專利名稱：化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的光敏劑和它們在分子的光化學(xué)內(nèi)在化和光動(dòng)力學(xué)療法中的用途。
本領(lǐng)域已知有許多光敏劑。在暴露于光之后，它們可能變成有毒的或者可能釋放毒性物質(zhì)，例如單態(tài)氧或其他氧化基團(tuán)，它們損害細(xì)胞物質(zhì)或生物分子，包括細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而這類細(xì)胞或膜損害可能最終殺死細(xì)胞。這些細(xì)胞毒性效果已經(jīng)用于治療多種異?；蚣膊?，包括腫瘤疾病。這類治療被稱為光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)，牽涉將光敏劑(光化學(xué)治療劑)用于肌體受影響的區(qū)域，繼之以暴露于活化光來活化光敏劑和使它們轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性形式，借此殺死受影響的細(xì)胞或者減少它們的增殖潛力。
最近，光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)已經(jīng)被提議作為一種向胞質(zhì)引入別的膜不透性分子的工具，以這樣一種方式使之未必導(dǎo)致細(xì)胞破壞或死亡。在這種被稱為″光化學(xué)內(nèi)在化″或PCI的方法中，將所要內(nèi)在化或者轉(zhuǎn)移的分子與感光劑聯(lián)合施用于細(xì)胞。細(xì)胞暴露于適當(dāng)波長的光，活化感光化合物，該化合物繼而引起胞內(nèi)分隔膜的破裂和隨后分子釋放至胞質(zhì)。
光敏劑可以通過多種機(jī)理直接或間接地發(fā)揮它們的作用。因而例如，某些光敏劑當(dāng)被光活化時(shí)直接變成有毒的，而其它生成一種毒性物，例如氧化劑如單態(tài)氧或氧-衍生的自由基，它們對細(xì)胞物質(zhì)和生物分子例如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸是極其有害的。
已知的光敏劑例如包括補(bǔ)骨脂素、卟啉、二氫卟酚和酞菁染料。卟啉光敏劑通過一種毒性氧的生成間接地起作用，被認(rèn)為是PDT的特別有利的候選者。卟啉是天然存在的合成血紅素的前體。特別是，當(dāng)鐵(Fe2+)在亞鐵螯合酶的作用下結(jié)合在原卟啉IX(PpIX)中時(shí)，產(chǎn)生血紅素。PpIX是極強(qiáng)的光敏劑，而血紅素沒有感光作用。
本領(lǐng)域已知有多種以卟啉為基礎(chǔ)的或者與卟啉有關(guān)的光敏劑，在文獻(xiàn)中有所描述。這類試劑的實(shí)例包括Photofrin，它們最近被批準(zhǔn)用作光敏劑，治療某些癌癥。不過，由于Photofrin必須是腸胃外給藥的(例如靜脈內(nèi))，其缺點(diǎn)是這會(huì)導(dǎo)致延長皮膚的光敏作用，可以持續(xù)幾個(gè)星期。由于Photofrin由卟啉的大寡聚體組成，當(dāng)局部施用時(shí)它也不容易穿透皮膚。其他以卟啉為基礎(chǔ)的光敏劑也存在相似的問題，例如所謂的″血卟啉衍生物″(HpD)，它們也有報(bào)道用在癌癥光化學(xué)療法中。
最近，磺化的中-四苯基卟啉(TPPSn)，例如二磺化的中-四苯基卟吩TPPS2a和TPPS2o，和四磺化的中-四苯基卟吩TPPS4，已被研究用作感光劑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其相對于HpD和Photofrin而言具備一些重要的優(yōu)點(diǎn)。特別是它們的腫瘤正常組織比高，因此考慮用在光化學(xué)療法中(Peng et al.，Cancer Lett.361-10，1987；Evensen et al.，Photodynamic therapy of tumorsand other diseases(Ed.G.Jori and C.Perria)，p.215-219，Libreria ProngettoPubl.Padova；and Winkelman，Cancer Res.22589-596，1962)。TPPS2a最近也被發(fā)現(xiàn)適合于用作高分子光化學(xué)內(nèi)在化的光敏劑(Berg et al.，CancerRes.591180-1183，1999；Hgset et al.，Hum.Gene Ther.11869-880，2000；and Selbo et al.，Int.J.Cancer 87853-859，2000)。
