補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或ADCC(參見(jiàn)，例如Winter等，US PatentNo. 5, 624, 821 ；Tso 等，US Patent No. 5, 834, 597 ；and Lazar 等·，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 103 :4005, 2006)，或在人體內(nèi)延半衰期(參見(jiàn)，例如 Hinton 等，J. Biol. Chem. 279 6213，2004)。示例性的的替換包括在250位的谷氨酰胺和/或428位的亮氨酸(EU編號(hào))，可以增加抗體的半衰期。234、235、236和/或237任意位點(diǎn)的替換可以降低對(duì)？0^受體的親和力，有其是Fe YRI受體(參見(jiàn)，例如US 6，624，821)。任選地，在人IgG2的234、236和/或237位被丙氨酸取代，235位被谷氨酰胺取代。(參見(jiàn)，例如US5，624，821)。
H.重鉬杭體的表汰
嵌合的，人源化的(飾面的)和人的抗體通常由重組表達(dá)產(chǎn)生。重組多核苷酸構(gòu)建體通常包括一個(gè)連接到抗體鏈編碼序列的表達(dá)控制序列，其包含天然聯(lián)合的或異源的啟動(dòng)子區(qū)。優(yōu)選地，所述表達(dá)控制序列是在載體內(nèi)的能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)真核宿主細(xì)胞的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)。一旦該載體已被納入適當(dāng)?shù)乃拗?，宿主被置于合適的環(huán)境，以高水平地表達(dá)所述的核苷酸序列，及收集和純化交叉反應(yīng)抗體。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞是一種優(yōu)選的表達(dá)核苷酸片段(編碼免疫球蛋白或其片段)的宿主。見(jiàn)ffinnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)。一些能分泌完整的異源蛋白質(zhì)的合適宿主細(xì)胞系已在本領(lǐng)域中被開(kāi)發(fā)，包括CHO細(xì)胞系、各種COS細(xì)胞系、Hela細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、L細(xì)胞，和包括Sp2/0和NSO的非抗體產(chǎn)生骨髓瘤。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是非人的。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(Queen等，Immunol. Rev. 89 :49 (1986))，和必要的加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是來(lái)自內(nèi)源性基因、巨細(xì)胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動(dòng)子。見(jiàn)Co等，J. Immunol. 148 :1149(1992)。
一旦表達(dá)，抗體可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序被純化，包括HPLC純化、柱色譜法、凝膠電泳等(一般見(jiàn)《蛋白純化》(Springer-Verlag, NY, 1982)中的范圍(Scope)部分)
IV.治療的應(yīng)用
所述抗體可用于抑制各種不希望的免疫反應(yīng)，包括那些其中已使用的可抑制IL-2或IL-15各自相互作用的抗體。
由本發(fā)明的抗體治療的免疫系統(tǒng)疾病中的一類是移植排斥反應(yīng)。當(dāng)同種異體的細(xì)胞或器官(如皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺，胰腺、骨髓)移植到宿主(即，供體和受體是同一物種中的不同個(gè)體)，宿主的免疫系統(tǒng)很可能產(chǎn)生對(duì)移植物中外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答(宿主抗移植物疾病)，導(dǎo)致移植的破壞。本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)于阻止受體內(nèi)的異體抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)是特別有用的。
本發(fā)明的單克隆抗體的一個(gè)相關(guān)應(yīng)用是參與“移植物抗宿主”疾病(GVHD)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。當(dāng)免疫性感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到異體受體中時(shí)移植物抗宿主病(GVHD)是一種潛在致命的疾病。在這種情況下，供體的免疫活性細(xì)胞可能攻擊受體的組織。皮膚、腸道上皮細(xì)胞和肝組織是頻繁的被攻擊目標(biāo)，在GVHD過(guò)程中可能會(huì)被破壞。當(dāng)免疫組織被移植時(shí)，該病呈現(xiàn)出特別嚴(yán)重的問(wèn)題，如骨髓移植，但在其他情況下，不太嚴(yán)重的GVHD也被報(bào)道，包括心臟和肝臟移植。
需要免疫抑制的進(jìn)一步的情形是在治療I型糖尿病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、僵人綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。在這些疾病中，機(jī)體發(fā)展出細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答，來(lái)應(yīng)對(duì)自身抗原之一(導(dǎo)致該抗原的摧毀)，和潛在的嚴(yán)重的和/或致命后果。自身免疫性疾病可通過(guò)施用本發(fā)明的單克隆抗體之一來(lái)治療。
其他的可用本發(fā)明的單克隆抗體來(lái)治療的免疫系統(tǒng)疾病包括哮喘、過(guò)敏癥、腹腔疾病、牛皮癬、和葡萄膜炎。麩質(zhì)過(guò)敏癥、牛皮癬、葡萄膜炎是自身免疫性疾病。
其他的可用本發(fā)明的單克隆抗體來(lái)治療的失常包括癌癥，尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如白血病(例如，T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病)或淋巴瘤。一些這樣的癌癥可檢測(cè)到的CD 122水平，該CD122的檢測(cè)在蛋白質(zhì)(例如，使用示例抗體進(jìn)行免疫測(cè)定)或mRNA水平。相對(duì)于非癌組織，優(yōu)選來(lái)自同一病人，一些這樣的癌癥顯示出提高的CD122水平。任選地，癌癥中⑶122的水平在給予處理之前測(cè)量。
單克隆抗體的有效施用方案意味著劑量、給藥途徑和給藥頻率可以延遲發(fā)病、減少嚴(yán)重性、抑制進(jìn)一步惡化，和/或改善疾病的至少的一個(gè)跡象或癥狀。如果患者已經(jīng)患有的疾病，所述方案可以稱作治療性有效方案。如果病人相對(duì)于一般人群顯示出更高的疾病風(fēng)險(xiǎn)，但尚未出現(xiàn)癥狀，所述方案可以被稱為預(yù)防性有效方案。在某些情況下，治療或預(yù)防效果可以通過(guò)與同一患者內(nèi)的歷史對(duì)照或過(guò)去經(jīng)驗(yàn)比較，而觀察患者得出。在其他情況下，治療或預(yù)防疾病的功效可以通過(guò)與為未受治療的病人對(duì)照群體比較，對(duì)接受了治療的病人群體進(jìn)行前臨床和臨床試驗(yàn)來(lái)證明。
示例性的單克隆抗體的劑量為O. 1-20，或O. 5-5mg/kg體重(例如，O. 5、1、2、3、4或5mg/kg)，或10-1500mg作為固定劑量。該劑量依賴于病人的狀況和前期治療反應(yīng)，若有的話，該處理是預(yù)防性的還是治療性的，該紊亂是急性的還是慢性的，以及其他因素。
給藥可以是腸胃外、靜脈內(nèi)的、口服的、皮下的、動(dòng)脈內(nèi)的、顱內(nèi)的、鞘內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、局部的、鼻內(nèi)的或肌內(nèi)的。施用進(jìn)入體循環(huán)采用靜脈內(nèi)的或皮下給藥的是優(yōu)選的。靜脈內(nèi)給藥可以是，例如，通過(guò)一段30-90分鐘的輸注。
給藥的頻率取決于在循環(huán)中的抗體的半衰期、患者的病情和給藥途徑，以及其他因素。所述的頻率可以是每天、每周、每月、每季度或不定期，這要針對(duì)病人的所治療的疾病的病情變化或進(jìn)展。一個(gè)示例性的靜脈給藥頻率是在一個(gè)連續(xù)的治療過(guò)程中每周和季度之間，雖然也可以以更高或更低的頻率。對(duì)于皮下給藥，一個(gè)示例性的給藥頻率是在每周和每月之間，雖然也可以以更高或更低的頻率。
給藥劑量的數(shù)目取決于該紊亂是急性還是慢性，和治療后該紊亂的響應(yīng)。對(duì)于急性紊亂或慢性紊亂的急性發(fā)作，I至10之間劑量通常就足夠了。有時(shí)一個(gè)快速注射，可選擇地，以分開(kāi)的形式，足夠應(yīng)對(duì)急性紊亂或慢性紊亂的急性發(fā)作。急性紊亂或急性發(fā)作的治療可 以重復(fù)或循環(huán)。對(duì)于慢性紊亂，可以在固定的時(shí)間間隔給藥，如在病人至少I年、5年或10年或?qū)Σ∪艘簧鷥?nèi)每周、每?jī)芍?、每月、每季度、每半年給藥。
用于腸胃外給藥的藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的，實(shí)質(zhì)上等滲并且在GMP條件下制造。藥物組合物可以以單位劑量形式(即，單次給藥的劑量)提供。藥物組合物可使用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑配制。該配制取決于所選擇的給藥途徑。對(duì)于注射劑，抗體可在水溶液中配制，優(yōu)選在生理性相容緩沖液中如Hank氏溶液、林格氏溶液、或生理鹽水或醋酸鹽緩沖液(以減少在注射部位的不適)。該溶液可以含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘呖贵w在使用前可以是凍干形式，以與合適的載體(如無(wú)菌無(wú)熱原水)共同構(gòu)成。
使用本發(fā)明的抗體進(jìn)行治療，可以與其他應(yīng)對(duì)所治療的紊亂的有效療法一起使用。傳統(tǒng)的治療免疫紊亂的方法包括肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑、皮質(zhì)類固醇、非類固醇消炎藥和較強(qiáng)的抗炎藥物，如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、瘤可寧，F(xiàn)K506和環(huán)孢菌素。生物類抗炎劑，如Tysabri (那他珠單抗)或Humira (阿達(dá)木單抗)，也可以被使用。當(dāng)用于治療癌癥時(shí)，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合化療、輻射、干細(xì)胞治療、外科手術(shù)，或用其他生物制劑治療，如對(duì)抗HER2抗原的赫賽汀 (曲妥珠單抗)、對(duì)VEGF的抗阿瓦斯丁 (貝伐單抗)，或EGF受體的抗體，如(愛(ài)必妥 ,西妥昔單抗)，和Vectibix (帕尼單抗)?；焺┌ū蕉∷岬妗h(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、卡鉬、柔紅霉素、阿霉素、依達(dá)比星，和米托蒽醌、甲氨蝶呤、氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷、足葉乙甙或托泊替康、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿。
V.其他應(yīng)用
所述的抗CD122抗體可以用于檢測(cè)臨床診斷或治療中的CD122或用于研究。例如，該抗體可用于檢測(cè)T-細(xì)胞上呈現(xiàn)的⑶122，可作為患者是否遭受可服從治療的免疫介導(dǎo)的紊亂進(jìn)行指示。腫瘤上表達(dá)的CD122也可以指示該腫瘤是適合本發(fā)明的抗體治療的。所述抗體也可以作為用于實(shí)驗(yàn)室研究的試劑出售，該研究是檢測(cè)T細(xì)胞和它們對(duì)各種刺激的反應(yīng)。在上述用途中，單克隆抗體可以被熒光分子、自旋標(biāo)記分子、酶或放射性同位素標(biāo)記，亦可以試劑盒(含有必要的檢測(cè)CD122的試劑)的形式提供。該抗體也可以被用來(lái)純化CD122，例如，通過(guò)親和層析法。所有以上和以下引用的專利申請(qǐng)、網(wǎng)站、其出版物、注冊(cè)號(hào)等以全文引用的方式并入，其引用程度就如同將每一項(xiàng)特定且個(gè)別地以全文引用的方式并入。如果不同版本的序列在不同時(shí)期結(jié)合了不同注冊(cè)號(hào)，則所述版本及其注冊(cè)號(hào)以本申請(qǐng)的有效申請(qǐng)日為準(zhǔn)。如果適用，關(guān)于所述的注冊(cè)號(hào)，有效申請(qǐng)日意味著比實(shí)際申請(qǐng)日更早或優(yōu)先申請(qǐng)的申請(qǐng)日。同樣，如果不同版本的公開(kāi)文本、網(wǎng)站等公開(kāi)于不同時(shí)間，則以最接近本申請(qǐng)有效申請(qǐng)時(shí)間的版本為準(zhǔn)，除非另有說(shuō)明。本發(fā)明的任何功能，步驟，元件，實(shí)施例可以結(jié)合任何其他使用，除非另有說(shuō)明。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)圖示和實(shí)施例描述了本發(fā)明的一些細(xì)節(jié)，以便于清楚和理解，很明顯某些實(shí)施某些變化和修改也是在權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)的。