不過，在臨床使用TPPS2a中的主要缺點(diǎn)是它的紅光吸收低。事實(shí)上，所有已知卟啉衍生物的臨床應(yīng)用的主要限制是它們所響應(yīng)的光的最長波長具有相對低的吸收，位于約620-630nm。在這樣的波長下，光僅能穿透活組織內(nèi)很短的距離，所以不能到達(dá)深部的細(xì)胞或組織，例如腫瘤細(xì)胞。因此需要找到可供替代的四吡咯化合物，它們?nèi)匀痪邆湟阎赃策鵀榛A(chǔ)的光敏劑的有利性質(zhì)，還在更長的波長下表現(xiàn)更高的吸收，在那里組織的穿透性更大。
本發(fā)明致力于滿足這種需求，特別是致力于提供光敏效果強(qiáng)于現(xiàn)有技術(shù)所述以卟啉為基礎(chǔ)的化合物的試劑。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，磺化的中-四苯基卟啉(例如二磺化的中-四苯基卟啉)的卟啉大環(huán)中一個(gè)雙鍵的還原所得化合物驚人地具有高的光敏性質(zhì)。特別是與對應(yīng)的卟啉相比，這類化合物具有高的光譜性質(zhì)，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對暴露于紅光的消光系數(shù)表現(xiàn)出意外的增加，例如對波長范圍在630至680nm的光。這類化合物因而被視為不僅特別適合于常規(guī)的光動(dòng)力學(xué)療法，而且特別適合用于大分子的光化學(xué)內(nèi)在化方法。
從一方面來看，本發(fā)明因而提供一種光敏劑，它包含磺化的中-四苯基二氫卟酚，例如二磺化的中-四苯基二氫卟酚，或其藥學(xué)上可接受的鹽。在這類化合物中，至少一個(gè)四苯基環(huán)通常將攜帶1、2或3個(gè)、優(yōu)選1個(gè)磺酸酯基。本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括其中兩個(gè)苯基環(huán)各自被單一磺酸酯基取代的那些。
從另一方面來看，本發(fā)明提供一種光敏劑，可通過還原磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環(huán)中一個(gè)雙鍵而得，特別是可通過還原二磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環(huán)例如TPPS2a中一個(gè)雙鍵而得。這類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
根據(jù)本發(fā)明的光敏劑的實(shí)例包括式I化合物 (其中X是-SO3H；n、p、q和r各自獨(dú)立地是0或1；和n、p、q和r之和是1至4的整數(shù)，優(yōu)選為至少2，例如2或4)和其藥學(xué)上可接受的鹽。
式I化合物的異構(gòu)形式也被視為構(gòu)成本發(fā)明的一部分，例如其中被還原的雙鍵位于任意其余三個(gè)吡咯環(huán)之一。任何包含至少一種式I化合物或其異構(gòu)體的異構(gòu)體混合物都被視為構(gòu)成本發(fā)明的一部分。特別適合用在本發(fā)明中的式I化合物異構(gòu)體的實(shí)例包括下列式Ia-Ic化合物
(其中X、n、p、q和r是如上所定義的)。