實(shí)施例
下面的例子討論人抗CD122的單克隆抗體的生產(chǎn)、表征和人源化，并提供示例方法，通過(guò)方法，本發(fā)明描述的抗體對(duì)CD122的結(jié)合特性可以被確定。
實(shí)施例I· 鼠抗人CD122單克隆抗體的分離
使用兩種形式的免疫原來(lái)引起的小鼠的抗CD122響應(yīng)分離的融合了人IgGlFc區(qū)(CD122-Fc)的人CD122胞外結(jié)構(gòu)域的和鼠骨髓瘤細(xì)胞(NSO)轉(zhuǎn)染子，該轉(zhuǎn)染子能在細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人CD122和人CD132(完整的天然人IL-2/15中間親和力受體)(NSO-β Y)。能編碼⑶122-Fc的基因的產(chǎn)生通過(guò)以下方法制備將編碼5’序列的人CD122的細(xì)胞外區(qū)域(包括它的信號(hào)肽)融合到人IgGl Fe編碼序列。所述的CD122_Fc基因在人CMV早期啟動(dòng)子控制下被克隆進(jìn)一個(gè)表達(dá)載體。該表達(dá)載體還含有一個(gè)gpt標(biāo)記用于篩選，所述的CD122-FC表達(dá)載體然后通過(guò)電穿孔導(dǎo)入到小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO (歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)會(huì)，索爾斯伯利，威爾特郡，英國(guó))，且使用gpt標(biāo)記來(lái)篩選轉(zhuǎn)染子。消耗培養(yǎng)基采用ELISA篩選分析分泌的⑶122-Fc，高產(chǎn)細(xì)胞系用無(wú)血清培養(yǎng)基HybridomaSFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將消耗的無(wú)血清培養(yǎng)基中的CD122_Fc用Protein A Sepharose⑩親和層析進(jìn)行純化。對(duì)于NSO-β Y穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子,其同樣通過(guò)將含全長(zhǎng)人CD122和CD132的編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)NSO細(xì)胞來(lái)創(chuàng)建。同時(shí)在細(xì)胞表面上表達(dá)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染子通過(guò)使用市售的抗人CD122和CD132的抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)識(shí)別。
鼠雜交瘤的生產(chǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。首先篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液，用ELISA篩選對(duì)人CD 122的反應(yīng)性。用CD122-Fc或不相干-Fe融合蛋白包被微量滴定板。將小鼠雜交瘤的消耗培養(yǎng)基加入到微量滴定板的各孔中。孵育后，用PBS洗滌板，再與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠κ多克隆抗體孵育，再次洗滌，并與過(guò)氧化物酶底物ABTS反應(yīng)。顯示對(duì)CD122-Fc反應(yīng)性，卻不顯示對(duì)不相干-Fe融合蛋白反應(yīng)性的上清液被認(rèn)定為對(duì)CD122具有特異性，然后擴(kuò)大培養(yǎng)該雜交瘤。對(duì)在細(xì)胞表面表達(dá)的天然人CD122的反應(yīng)性可以由如下證明建立，即通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證明這些上清液對(duì)NSO- β Y和由PHA及IL-2激活的人T細(xì)胞的反應(yīng)性，但不對(duì)非轉(zhuǎn)染的NSO具有反應(yīng)性。
能分泌與天然人CD122特異性結(jié)合的抗體的鼠雜交瘤，被分別亞克隆、同型化(isotyped),且在無(wú)血清培養(yǎng)基(使用Hybridoma-SFM)以純化單克隆抗體。鼠IgG2a和IgG2b抗體用Protein A Sepharose _親和層析純化，鼠IgGl用G蛋白純化。純化的鼠抗人CD122單克隆抗體最初的表征是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定與人CD122的結(jié)合，其中CD122表達(dá)于普通(人T細(xì)胞)和轉(zhuǎn)染的(NSO-β Y)細(xì)胞。根據(jù)最初與⑶122結(jié)合和功能表現(xiàn)，兩種抗 CD 122 抗體，ABC2 (IgGl/ κ )的 ABClOl (IgG2b/ κ )被篩選出。ABC2 和 ABClOl 均特異性地結(jié)合到人和獼猴⑶122，但缺乏顯著的狗和鼠⑶122結(jié)合(與不相關(guān)對(duì)照抗體在檢測(cè)上無(wú)區(qū)別)。
實(shí)施例2
IL-15介導(dǎo)的增殖的抑制
人類紅白血病細(xì)胞株TF-I (ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州)的增長(zhǎng)是完全依賴于外源提供的細(xì)胞因子，如 GM-CSF 或 IL-3 (Kitamura, T.等，Blood 73 =375-380 (1989))。TF-I 表達(dá)共有 Y 鏈(CD132)和 IL-15 的受體 α 鏈(Mortier 等，J. Biol. Chem. ,281 1612-1619 (2006))，但不表達(dá) IL-2/IL-15 受體 β 鏈(CD122)，因此 IL-15 不能支持 TF-I的增長(zhǎng)。TF-I內(nèi)⑶122基因的表達(dá)允許中度和高度親和力的IL-15受體的表達(dá)，且允許人IL-15支持所述轉(zhuǎn)染子的增殖。TF-Ιβ產(chǎn)生自穩(wěn)定的TF-I轉(zhuǎn)染子，該轉(zhuǎn)染子具有攜帶編 碼人類⑶122的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和一個(gè)嘌呤霉素抗性基因。TF-I β在人IL-15的存在下，及提供一個(gè)可溶的復(fù)合物的條件下增殖，該復(fù)合物為人IL-15結(jié)合到人IL-15R的胞外域的一部分上(scIL-15/IL_15Ra)，這取代了細(xì)胞結(jié)合的IL-15/IL-15Ra復(fù)合物并代表7 IL-15 的反式呈遞(Mortier 等，J. Biol. Chem.，281 :1612-1619(2006))。所述的 IL-15/IL-15Ra片段復(fù)合物(scIL-15/IL-15Ra)是通過(guò)將人IL-15R a sushi結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽連接到人IL-15，并且在羧基末端加入了 6個(gè)組氨酸殘基，這基本上都由Mortier報(bào)道(J. Biol.Chem. ,281 :1612-1619 (2006))，且他還提供了一個(gè)IL-15反式呈遞的模型。
抗CD122單克隆抗體抑制由反式呈遞介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的能力，是用TF-I β細(xì)胞和scIL-15/IL-15Ra檢測(cè)。在典型的實(shí)驗(yàn)中，6x IO4TF-I β細(xì)胞與不同量的純化的鼠抗⑶122單克隆抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml scIL-15/IL-15R,然后將細(xì)胞在37°C下額外孵育72小時(shí)，然后加入四唑鹽WST-8 (Dojindo分子技術(shù)，羅克韋爾市，美國(guó)馬里蘭州)。用WST-8在37°C下孵育3小時(shí)后，細(xì)胞增殖通過(guò)測(cè)定450nm處的吸光度而被推斷，該測(cè)定可指示脫氫酶活性并與活細(xì)胞數(shù)目成正比。在被測(cè)抗體存在下的細(xì)胞增殖水平和不添加抗體的細(xì)胞增殖水平進(jìn)行比較，以測(cè)定抑制活性。如圖I所示，ABC2和ABClOl實(shí)質(zhì)上抑制了由IL-15反式呈遞(體現(xiàn)為scIL-15/IL-15Ra)介導(dǎo)的TF-Ιβ細(xì)胞的生長(zhǎng)，在ABC2濃度為1.0yg/m I及ABClOl濃度為O. 5 μ g/ml時(shí)，可顯示約50%的抑制。
也使用TF-I β檢測(cè)抗CD122單克隆抗體抑制由順式呈遞IL-15介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的能力。在典型的實(shí)驗(yàn)中，6x IO4 TF-I β細(xì)胞與不同量的純化的鼠抗⑶122單克隆抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml IL-15，然后將細(xì)胞在37°C下額外孵育72小時(shí)。細(xì)胞增殖水平的測(cè)定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無(wú)抗體對(duì)照相比較。當(dāng)濃度為370ng/ml時(shí)，ABC2和ABClOl實(shí)質(zhì)上分別抑制約75%和40%的TF-I β細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例3
通過(guò)中度或高親和力IL-2受體由IL-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制
ABC2和ABClOl被用來(lái)分析抑制細(xì)胞增殖的能力，該增殖由IL-2通過(guò)中度親和力IL-2受體介導(dǎo)的，該分析使用TF-I β細(xì)胞。在典型的實(shí)驗(yàn)中，6x IO4TF-I β細(xì)胞與不同量的純化的鼠抗CD122抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入200ng/ml IL-2，然后將細(xì)胞在37°C下孵育72小時(shí)。細(xì)胞增殖水平的測(cè)定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無(wú)抗體對(duì)照相比較。當(dāng)濃度為80ng/ml時(shí)，ABC2和ABClOl實(shí)質(zhì)上平均抑制超過(guò)50%的由IL-2介導(dǎo)的TF-I β 細(xì)胞生長(zhǎng)。 ABC2和ABClOl被用來(lái)分析抑制細(xì)胞增殖的能力，該增殖由IL-2通過(guò)高親和力IL-2受體介導(dǎo)。TF-Ia β由轉(zhuǎn)染了哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(編碼人⑶25和⑶122)的TF-I產(chǎn)生，因此表達(dá)IL-2的高親和力受體。在典型的實(shí)驗(yàn)中，6x IO4TF-I α β細(xì)胞與不同量的純化的鼠抗 CD122抗體在37°C下孵育10分鐘。然后加入10ng/ml IL-2，然后將細(xì)胞在37°C下孵育額外的72小時(shí)。細(xì)胞增殖水平的測(cè)定使用上述的四唑鹽WST-8，且與無(wú)抗體對(duì)照相比較。如圖2所示，在IL-2存在下，ABC2和ABClOl實(shí)質(zhì)上抑制了 TF-I α β細(xì)胞的增長(zhǎng)。在10 μ g/ ml濃度下，ABC2和ABClOl分別可抑制TF-I α β 49%和46%的增殖。 實(shí)施例4 重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列用TRIzol試劑(Invitrogen)從約IO7雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，5’ -RACE中的 oligo dT-primed cDNA使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)或SMARTer RACE cDNA Amplification試劑盒(Clontech,山景城，加利福尼亞州)，按照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)操作。重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNAs的擴(kuò)增用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行，使用使鼠Y-I和K鏈恒定區(qū)分別退火的3'引物和GeneRacer試劑盒或SMARTer RACE cDNA Amplification試劑盒提供的5 ' RACE引物。