式I、Ia、Ib和Ic化合物中，任一n、p、q和r之一是1，這意味著存在單一的磺酸酯基與苯基環(huán)連接在任意的環(huán)位置(也就是鄰-、間-或?qū)?)。在存在一個(gè)以上磺酸酯基的情況下，它們可以存在于每個(gè)苯基環(huán)內(nèi)相同或不同的環(huán)位置。優(yōu)選地，它們將存在于相同的環(huán)位置，最優(yōu)選為間位或?qū)ξ?。若任一n、p、q和r是零，則這意味著不存在任何環(huán)取代基，也就是未取代的苯基。
特別優(yōu)選的式I、Ia、Ib和Ic化合物是其中n、p、q和r之和是2的那些。最優(yōu)選這樣的化合物，其中取代的苯基環(huán)是彼此相鄰的，例如與還原的吡咯環(huán)相鄰，也就是式I化合物中n＝0、p＝0、q＝1和r＝1。另外優(yōu)選的式I、Ia、Ib和Ic化合物包括，其中n、p、q和r之和是2，并且取代的苯基環(huán)是彼此相對的那些，例如其中n＝0、p＝1、q＝0和r＝1的式I化合物。
在每個(gè)苯基環(huán)中，磺化的基團(tuán)X可以獨(dú)立地存在于鄰位、間位或?qū)ξ弧Ｋ鼘?yōu)選地存在于間位或?qū)ξ?，最?yōu)選對位。按照本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括式II化合物 式II化合物的異構(gòu)形式也被視為構(gòu)成本發(fā)明的一部分，例如其中被還原的雙鍵位于其余三個(gè)吡咯環(huán)的任一個(gè)。包含至少一種式II化合物或其異構(gòu)體的任何異構(gòu)體混合物都被視為構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
特別優(yōu)選的式II化合物是，其中兩個(gè)取代的苯基環(huán)與被還原的雙鍵相鄰。
本發(fā)明的化合物可以利用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法和工藝加以制備。最適宜地，可以借助對應(yīng)的卟啉的還原作用加以制備。
本發(fā)明在進(jìn)一步的方面因而提供制備本發(fā)明化合物的方法，所述方法包含至少一個(gè)下列步驟(a)還原磺化的四苯基卟啉或其鐵螯合物，例如還原式III四苯基卟啉
或其鐵螯合物(其中X、n、p、q和r是如上所定義的)；(b)如果需要的話，借助常規(guī)的分離技術(shù)分離步驟(a)所生成的化合物的混合物；和(c)轉(zhuǎn)化步驟(a)或步驟(b)所生成的化合物、例如式I化合物為其藥學(xué)上可接受的鹽。
步驟(a)中，用作原料的卟啉化合物是商業(yè)上可得到的，或者可以利用本領(lǐng)域已知的方法獲得?；腔倪策?、例如包括TPPS2a(二磺化的四苯基卟吩)，是可從Porphyrin Products，Logan，UT，USA得到的。
步驟(a)中式III卟啉化合物向?qū)?yīng)的二氫卟酚的化學(xué)轉(zhuǎn)化是可以按若干不同的方式在化學(xué)上實(shí)現(xiàn)，例如使用對-甲苯磺酰肼在游離堿卟啉的還原中作為二酰亞胺前體(例如參見Whitlock et a1.，J.Am.Chem.Soc.917485-7489，1969)。作為替代選擇，所需二氫卟酚的制備可以這樣進(jìn)行，例如使用鈉在沸騰的異戊醇中還原對應(yīng)的鐵-卟啉(Eisner，J.Chem.Soc.3461-3469，1957；and Eisner et al.，J.Chem.Soc.733-739，1957)。
特別優(yōu)選用在本發(fā)明化合物制備中的是卟啉的光化學(xué)還原，可任選在叔胺堿的存在下進(jìn)行。例如，在胺的存在下，尤其是叔胺，游離堿卟啉可以被光還原為二氫卟酚(例如參見Harel et al.Photochem.Photobiol.23337-341，1976)。
在二酰亞胺的存在下還原卟啉分子可以通過還原卟啉大環(huán)中的兩個(gè)雙鍵而誘導(dǎo)菌綠素的生成。使用一種胺、特別優(yōu)選叔胺的光還原過程因此優(yōu)選用在本發(fā)明所需二氫卟酚化合物的制備中。適合用在這樣一種方法中的叔胺的實(shí)例包括三乙胺(TEA)、N-甲基吡咯烷酮、三正丁胺、三辛胺等，還原作用一般將在可見光的存在下進(jìn)行(例如光還原作用)。
卟啉的光化學(xué)還原可以這樣適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，在溶劑或溶劑混合物中，例如苯、吡啶、二甲基亞砜等，在10至30℃范圍的溫度下，優(yōu)選在環(huán)境溫度下(例如20至25℃，尤其是22℃)進(jìn)行還原。
光還原作用可以利用可見范圍的光進(jìn)行，例如波長在400至640nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選500至640nm，例如約545±15nm。照射的劑量水平一般適用1至50W/m2，例如約15W/m2，時(shí)間在1至90分鐘的范圍內(nèi)，例如5至40分鐘。通過限制卟啉大環(huán)暴露于光的時(shí)間，可以減少任何不需要的菌綠素的生成。卟啉的照射方法是本領(lǐng)域熟知的，例如利用燈或激光。在這一點(diǎn)上特別適合的是高壓氙燈或碘鎢燈，例如可從Philips得到的那些。通常，反應(yīng)是在厭氧條件下進(jìn)行的，例如可以在暴露于光之前并任選地在暴露于光期間將原料與溶劑的混合物用氮飽和。
本發(fā)明的化合物可以以異構(gòu)體混合物的形式存在，并且可以以這種形式使用。如果需要的話，可以借助本領(lǐng)域已知的方法，例如色譜法和/或分級結(jié)晶法，根據(jù)它們的物理/化學(xué)差異，將本發(fā)明的化合物例如式I那些分離為它們的異構(gòu)體。
如上所述，本發(fā)明的化合物可以采取藥學(xué)上可接受的鹽的形式。這類鹽優(yōu)選地是與生理學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)酸所生成的酸加成鹽。適合的酸例如包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、枸櫞酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸和抗壞血酸。例如借助沉淀法，還可以適宜地制備疏水性鹽。適當(dāng)?shù)柠}例如包括乙酸鹽、溴化物、氯化物、枸櫞酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、硬脂酸鹽、甲苯磺酸鹽、鈣鹽、葡甲胺鹽、鉀鹽和鈉鹽。成鹽工藝是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
如上所述，本發(fā)明的化合物和它們的鹽具有寶貴的藥理性質(zhì)，也就是光敏性質(zhì)，這使它們可用于大分子的光化學(xué)內(nèi)在化和用作光化學(xué)治療劑。
本發(fā)明在進(jìn)一方面因而提供藥物組合物，包含本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及至少一種藥物載體或賦形劑。
本發(fā)明在進(jìn)一方面提供用作藥物的本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，例如在光化學(xué)內(nèi)在化方法、光化學(xué)療法或診斷中用作光敏劑。
進(jìn)一方面提供本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用在光化學(xué)內(nèi)在化方法、光化學(xué)療法或診斷中，特別是用在治療響應(yīng)于光化學(xué)療法的肌體外或內(nèi)表面的疾病或異常的方法中。
本文所用的“內(nèi)在化”表示分子的胞質(zhì)釋放，包括分子從細(xì)胞內(nèi)/膜結(jié)合的腔室向細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)釋放的步驟。術(shù)語“細(xì)胞”在本文中用以包括所有真核細(xì)胞(包括昆蟲細(xì)胞和真菌細(xì)胞)。代表性的“細(xì)胞”因而包括所有類型的哺乳動(dòng)物與非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞和原生動(dòng)物。