重鏈可變區(qū)(VH)的 PCR，3 '引物具有序列5 ' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3 '(對(duì)于 Y -I) (SEQ ID NO: 17)，5 ' -GCCAGTGGATAGACCGATGG-3 '(對(duì)于 Y _2a) (SEQ ID NO: 18)或 5' -GCCAGTGGATAGACTGATGG-3'(對(duì)于 Y _2b) (SEQ ID NO: 19)。對(duì)于輕鏈可變區(qū)(VL)， 3'引物具有序列5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO :20)。擴(kuò)增出的 VH 和 VL cDNAs被亞克隆進(jìn)pCR4Blunt-T0P0載體(Invitrogen)以進(jìn)行序列測(cè)定。一些重鏈和輕鏈克隆被測(cè)序，與典型鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)同源的單拷貝序列被認(rèn)定。ABC2VH的一致cDNA序列和推測(cè)的氨基酸序列在圖3中顯示。信號(hào)肽序列 (MKLffLNWVFLLTLLHGIQC) (SEQ ID NO 21)為斜體。成熟多肽(E)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù) Kabat 等· (Sequences of Proteins of Immunological Interests,第五版，NIH出版No. 91-3242，美國(guó)衛(wèi)生和公共服務(wù)部，1991)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。 ABC VH的CDR1、CDR2和CDR3序列分別為DFYME(SEQ ID NO 22), ASRNKANDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO 23)和 SYYRYDGMDY (SEQ ID NO :24)。成熟 ABC2VH 氨基酸序列是 EVKLVESGGGLVQPGG SLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDT AIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO :25)。ABC2VL 一致的cDNA序列或推測(cè)的氨基酸序列在圖4中顯示。信號(hào)肽序列 (MDFQVQIFSFLLISASVIVSRG) (SEQ ID NO 26)為斜體。成熟多肽(Q)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABC2VL的 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列分別為 SAISSVSYMY (SEQ ID NO :27)、DTSNLVS (SEQ ID NO 28)和 QQffNTYPYT (SEQ ID NO :29)。成熟 ABC2VL 氨基酸序列是 QVVLTQSPVMSASPGEKVTMTCSAISSV SYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWNTYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 30)。ABClOl VH—致的cDNA序列或推測(cè)的氨基酸序列在圖5中顯示。信號(hào)肽序列(MRVLILVYLLTVLPGILS) (SEQ ID NO 31)為斜體。成熟多肽(D)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABClOl VH的⑶R1、 CDR2 和 CDR3 序列分別為 NDNHWffN(SEQ ID NO 32)，YIDSSGSSDNNPSLKS (SEQ ID NO 33)和 GGGRDYYGMDY (SEQ ID NO :34)。成熟 ABClOl VH 氨基酸序列是 DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTV TGYSITNDNHWWNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGG GRDYYGMDYffGQGTSVTVSS(SEQ ID NO :35)。ABClOl VL—致的cDNA序列或推測(cè)的氨基酸序列在圖6中顯示。信號(hào)肽序列 (METDTLLLffVLLLffVPGSTG) (SEQ ID NO 36)為斜體。成熟多肽(D)的N-末端氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等.(同上)定義的⑶R序列用下劃線標(biāo)注。ABClOl VL的⑶R1、 CDR2 和 CDR3 序列分別為 RASQSVSTSSYSYVH(SEQ ID NO 37)，YASNLES(SEQ ID NO 38)和 QHSffDIPFT (SEQ ID NO :39)。成熟 ABClOl VL 氨基酸序列是 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS QSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSffDIPFTFG GGTKLEIK(SEQ ID NO 40)。實(shí)施例5ABC2VH和VL的人源化人源化VH和VL基因的設(shè)計(jì)和構(gòu)建根據(jù)已有方法進(jìn)行(Tsurushita，N.，等.，Methods 36:69-83(2005))。與小鼠ABC2 VH同源的人VH序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，且由人 DA430129cDNA(DA430129 VH)(GenBank 注冊(cè)號(hào)；Kimura，K.，等·，Genome Res. 16 55-65(2006))編碼的VH序列被選擇作為人源化受體。圖7顯示了成熟ABC2 VH、人源化 ABC2 VH(HuABC2 VH)和人受體DA430129 VH區(qū)氨基酸序列的比對(duì)。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABC2 VH氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計(jì)HuABC2 VH氨基酸序列，小鼠ABC2 VH的⑶R序列首先被轉(zhuǎn)接到DA430129VH的相應(yīng)位置。下一步，在框架區(qū)位置(該位置是小鼠ABC2可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義)，小鼠ABC2VH氨基酸殘基替換相應(yīng)的人殘基。這些取代，在HuABC2氨基酸序列用下劃線表示，發(fā)生在位置28、48、49、68和 93(圖.7)。另外，被發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)V區(qū)亞群中非典型的DA430129 VH人框架在氨基酸殘基被典型的殘基取代，減少潛在的免疫原性。這種類型的取代，在HuABC2 VH氨基酸序列用雙下劃線標(biāo)注，發(fā)生在位置42 (圖7)。編碼HuABC2 VH的基因被設(shè)計(jì)為外顯子，該外顯子包括一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)剪接供體信號(hào)、和適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)以為后續(xù)克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。HuABC2 VH基因的信號(hào)肽序列來(lái)自小鼠ABC2 VH基因。HuABC2 VH外顯子的剪接供體信號(hào)來(lái)自人類生殖系JHl段。側(cè)翼為Spe I和HindIII位點(diǎn)的所設(shè)計(jì)HuABC2 VH基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸如圖8所示。信號(hào)肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(同上)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。 成熟 HuABC2 VH 的氨基酸序列是 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIA ASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSYYRYDGMDYWGQGTTVTVSS. (SEQ ID NO 41)。與小鼠ABC2 VL同源的人Vk序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，且由人 M29469cDNA (M29469VL) (GenBank 注冊(cè)號(hào)；Spatz 等，J. Immunol. 144 =2821-2828 (1990))編碼的Vk序列被選擇作為人源化受體。圖9顯示了成熟ABC2VL、人源化ABC2 VL(HuABC2 VH)和人受體M29469 VL區(qū)氨基酸序列的比對(duì)。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABC2 VL氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計(jì)HuABC2 VL氨基酸序列，小鼠ABC2 VL的CDR序列首先被轉(zhuǎn)接到M29469 VL 的相應(yīng)位置。下一步，在框架區(qū)位置(該位置是小鼠ABC2可變區(qū)的三維模型，其被建議與 CDRs的聯(lián)系具有重要意義)，小鼠ABC2 VL氨基酸殘基71位，在HuABC2 VL中用下劃線標(biāo)注，替換相應(yīng)的人殘基(圖9)。編碼HuABC2 VL的基因被設(shè)計(jì)為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABC2 VL基因的信號(hào)肽和來(lái)自小鼠生殖系Jkl段的剪接供體信號(hào)。偵彳翼為NheI和 EcoRI位點(diǎn)的所設(shè)計(jì)HuABC2 VL基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸如圖10所示。信號(hào)肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991) 的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟HuABC2VL的氨基酸序列是EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCSAISSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVSGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQffNTYPYTF GGGTKVEIK(SEQ ID NO 42)。實(shí)施例6ABClOIVH和VL的人源化與小鼠ABC101VH同源的人VH序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，且由人 DA936142cDNA(DA936142VH) (GenBank 注冊(cè)號(hào)；Kimura 等，Genome Res. 16 :55-65 (2006)) 編碼的VH序列被選擇作為人源化受體。圖11顯示了成熟ABClOl VH、人源化A BClOl VH (HuABClOl VH)和人受體DA936142 VH區(qū)氨基酸序列的比對(duì)。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù) Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的⑶R序列在ABClOl VH氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計(jì)HuABClOl VH氨基酸序列，小鼠ABClOl VH的CDR序列首先被轉(zhuǎn)接到DA936142 VH的相應(yīng)位置。下一步，小鼠27、30、48、66、67和71位氨基酸，該位置是小鼠ABClOl可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義，替換相應(yīng)的人框架殘基。這些位置的氨基酸殘基在HuABClOlVH序列(圖11)用下劃線標(biāo)注。編碼 HuABClOl VH的基因被設(shè)計(jì)為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABClOl VH基因的信號(hào)肽和來(lái)自人生殖系JH6段的剪接供體信號(hào)。側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)的所設(shè)計(jì)HuABClOl VH 基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸如圖12所示。