向活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)引入分子的方法是有用的工具，可用于操縱和研究生物過程。令人感興趣的是這樣的方法，其中在內(nèi)在化之后細(xì)胞仍然是活的和/或有功能的。有人已經(jīng)提出光敏劑在以這樣一種方式向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)引入其他膜不透性分子中的用途，而不必導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞破壞或細(xì)胞死亡，例如WO96/07432和WO00/54802。在這種方法中，向細(xì)胞同時(shí)或者先后施用所要內(nèi)在化的分子和光敏化合物，此后，該光敏化合物和該分子被細(xì)胞吞入或者以其他方式被易位于核內(nèi)體、溶酶體或其他細(xì)胞內(nèi)受膜限制的腔室。所要易位于細(xì)胞內(nèi)腔室的分子和光敏化合物一起或先后施用于細(xì)胞，被細(xì)胞攝入細(xì)胞內(nèi)腔室。細(xì)胞暴露于適合波長的光后釋放細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)在化的分子，活化光敏化合物，繼而引起細(xì)胞內(nèi)腔室膜的破壞，和隨后分子向胞質(zhì)的釋放。這種方法被稱為“光化學(xué)內(nèi)在化”或PCI，其中細(xì)胞在暴露于光后借助光敏劑的作用從含有有關(guān)分子的細(xì)胞內(nèi)腔室釋放該分子。
因而本發(fā)明在進(jìn)一方面提供體外或體內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)引入分子(也就是轉(zhuǎn)移分子)的方法，所述方法包含使所述細(xì)胞與本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸；使所述細(xì)胞與所要引入的分子接觸；以及將所述細(xì)胞用活化該光敏劑有效的波長的光進(jìn)行照射，例如波長在300-800nm范圍內(nèi)的光。
精確計(jì)時(shí)加入所要轉(zhuǎn)移的分子(也就是轉(zhuǎn)移分子)和光敏劑的時(shí)間和達(dá)到上述效果的照射時(shí)間需要考慮多種因素，包括所要處理的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移分子的屬性、細(xì)胞的環(huán)境、該方法是體外還是體內(nèi)進(jìn)行的、和給藥是直接到靶組織還是到遠(yuǎn)程部位。考慮這些因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)。通常，將在照射之前加入轉(zhuǎn)移分子和光敏劑。例如，照射之前1至72小時(shí)，優(yōu)選4至48小時(shí)，例如照射之前4至24小時(shí)，可以將它們同時(shí)或單獨(dú)施用。
在某些情況下，轉(zhuǎn)移分子將與光敏劑同時(shí)給藥。因而本發(fā)明在進(jìn)一方面提供一種藥物組合物，包含本文所述光敏劑與轉(zhuǎn)移分子一起。還可以另外含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明在進(jìn)一方面提供用在治療中的藥物組合物，包含本文所述光敏劑與轉(zhuǎn)移分子一起，例如用在癌癥或基因療法中。
本發(fā)明在進(jìn)一方面提供本文所述光敏劑和/或轉(zhuǎn)移分子在藥物制備中的用途，該藥物用在治療中，例如癌癥或基因治療，其中使所述光敏劑和所述轉(zhuǎn)移分子(單獨(dú)、同時(shí)或先后)與患者的細(xì)胞或組織接觸，將所述細(xì)胞或組織用波長有效活化所述光敏劑的光照射。包含這類方法的治療方法構(gòu)成本發(fā)明的進(jìn)一方面。
本發(fā)明的光敏劑因而可以用于體外(也就是在培養(yǎng)物中)或體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或者轉(zhuǎn)染到任何分子至活細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。它們不僅可以用于轉(zhuǎn)移分子(或其部分或片段)至細(xì)胞內(nèi)部，而且在某些情形中用于在細(xì)胞表面上呈遞或者表達(dá)它們。因而，在轉(zhuǎn)移分子向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放之后，如果有關(guān)細(xì)胞是特異化細(xì)胞，例如抗原呈遞細(xì)胞，那么該分子或片段可以轉(zhuǎn)運(yùn)至該細(xì)胞表面，在那里它可以被呈遞在細(xì)胞外部，也就是細(xì)胞表面上。這類方法在疫苗接種領(lǐng)域具有特別的實(shí)用性，其中可以向細(xì)胞內(nèi)引入疫苗組分，也就是抗原或免疫原，用于呈遞在該細(xì)胞的表面上，目的是誘導(dǎo)、促進(jìn)或增加免疫應(yīng)答。WO00/54802描述了關(guān)于能夠在細(xì)胞表面上表達(dá)分子的實(shí)用性的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。
可以利用本發(fā)明光敏劑而引入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)移分子包括不易穿透細(xì)胞膜的分子。另外，本文所述的試劑能夠增加僅能部分穿透細(xì)胞膜或胞吞小泡膜的分子的胞質(zhì)釋放和活性。轉(zhuǎn)移分子可以是有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，例如肽、抗體或抗原或者它們的片段。另一類可以利用本發(fā)明試劑引入的轉(zhuǎn)移分子是細(xì)胞毒性藥物，例如蛋白質(zhì)毒素或細(xì)胞毒性有機(jī)化合物。利用本文所述的方法，能夠?qū)⒖赡芫哂信R床癌癥治療價(jià)值但是受胞質(zhì)攝取低或者沒有攝取而限制分子引入到胞質(zhì)內(nèi)，并且定向于特定細(xì)胞。核糖體失活蛋白是這樣一種分子的實(shí)例。
根據(jù)轉(zhuǎn)移分子的屬性，本文所述的方法可以用于治療多種病癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化與其他心血管疾病、病毒與其他感染、牛皮癬、光化性角化病、傷口愈合、骨折愈合、疣和遺傳性病癥，例如囊性纖維變性、戈林氏綜合征和運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥。
另一類適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移分子是核酸?？梢允褂煤怂岬幕蛐问剑缇幋a治療性蛋白質(zhì)、反義RNA分子、核酶、RNA適體或構(gòu)成寡核苷酸的三鏈體?；蛘撸梢圆捎梅蔷幋a分子形式的核酸，例如合成的DNA或RNA反義分子、核酶、適體、構(gòu)成寡核苷酸的三鏈體、肽核酸(PNA)、轉(zhuǎn)錄因子“decoy”DNA或嵌合寡核苷酸，用于修復(fù)患者的特異性突變。在適當(dāng)時(shí)核酸分子可以是全基因或核酸片段的形式，可選地?fù)饺氲捷d體分子中，例如質(zhì)粒載體。后者的形式在轉(zhuǎn)移分子用在基因療法中時(shí)具有特別的應(yīng)用性，其中基因被治療性地轉(zhuǎn)移至患者細(xì)胞。這可以用于治療很多疾病，例如癌癥、心血管疾病、病毒感染和單基因病癥，例如囊性纖維變性。