信號(hào)肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟 HuABClOl VH 的氨基酸序列是 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWffNWIRQHP GKGLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTTVTVS S (SEQ ID NO 43)。為人源化小鼠 ABC101 VL,由人 Z46622cDNA(Z46622VL) (GenBank 注冊(cè)號(hào)；Giachino 等，J. Exp. Med. 181 =1245-1250(1995))編碼的Vk序列被選擇作為受體。圖13顯示了成熟 ABC101 VL、人源化ABC101 VL (HuABClOl VL)和人受體Z46622VL區(qū)氨基酸序列的比對(duì)。序列上面的數(shù)字指示了根據(jù)Kabat等人(同上)規(guī)定的位置。由Kabat等人(同上)定義的 ⑶R序列在ABC101VL氨基酸序列中用下劃線標(biāo)注。為設(shè)計(jì)HuABClOl VL氨基酸序列，小鼠 ABC101 VL的⑶R序列首先被轉(zhuǎn)接到Z46622 VL的相應(yīng)位置。下一步，下一步，小鼠49位氨基酸，該位置是小鼠ABC101可變區(qū)的三維模型，其被建議與CDRs的聯(lián)系具有重要意義， 替換相應(yīng)的人框架殘基。這些位置的氨基酸殘基在HuABClOl VL序列(圖13)用下劃線標(biāo)注。編碼HuABClOl VL的基因被設(shè)計(jì)為外顯子，該外顯子包括所述的小鼠ABC101 VL基因的信號(hào)肽和來(lái)自小鼠生殖系Jk2段的剪接供體信號(hào)。側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)的所設(shè)計(jì) HuABClOl VL基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸如圖14所示。信號(hào)肽序列用斜體標(biāo)注。成熟多肽的N-末端的氨基酸殘基用雙下劃線標(biāo)注。根據(jù)Kabat等人(1991)的定義的CDR序列以下劃線標(biāo)出。成熟HuABClOl VL的氨基酸序列是DIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSS YSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWDIPFTFGQGTKLEI K(SEQ ID NO 44)。實(shí)施例7HuABC2 和 HuABClOl IgGl/κ 抗體的表達(dá)設(shè)計(jì)有SpeI和HindIII位點(diǎn)的HuABC2 VH基因和設(shè)計(jì)有Nhe I和EcoR I位點(diǎn)的HuABC2 VL基因，被插進(jìn)一個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)，以生成pHuABC2。設(shè)計(jì)有Spe I和 HindIII位點(diǎn)的HuABClOl VH和設(shè)計(jì)有Nhe I和EcoR I位點(diǎn)的HuABClOl VL，被插進(jìn)一個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的相應(yīng)位點(diǎn)，以生成pHuABClOl。pHuABC2和pHuABClOl (全體地，表達(dá)載體)的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖15。從頂部的SalI位點(diǎn)沿順時(shí)針?lè)较?，所述的表達(dá)載體包含的重鏈轉(zhuǎn)錄單元，該單元開(kāi)始于人巨細(xì)胞病毒(CMV)的主要立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(CMV啟動(dòng)子) 以起始抗體體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV之后是VH外顯子，它是一個(gè)含有人Y-I重鏈恒定區(qū)的基因組序列，該區(qū)包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3與其間的內(nèi)含子，CH3之后還有為mRNA加工的 Y -I基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。重鏈基因序列之后，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元開(kāi)始于CMV啟動(dòng)子，隨后為VL的外顯子和一個(gè)基因組序列，該基因組序列含有人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)及其前部的部分內(nèi)含子和該κ基因的poly A信號(hào)。所述的輕鏈基因后是SV40早期啟動(dòng)子(SV40啟動(dòng)子)，大腸桿菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)，和含有SV40多聚腺苷酸化位點(diǎn)(SV40poly(A)位點(diǎn))的片段。最后，所述的表達(dá)載體含有質(zhì)粒pUC19的一部分， 其包含細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(pUC ori)和beta-內(nèi)酰胺酶基因(β內(nèi)酰胺酶)。為了獲得穩(wěn)定產(chǎn)生HuABC2和HuABClOl IgGl的/ κ抗體的細(xì)胞系(分別為HuABC2 和HuABClOl)，表達(dá)載體pHuABC2和pHuABClOl分別為被引入到小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO的染色體中。通過(guò)電穿孔進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NSO,電穿孔技術(shù)為Bebbington等人所描述(Bio/ Technology 10 :169-175，1992)。(生物/10 :169-175，1992)。在轉(zhuǎn)染前，表達(dá)載體使用 FSPI 將之線性化。用10 μ g線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染約IO7細(xì)胞，懸浮在含有10% FBS的DME培養(yǎng)基中， 并鍍?cè)趲讉€(gè)96-孔中。24小時(shí)后，選擇培養(yǎng)基(含有10% FBS、HT培養(yǎng)基補(bǔ)充物(Sigma， St. Louis,MO)、0· 25mg/ml黃嘌呤和I μ g/ml霉酹酸的DME培養(yǎng)基)被施加。經(jīng)過(guò)約10天的處篩選，來(lái)自轉(zhuǎn)染子成活篩選的培養(yǎng)上清液被用于抗體生產(chǎn)的分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟，用夾心ELISA測(cè)定HuABC2和HuABClOl的表達(dá)，通常使用羊抗人IgG Fe多克隆抗體來(lái)捕獲，使用HRP標(biāo)記的羊抗人κ鏈多克隆抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的人源化抗體。 不同量的合適的人IgGl/κ抗體被用來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以用于定量。分別高產(chǎn)HuABC2和 HuABClOl的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子在無(wú)血清培養(yǎng)基(使用Hybridoma SFM(Invitrogen))中適應(yīng)并擴(kuò)增。用Protein A親和層析法純化HuABC2和HuABClOl。實(shí)施例8人源化的抗CD 122抗體的特征對(duì)純化的HuABC2和HuABClOl進(jìn)行抑制TF-I β增殖能力的測(cè)試，所述的增殖是通過(guò)可溶的IL-15/IL-15Ra復(fù)合體介導(dǎo)的(如上文所述的，用scIL-15/IL_15Rα作為IL-15反式呈遞的方式)(圖16)。HuABC2和HuABClOl實(shí)質(zhì)上均可抑制TF-I β的增長(zhǎng)，然而小鼠抗 ⑶122單克隆抗體的人源化形式(HuMik-β I ；Hakimi等，同上)在測(cè)試的最高濃度(10 μ g/ ml)只顯示了輕微抑制。對(duì)于抑制IL-15反式呈遞到TF-I β細(xì)胞而介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，50% 抑制所需要的抗體濃度為對(duì)于HuABC2是O. 7 μ g/ml，對(duì)于HuABClOl是O. 5 μ g/ml，對(duì)于 HuMik-β I 是約 10 μ g/ml。對(duì)純化的HuABC2和HuABClOl進(jìn)行抑制TF-I α β增殖能力的測(cè)試，上文已描述， TF-I α β在IL-2的存在下能表達(dá)高親和力的IL-2受體(圖17)。HuABC2和HuABClOl實(shí)質(zhì)上均可抑制TF-Ia β的增長(zhǎng),然而HuMik-β I在測(cè)試的最高濃度(100 μ g/ml)不顯示活性，只顯示了與同型對(duì)照相同的抑制水平。對(duì)于抑制IL-2介導(dǎo)的TF-I α β細(xì)胞增殖，50% 抑制所需要的抗體濃度為對(duì)于HuABC2是14 μ g/ml，對(duì)于HuABClOl是42 μ g/ml。實(shí)施例9人源化的抗CD122抗體對(duì)對(duì)抗主體疾病的異種骨移植發(fā)育的體內(nèi)分析HuABC2療法對(duì)移植物抗宿主病發(fā)展的效果，可以通過(guò)給予免疫缺陷小鼠人 immuocompetant 細(xì)胞(van Rijn, R. S.,等·，Blood 102 :2522_2531 (2003))建立異種 (xenographic)模型而檢測(cè)。通過(guò)引入人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),異種的移植物抗宿主疾病(XGVH D)可誘導(dǎo)于 NOD/Shi-scid，IL-2R y nul1 (NOG)小鼠(描述于 Ito，R.等， Transplantation 87 1654-1658 (2009)) 特別地，每次間隔注射的 Ix IO7 人 PBMC 的 8_10 周年齡的NOG小鼠在注射前一天接受2. 5Gy的輻照。對(duì)小鼠每天進(jìn)行監(jiān)測(cè)及每周兩次稱重來(lái)跟蹤疾病的發(fā)展。發(fā)展了 XGVHD的小鼠在注射PBMC2-3天后開(kāi)始體重降低，并表現(xiàn)出駝背姿勢(shì)、豎起皮毛、行動(dòng)不便、呼吸急促、貧血，注射了 Ix IO7人PBMC的輻照受體在10-14天后死亡。為了顯示接受了人源化抗⑶122抗體的小鼠在XGVHD過(guò)程中的改變，NOG小鼠在注射PBMC前一天接受腹膜內(nèi)注射10mg/kg (抗體/體重)對(duì)照人IgGl抗體或HuABC2，或在注射PBMC當(dāng)天接受，或在注射PBMC后3天、7天和10天接受。在實(shí)施每種抗體前對(duì)小鼠稱重，且在死之前或按IA⑶C準(zhǔn)則犧牲之前檢測(cè)XGVHD的跡象，該跡象已在上文描述。人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)疾病進(jìn)展的跡象指示，其在注射PBMC10天后通過(guò)檢測(cè)人CD45+百分含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述的CD45+百分含量是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)每只小鼠的血液中的CD45+百分含量進(jìn)行檢測(cè)。在注射PBMC10天后，被施用對(duì)照抗體的小鼠體重平均降低了 20±2.8%，而被施用HuABC2的小鼠體重平均僅降低了 10+2. 3%。在注射PBMC10天后，被施用對(duì)照抗體的小鼠其血液中平均有89. 2±4. 2%人⑶45+細(xì)胞，而被施用HuABC2的小鼠其血液中平均有64. 9± 11. 6%人⑶45+細(xì)胞。在注射PBMC10天后，被施用對(duì)照抗體的全部6只小鼠死亡，而被施用HuABC2的小鼠當(dāng)天僅有2只死亡。因此，通過(guò)3個(gè)獨(dú)立的參數(shù)體重下降百分?jǐn)?shù)、人細(xì)胞轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)和死亡數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)，相比于施用對(duì)照抗體，被施用HuABC2的小鼠顯示了較輕的GVHD癥狀。例10在牛皮癬模型中分析人源化抗CD122抗體當(dāng)將人牛皮癬患者皮膚移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠時(shí)，牛皮癬的表型特征(例如，表皮增厚、廣泛的表皮突形成和炎性細(xì)胞的出現(xiàn))仍然存在(NickolofT等.， Am. J. Pathol. 146 :580_588 (1995))。這個(gè)模型已被用于研究牛皮癬病候選藥物的療效(Zegler 等，Lab Invest. 81 :1253-1261 (2001) ；Villadsen 等，J. Clin. Invest. 112 1571-1580(2003) ;Bhagavathula 等，Am. J. Pathol. 166 :1009-1016 (2005))，并且對(duì)人的療效，該模型也是有積極影響的。本實(shí)施例描述了體內(nèi)研究，其可在牛皮癬患者皮膚-SCID小鼠移植模型中證明HuABC2的功效。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，人牛皮癬患者皮膚移植到SCID小鼠。組織愈合后，小鼠經(jīng)腹腔注射HuABC2或?qū)φ湛贵w，劑量為每3天(共21天)每只動(dòng)物10mg/kg。處理期結(jié)束后， 處死動(dòng)物。將移植的人牛皮癬皮膚及周圍的少量鼠皮膚切下，用10%福爾馬林緩沖液固定，組織切片用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)檢查。每個(gè)組織切片的表皮面積以相等部分(equal segments)獲得,表皮厚度以盲法(blinded manner)計(jì)算。移植前的一小片固定在10%福爾馬林緩沖液中牛皮癬供體皮膚用于表皮厚度的零時(shí)間分析(zero-time assessment)。將 HuABC2組和對(duì)照組的表皮厚度對(duì)比，來(lái)評(píng)價(jià)HuABC2對(duì)牛皮癬的功效。HuABC2的影響還通過(guò)以下方式進(jìn)一步評(píng)價(jià)(I)分析皮膚移植的組織學(xué)特征，來(lái)分析牛皮癬的特征，包括表皮增生和表皮突的形成，及(2)將組織切片染色，染料為對(duì)抗人CD3的抗體或其他細(xì)胞表面標(biāo)記物，以認(rèn)定浸潤(rùn)細(xì)胞。實(shí)施例11表位定位 ⑶122的胞外區(qū)由兩個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域組成，稱為Dl和D2(Wang，X.等.Science 310 :1159-1163(2005))。為定位由ABC2和ABClOl識(shí)別的CD122分子的抗原表位，所有的小鼠抗人⑶122抗體分子(來(lái)源于JN Biosciences)，他們結(jié)合于多種鼠/人嵌合⑶122 分子的形式，及在HEK293細(xì)胞的表面表達(dá)的人CD122分子的分離的結(jié)構(gòu)域由流式細(xì)胞術(shù)確定。此外，小鼠抗 CD 122 單克隆抗體 Mik- β I (Tsudo 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1982-1986(1989))包含進(jìn)所述的分析，其作為本發(fā)明的產(chǎn)生的進(jìn)一步的一個(gè)鼠抗⑶122抗體，ABCl 16，它相對(duì)于ABC2和ABClOl抑制CD 122與IL-2和IL-15相互作用的能力較低。描述于圖18中的所述的6個(gè)不同的重組⑶122構(gòu)建體被用于分析。HuDl/HuD2包含人 ⑶122 Dl (成熟蛋白的I位丙氨酸至101位苯丙氨酸，SEQ ID NO 49)和D2(成熟蛋白的第 102位谷氨酸至214位蘇氨酸，SEQ ID NO 50)結(jié)構(gòu)域。I位的丙氨酸相當(dāng)于在人⑶122編碼區(qū)N-末端計(jì)數(shù)過(guò)來(lái)第27個(gè)氨基酸。MoDl/MoD2包含鼠⑶122 Dl (成熟蛋白I位的丙氨酸至第102位的苯丙氨酸，SEQ ID N051)和D2(成熟蛋白的第103位的天冬氨酸至215 位的異亮氨酸，SEQ ID NO 52)結(jié)構(gòu)域。HuDl/MoD2包含人Dl和鼠D2結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO 52)。MoDl/HuD2 包含鼠 Dl 和人 D2 結(jié)構(gòu)域(分別為 SEQ ID NO 51 和SEQ ID NO 50)。HuDl包含分離的人Dl結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :49)，及HuD2包含分離的人 D2結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:50)。所有的六個(gè)構(gòu)建體的羧基末端融合接到其后為源自人CD55基因的GPI錨定信號(hào)的FLAG肽上(SEQ ID NO :53)。這些構(gòu)建體被克隆進(jìn)合適的質(zhì)粒載體以在HEK293細(xì)胞表面上表達(dá)。ABC2、ABC101、ABC116和Mik-β I (5 μ g/ml)結(jié)合到表達(dá)6種CD 122構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染子的測(cè)定通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序由流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。細(xì)胞表面上表達(dá)這些構(gòu)建體，可用大鼠抗FLAG肽抗體L5 (BioLegend, San Diego, CA)認(rèn)證。能瞬時(shí)表達(dá)上述6種⑶122構(gòu)建體中任何一種的 HEK293細(xì)胞首先與被測(cè)試抗體中的一種進(jìn)行孵育。ABC2、ABC101、ABCl 16和Mik-β I與這些CD122構(gòu)建體的結(jié)合特性在圖18中總結(jié)。圖中的符號(hào)“ + ”表示，對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)染子，結(jié)合一個(gè)測(cè)試抗體的MCF (幾何平均通道熒光)值是結(jié)合L5的MCF值的至少50%。符號(hào)表示，結(jié)合一個(gè)測(cè)試抗體的MCF值是結(jié)合L5的MCF值的低于10% (即，指示在結(jié)合可測(cè)量精確的邊緣內(nèi)缺乏結(jié)合特異性)。單獨(dú)的人⑶122的Dl結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合ABC2和Mik-β I是足夠的。單獨(dú)的人CD122的D2結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合ABC116是足夠的。對(duì)于結(jié)合ABC101，人的 Dl結(jié)構(gòu)域和人D2結(jié)構(gòu)域或鼠D2結(jié)構(gòu)域之一是必要的，這顯示，ABClOl的抗原表位需要來(lái)自Dl和D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。更具體地定位ABC2、ABClOl和Mik-β I識(shí)別的CD122分子抗原表位，在HuDl/HuD2構(gòu)建體(SEQ ID NO 54)中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法的定點(diǎn)誘變，來(lái)產(chǎn)生單氨基酸替換突變體。每個(gè)突變的HuDl/HuD2構(gòu)建體的羧基末端融合接到其后為源自人CD55基因的GPI錨定信號(hào)的FLAG 肽上(SEQ ID N0:53)，這些構(gòu)建體在HEK293細(xì)胞表面上被測(cè)定和表達(dá)。在分析中使用的 HuDl/HuD2突變體列于圖19中。每個(gè)突變體名字中左邊的字母、中間的數(shù)字、右側(cè)的字母分別表示野生型⑶122中的一個(gè)氨基酸、⑶122中的位置、和突變體中的一個(gè)氨基酸。符號(hào) “ + ”和在圖中表示，當(dāng)測(cè)試抗體濃度為100ng/ml時(shí)，結(jié)合一個(gè)測(cè)試抗體的MCF值是結(jié)合大鼠抗FLAG肽抗體L5的MCF值的至少50%、10%和20%之間、不超過(guò)10%。人⑶122位置39和41的氨基酸殘基被確定為對(duì)Mik- β I結(jié)合到表達(dá)⑶122的細(xì)胞十分重要。Dionyssopoulou 等人(J. Immunol. Methods, 241 :83_95 (2000)),米用固相妝掃描技術(shù)，在此前曾報(bào)道，Mik-β I識(shí)別一個(gè)不連續(xù)抗原表位，該表位由D2結(jié)構(gòu)域中位于2個(gè)區(qū)域的氨基酸形成；一個(gè)區(qū)域在106位的亮氨酸至148位的脯氨酸之間，另一個(gè)在170位的谷氨酸和202位的丙氨酸之間。我們的研究檢測(cè)了細(xì)胞表面表達(dá)的CD122，顯示D2結(jié)構(gòu)域?qū)?Mik-β I結(jié)合到⑶122不是關(guān)鍵的，而決定性的Mik-β I識(shí)別的殘基只位于Dl結(jié)構(gòu)域。Dl結(jié)構(gòu)域的42、43和65位氨基酸殘基被發(fā)現(xiàn)對(duì)于ABC2結(jié)合到人⑶122是非常重要的(圖19)。對(duì)于ABClOl，Dl結(jié)構(gòu)域的65和70位的氨基酸殘基及D2結(jié)構(gòu)域的第133位的殘基則是重要的(圖19)。因此，氨基酸殘基的特殊設(shè)置與ABC2和ABClOl結(jié)合到⑶122 是有關(guān)的。HuABC2和HuABClOl與人⑶122的18個(gè)單氨基酸的取代突變體的結(jié)合顯示于圖19，且也用上面描述的步驟通過(guò)FACS檢測(cè)，除了結(jié)合的人源化抗體用PE標(biāo)記的羊抗人IgG抗體檢測(cè)。HuABC2和ABC2表現(xiàn)出相同的與這18個(gè)⑶122突變體結(jié)合的模式。同樣，HuABClOl 與這些⑶122突變體的結(jié)合模式跟ABC101相同。人⑶122的Dl和D2結(jié)構(gòu)域的29個(gè)其他的單取代氨基酸突變體，實(shí)質(zhì)上并不能降低HuABC2或HuABClOl與⑶122的結(jié)合。人⑶122上位于42、43、65和133的氨基酸殘基，其發(fā)送IL-2和IL-15介導(dǎo)的信號(hào)的功能重要性用如下方法測(cè)量。全長(zhǎng)⑶122(SEQ ID NO 73)的表達(dá)載體，其之前在實(shí)施例2 中用于產(chǎn)生TF-I β細(xì)胞，在位點(diǎn)42、43、65和133接受定點(diǎn)突變。產(chǎn)生的突變⑶122基因 (被指定為 F-R42A(SEQ ID NO :74)，F(xiàn)-R43A (SEQ ID NO :75)，F(xiàn)-G65T (SEQ ID NO 76)和 F-Hl33A(SEQ ID NO 77)(圖20))攜帶了單氨基酸突變分別為，位置42的精氨酸到丙氨酸、43位的精氨酸到丙氨酸、65位的甘氨酸到蘇氨酸及133位的組氨酸到丙氨酸。如實(shí)施例2所描述的，TF-I穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子隨著這4個(gè)突變的⑶122基因每一個(gè)產(chǎn)生。當(dāng)含有10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時(shí)，TF-I在2ng/ml GM-CSF的存在下健康增長(zhǎng)，在無(wú)GM-CSF時(shí)不生長(zhǎng)。TF-I在存在200ng/ml IL-2或10ng/ml of IL-15/ IL-15Ra復(fù)合物(scIL-15/IL_15Ra ;—種可溶性的復(fù)合物人IL-15結(jié)合于人IL-15Ra 胞外域的一部分)時(shí)也不生長(zhǎng)。TF-Ιβ，其可表達(dá)中度或高親和力的IL-2/IL-15受體，其在GM-CSF、IL-2或IL-15/IL-15Ra復(fù)合物的存在下健康生長(zhǎng)。表達(dá)人CD122的F-R42A、 F-G65T或F-H133A突變體的TF-I細(xì)胞，在IL-2或IL-15/IL-15R α復(fù)合物的存在下失去生長(zhǎng)能力，而在GM-CSF存在下具有生長(zhǎng)能力。表達(dá)F-R43A突變體的TF-I細(xì)胞在IL_2、IL-15/ IL15Ra復(fù)合物或GM-CSF存在下具有生長(zhǎng)能力。SEQ ID N0S.和序列對(duì)應(yīng)表 SEQ ID NO 1 ABC2 VH cDNA 序列ATGAAGTTGTGGTTAAACTGGGTTTTTCTTTTAACACTTTTACATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGTCTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAATGCCCTGAGAGCTGAGGACACTGCCATTTATTACTGTGCAAGATCCTACTATAGGTACGACGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO 2ABC2 VH氨基酸序列MKLWLNWVFLLTLLHGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 3ABC2 VL cDNA 序列ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAGTGTCCAGAGGACAAGTTGTTCTCACCCAGTCTCCAGTAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCATCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGTTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGcCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATACTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAASEQ ID NO 4ABC2 VL氨基酸序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGQVVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSAISSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQffNTYPYTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 5ABClOl VH cDNA 序列ATGAGAGTGTTGATTCTTGTGTACCTGTTGACAGTCCTTCCTGGTATACTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAGCCTTCTCAGACAGTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCTATCACTAATGATAATCACTGGTGGAACTGGATCCGGCAGGTTTCAGGAAGCAAACTGGAGTGGATGGGGTACATAGACTCCAGTGGTAGTTCTGACAACAATCCATCTCTCAAAAGTCAAATCTCCATCACTAGAGACACTTCCAAGAACCAGTTATTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAAGATATAGGCACATATTACTGTGCAAGAGGCGGTGGTAGGGATTACTATGGCATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO 6 ABClOl VH氨基酸序列MRVLILVYLLTVLPGILSDVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVTGYSITNDNHWffNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTSVTVSSSEQ ID NO 7ABClOl VL cDNA 序列ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTAGCTATAGTTATGTTCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGACATTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAASEQ ID NO 8ABClOl VL氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYS YVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATY YCQHSffDIPFTFGGGTKLEIK SEQ ID NO 9人源化ABC2 (HuABC2) VH基因的核苷酸序列ACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGTTGAACTGGGTTTTTCTTTTGACACTTTTGCATGGAATCCAGTGTGAAGTGCAGCTCGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTTCAGCCTGGGGGATCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGTCTCCAGAGACGATTCCAAGAACTCACTCTACCTTCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCAAGATCCTACTATAGGTACGACGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGTTGGCTTTTTTAAGCTTSEQ ID NO 10人源化ABC2 (HuABC2) VH氨基酸序列MKLWLNWVFLLTLLHGIQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEW VRQAPGKGLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTE DTAVYYCARSYYRYDGMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO 11人源化ABC2 (HuABC2) VL基因的核苷酸序列GCTAGCACCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTGATCAGTGCCTCAGTCATCGTGTCCAGAGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCATCTCAAGTGTGAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGTGTCTGGAGTCCCTGCCCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCGACTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCCGTTTATTACTGCCAGCAGTGGAATACTTACCCCTACACCTTCGGAGGGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAGAATTCSEQ ID NO 12人源化ABC2 (HuABC2) VL氨基酸序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAISSVSYMY WYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVSGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQ QffNTYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO 13人源化ABClOl (HuABClOl) VH基因的核苷酸序列ACTAGTACCACCATGAGAGTGTTGATTCTTGTGTACCTGTTGACAGTCCTTCCTGGTATTCTGTCTCAGGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTCAGACACTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCTACTCTATCACTAATGATAATCACTGGTGGAACTGGATCCGGCAGCACCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGATGGGGTACATCGACTCCAGTGGTTCCTCTGACAACAATCCATCTCTCAAAAGTCAAATCACCATCTCAAGAGACACTTCCAAGAACCAGCTCTCCCTGAAGTTGAGCTCTGTGACTGCCGCCGATACAGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGCGGAGGCAGGGATTACTATGGCATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACCGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTCAAGCTTSEQ ID NO 14人源化ABClOl (HuABClOl) VH氨基酸序列MRVLILVYLLTVLPGILSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWffN WIRQHPGKGLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADT AVYYCARGGGRDYYGMDYffGQGTTVTVSS SEQ ID NO 15人源化ABClOl (HuABClOl) VL基因的核苷酸序列 GCTAGCACCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGG TTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGATGACACAGTCTCCTGACTCCTTAGGCGT ATCTCTGGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGCACA32TCTAGCTATAGTTATGTTCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGCGGCTCTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCAGTCTATTACTGTCAGCACAGTTGGGACATTCCCTTCACATTCGGACAGGGGACCAAACTCGAAATCAAACGTAAGTAGTCTTCTCAGAATTCSEQ ID NO 16人源化ABClOl (HuABClOl) VL氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSffDIPFTFGQGTKLEIKSEQ ID NO 17小鼠Y-13’ PCR引物GCCAGTGGATAGACAGATGGSEQ ID NO 18小鼠Y _2a 3’ PCR引物GCCAGTGGATAGACCGATGGSEQ ID NO 19小鼠Y-2b的3，PCR引物GCCAGTGGATAGACTGATGGSEQ ID NO 20小鼠κ的3’ PCR引物GATGGATACAGTTGGTGCAGCSEQ ID NO 21ABC2 VH信號(hào)肽序列MKLffLNWVFLLTLLHGIQCSEQ ID NO 22ABC2 VH CDRl氨基酸序列DFYMESEQ ID NO 23ABC2 VH CDR2氨基酸序列ASRNKANDYTTEYSASVKGSEQ ID NO 24ABC2 VH CDR3氨基酸序列SYYRYDGMDYSEQ ID NO 25成熟ABC2 VH氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARSYYRYDGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 26ABC2 VL信號(hào)肽序列MDFQVQIFSFLLISASVIVSRGSEQ ID NO 27ABC2 VL CDRl氨基酸序列SAISSVSYMYSEQ ID NO 28ABC2 VL CDR2氨基酸序列DTSNLVSSEQ ID NO 29ABC2 VL CDR3氨基酸序列QQWNTYPYTSEQ ID NO 30成熟ABC2 VL的氨基酸序列QVVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSAISSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLVSGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWNTYPYTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 31ABClOl VH信號(hào)肽序列MRVLILVYLLTVLPGILSSEQ ID NO 32ABClOl VH CDRl氨基酸序列NDNHWWNSEQ ID NO 33ABClOl VH CDR2氨基酸序列YIDSSGSSDNNPSLKSSEQ ID NO 34ABClOl VH CDR3氨基酸序列GGGRDYYGMDYSEQ ID NO 35成熟ABClOl VH的氨基酸序列DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVTGYSITNDNHWWNWIRQVSGSKLEWMGYIDSSGSSDNNPSLKSQISITRDTSKNQLFLQLNSVTIEDIGTYYCARGGGRDYYGMDYWGQGTSVTVSSSEQ ID NO 36ABClOl VL信號(hào)肽序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGSEQ ID NO 37ABClOl VL CDRl氨基酸序列 RASQSVSTSSYSYVHSEQ ID NO 38ABClOl VL CDR2氨基酸序列YASNLESSEQ ID NO 39ABClOl VL CDR3氨基酸序列QHSffDIPFTSEQ ID NO 40成熟ABClOl VL的氨基酸序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWDIPFTFGGGTKLEIKSEQ ID NO 41成熟HuABC2 VH的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAASRNKA NDYTTEYSASVKGRFIVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARSYYRYDGMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO 42成熟HuABC2 VL的氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAISSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLVS GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWNTYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO 43成熟HuABClOl VH的氨基酸序列QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITNDNHWWNWIRQHPGKGLEWMGYIDS SGSSDNNPSLKSQITISRDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGRDYYGMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO 44成熟HuABClOl VL的氨基酸序列DIVMTQSPDSLGVSLGERATINCRASQSVSTSSYSYVHWYQQKPGQPPKLLIKYA SNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSWDIPFTFGQGTKLEI KSEQ ID NO 45人DA430129cDNA編碼的成熟mature VH區(qū)的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMDWVRQAPVKGLEWVGRTRDKANSYTTEYAASVKGRFTVSRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRGGAAMARGYQDGLDVffGQGTTVTVSSSEQ ID NO 46人M29469cDNA編碼的成熟VL區(qū)的氨基酸序列 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNKA TGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSKWPLTFGGGTKVEIKSEQ ID NO 47人DA936142 cDNA編碼的成熟VH區(qū)的氨基酸序列QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIDNTGFYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARDWGNSWDRGMDVffGQGTTVTVSSSEQ ID NO 48人Z46622cDNA編碼的成熟VL區(qū)的氨基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPSYTFGQGTK LEIKSEQ ID NO 49人⑶122 Dl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFSEQ ID NO 50人⑶122 D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列ENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAP LLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALG KDTSEQ ID NO 51小鼠CD122 Dl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFSEQ ID NO 52小鼠CD122 D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列DNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSHYIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTRPADPMKEISEQ ID NO 53攜帶FLAG多肽和GPI錨定信號(hào)的區(qū)域的氨基酸序列 TGGGDYKDDDDKGGGPNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT SEQ ID NO 54人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 55人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域W38K突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAKPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 56人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域P39S突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWSDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 57人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域D40A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPARRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 58人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R41A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDARRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 59人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R42A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRARWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 60人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域R43A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRAWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 61人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域W44A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRANQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 62人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域L64A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLIAGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 63人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域G65A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILAAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 64人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域G65T突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILTAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 65人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域A66S突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGSPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 66人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域S69A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDAQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 67人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Q70A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSAKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 68人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Q70K突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSKKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 69人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域K71A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQALTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 70人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域S132A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQAAHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 71人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域H133A突變體的氨基酸序列 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASAYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT SEQ ID NO 72人⑶122 Dl和D2結(jié)構(gòu)域Y134A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHAFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTSEQ ID NO 73全長(zhǎng)人CD 122氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGH LLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQ KWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLT SCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPL SGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRD WDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV SEQ ID NO 74全長(zhǎng)人⑶122的F-R42A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRARWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 75全長(zhǎng)人⑶122的F-R43A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRAWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 76全長(zhǎng)人⑶122的F-G65T突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILTAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISffEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPT PGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVS FPffSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVSEQ ID NO 77全長(zhǎng)人⑶122的F-Hl33A突變體的氨基酸序列AVNGTSQFTCFYNSRANISC VWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQ ASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPI SLQVVHVETHRCNISffEISQASAYFERHLEFEARTLSPGHTffEEAPLLTLKQKQE WICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPffSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGH LLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHG⑶VQ KWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLT SCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPL SGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRD WDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGE FRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合CD122并且能阻止IL-2和IL-15與含有⑶122和⑶132的受體結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基42、43和/或133替換為丙氨酸和/或殘基65替換為蘇氨酸和/或殘基70替換為賴氨酸所阻止，殘基編號(hào)如SEQ ID NO:73中所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基42和/或43替換為丙氨酸和/或殘基65替換為蘇氨酸所阻止，殘基編號(hào)如SEQ ID NO: 73中所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合可以被CD122殘基65替換為蘇氨酸和/或殘基70替換為賴氨酸和/或殘基133替換為丙氨酸所阻止，殘基編號(hào)如SEQID NO:73中所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含殘基42的抗原表位，殘基編號(hào)如SEQ ID NO:73中所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含殘基65的抗原表位，殘基編號(hào)如SEQ ID NO:73中所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:7中殘基133的⑶122的抗原表位。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基42、43、65、70和/或133的CD 122的抗原表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基42、43和65的⑶122的抗原表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合包含SEQID NO:73中殘基65、70和133的CD 122的抗原表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合位于SEQID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I中的⑶122的抗原表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特異性結(jié)合位于SEQID NO:73序列的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域I和2中的⑶122的抗原表位。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其與CD122的結(jié)合在檢測(cè)上不被SEQID NO:73中殘基39或41替換為丙氨酸時(shí)所阻止。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止IL-2與包含⑶122、⑶132和⑶25的受體結(jié)合。
15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止反式結(jié)合于IL-15Ra的IL-15或它的片段與包含⑶122和⑶132的受體結(jié)合。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其阻止IL-15與包含⑶122、⑶132和IL-15RQ的受體結(jié)合。
17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其中，當(dāng)所述抗體相對(duì)于IL-2或IL-15呈現(xiàn)為不大于100倍摩爾過(guò)量時(shí)，所述的結(jié)合的抑制至少是抑制30%。
18.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其與抗體ABC2競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合CD122且其特征在于SEQ ID NO :30的一個(gè)成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的一個(gè)成熟的重鏈可變區(qū)，或其與抗體ABClOl競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合⑶122且其特征在于SEQ ID NO 40的一個(gè)成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :35的一個(gè)成熟的重鏈可變區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其結(jié)合于與ABC2或ABClOl相同的CD122上的抗原表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其包含三個(gè)輕鏈⑶Rs和三個(gè)重鏈⑶Rs，其中每個(gè)CDR至少有90%的序列與源自ABC2(SEQ ID NOS :27-29輕鏈和22-24重鏈)或ABClOl(SEQ ID NOS:37-39輕鏈和32-34重鏈)的一個(gè)相應(yīng)CDR相同。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其包含ABC2或ABClOl的三個(gè)輕鏈⑶Rs和三個(gè)重鏈⑶Rs。
22.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其為嵌合的、人源化的、飾面的或人的。
23.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其具有人IgGlK同種型。
24.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的單克隆抗體，其是完整的抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其是單鏈抗體、Fab或Fab’2片段。
26.一種特異結(jié)合CD122的人源化的或嵌合的ABC2抗體，其中ABC2是小鼠抗體且該ABC2抗體特征在于SEQ ID NO :30的一個(gè)成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的一個(gè)成熟的重鏈可變區(qū)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其包含一條含有ABC2輕鏈(SEQID N0:30)三個(gè)CDRs的人源化的輕鏈，及一條含有ABC2重鏈(SEQ ID NO:25)三個(gè)CDRs的人源化的重鏈。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其包含一個(gè)與SEQID NO:42至少90%相同的人源化成熟輕鏈可變區(qū)，及一個(gè)與SEQ ID NO. 41至少90%氨基酸序列相同的人源化重鏈可變區(qū)。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其所提供的位點(diǎn)H28、H48、H49、H68、H93和L71，該位點(diǎn)通過(guò)Kabat編號(hào)，分別被殘基T、I、A、I、A和Y占據(jù)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的人源化抗體，其進(jìn)一步包括位點(diǎn)H42，該通過(guò)Kabat編號(hào)的位點(diǎn)被G占據(jù)。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的人源化抗體，其中所述的輕鏈CDRs是SEQID N0S. 27-29，所述的重鏈 CDRs 是 SEQ ID NOS :22-24ο
32.一種特異結(jié)合⑶122的人源化的或嵌合的ABClOl抗體，其中ABClOl的特征在于SEQ ID NO 40的一個(gè)成熟的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 35的一個(gè)成熟的重鏈可變區(qū)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其包含一條含有SEQIDN0:40三個(gè)⑶Rs的人源化的輕鏈，及一條含有SEQ ID NO: 35三個(gè)⑶Rs的人源化的重鏈。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其包含一個(gè)與SEQID N0:44至少90%相同的人源化成熟輕鏈可變區(qū)，及一個(gè)與SEQ ID NO. 43至少90%氨基酸序列相同的人源化重鏈可變區(qū)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其所提供的位點(diǎn)H27、H30、H48、H66、H67、H71和L49，該位點(diǎn)通過(guò)Kabat編號(hào)，分別被殘基Y、T、M、Q、I、R和K占據(jù)。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源化抗體，其中所述的輕鏈⑶Rs是SEQID N0S. 37-39且所述的重鏈CDRs是SEQ ID NOS. 32-34。
37.一種含有以上任一項(xiàng)權(quán)利要求定義的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
38.一種在患者體內(nèi)抑制不希望的免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用以上任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體的有效方案。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有自身免疫疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疾病是多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、牛皮癬、腹腔疾病或葡萄膜炎。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有哮喘或過(guò)敏。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有移植物抗宿主疾病。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述患者有宿主抗移植物疾病。
44.一種在患者體內(nèi)治療腫瘤的方法，包括給患者施用以上任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體的有效方案。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述腫瘤表達(dá)可檢測(cè)到的CD122。
46.一個(gè)SEQ ID NO :73中的不超過(guò)100個(gè)連續(xù)殘基的分離片段，包括43、65和133殘基中的一個(gè)或多個(gè)。
47.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID NO:73的殘基43和65。
48.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID N0:73的殘基65和133。
49.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其包含SEQID N0:73中的10個(gè)或更少的連續(xù)殘基。
50.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離的片段，其連接到一個(gè)載體，該載體可幫助誘發(fā)應(yīng)對(duì)所述片段的抗體的產(chǎn)生，并且/或者該載體作為一個(gè)組合物的組件與佐劑一起以幫助誘發(fā)應(yīng)對(duì)所述片段的抗體的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了異性結(jié)合CD122的單克隆抗體，而CD122是IL-2和IL-15受體的一個(gè)組成部分。通過(guò)抑制這些細(xì)胞因子與它們的受體結(jié)合，所述的單克隆抗體具有實(shí)質(zhì)上抑制IL-2和IL-15介導(dǎo)的功能的能力。所述的單克隆抗體可被用于抑制不希望發(fā)生的免疫應(yīng)答或治療腫瘤，以及其他。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102939305SQ201180018102
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者J.·云·曹, 鶴下直哉, 尼古拉斯·F.·蘭多爾菲, 尚卡爾·庫(kù)馬爾 申請(qǐng)人:Jn生物科學(xué)有限責(zé)任公司