任選地可以將光敏劑和轉(zhuǎn)移分子之一或二者連接于或締合于或共軛于載體分子、定向分子或載體，這能夠促進(jìn)或增加光敏劑或轉(zhuǎn)移分子的攝取或者能夠定向或釋放這些實(shí)體至特定的細(xì)胞類型、組織或細(xì)胞內(nèi)腔室。載體系統(tǒng)的實(shí)例包括聚賴氨酸或其他聚陽離子、硫酸葡聚糖、不同的陽離子型脂質(zhì)、脂質(zhì)體、再生的LDL-粒子或空間穩(wěn)定化的脂質(zhì)體。這些載體系統(tǒng)一般能夠改善轉(zhuǎn)移分子和/或光敏劑的藥動(dòng)學(xué)并增加細(xì)胞攝取，還可以定向轉(zhuǎn)移分子和/或光敏劑于細(xì)胞內(nèi)腔室，這尤其有益于獲得光化學(xué)內(nèi)在化，但是它們一般不具有定向轉(zhuǎn)移分子和/或光敏劑于特定細(xì)胞(例如癌癥細(xì)胞)或組織的能力。不過，為了實(shí)現(xiàn)這類特異性或選擇性定向載體分子，可以將轉(zhuǎn)移分子和/或光敏劑締合于、鍵合于或共軛于特異性定向分子，這將促進(jìn)轉(zhuǎn)移分子向所需細(xì)胞或組織內(nèi)的特異性細(xì)胞攝取。這類定向分子還可以定向?qū)⒎肿愚D(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)腔室，這尤其有益于獲得光化學(xué)內(nèi)在化。
可以采用很多不同的定向分子，例如Curiel，D.T.(1999)，Ann.NewYork Acad.Sci.886，158-171；Bilbao，G.et al.(1998)，in Gene Therapy ofCancer(Walden et al.，eds.，Plenum Press，New York)，Peng K.W.andRussell S.J.(1999)，Curr.Opin.Biotechnol.10，454-457，Wickham T.J.(2000)，Gene Ther.7，110-114所述。
可以將載體分子和/或定向分子締合于、鍵合于或共軛于轉(zhuǎn)移分子、光敏劑或這二者，并且可以使用相同或不同的載體或定向分子。這類定向分子或載體還可以用于使轉(zhuǎn)移分子定向于特定的細(xì)胞內(nèi)腔室，這尤其有益于采用PCI例如溶酶體或核內(nèi)體。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的光敏劑還可以用在光動(dòng)力學(xué)療法、特定的光化學(xué)療法或診斷中。這類方法在專利和科技文獻(xiàn)中都有詳盡記載，例如WO96/28412和98/30242。
當(dāng)在PDT中使用光敏劑時(shí)，可以治療的疾病和異常包括任何對光化學(xué)療法有反應(yīng)的惡性、惡性前與非惡性的疾病或異常，例如腫瘤或其他生長，皮膚疾病，例如牛皮癬和光化性角化病與痤瘡、皮膚磨損，和其他疾病或感染，例如細(xì)菌、病毒或真菌感染，例如皰疹病毒感染。
可以利用本發(fā)明化合物治療的內(nèi)部與外部肌體表面包括皮膚和所有其他上皮與漿膜表面，例如包括粘膜、器官(例如呼吸道、胃腸道和生殖泌尿道)的內(nèi)襯和帶有向這類表面排空的導(dǎo)管的腺體(例如肝、毛囊與皮脂腺、乳腺、唾液腺和精囊)。除了皮膚以外，這類表面例如包括陰道、子宮內(nèi)膜和泌尿道上皮的內(nèi)襯。這類表面還可以包括在切除患病或癌性組織之后(例如在腫瘤切除后的腦腔如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)所形成的體腔。
示范性表面因而包括(i)皮膚和結(jié)膜；(ii)口腔、咽、食管、胃、腸與腸附件、直腸和肛管的內(nèi)襯；(iii)鼻通道、鼻竇、鼻咽、氣管、支氣管和細(xì)支氣管的內(nèi)襯；(iv)輸尿管、膀胱和尿道的內(nèi)襯；(v)陰道、子宮頸和子宮的內(nèi)襯；(vi)胸膜壁層和胸膜臟層；(vii)腹膜和盆腔的內(nèi)襯，和這些腔內(nèi)所含有的器官的表面；(viii)硬腦脊膜和腦脊膜；(ix)光活化光能夠接近的實(shí)體組織中的任何腫瘤，例如在手術(shù)時(shí)直接方式或者經(jīng)由通過針頭插入的光導(dǎo)纖維。
按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，可以利用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑按常規(guī)方式配制本發(fā)明的組合物?？梢愿鶕?jù)給藥的選擇與所需途徑、治療目的等按慣用方式選擇組合物與載體或賦形劑材料的屬性、劑量等。劑量同樣可以按慣用方式加以確定，并且可以依賴于轉(zhuǎn)移分子(若存在的話)的屬性、治療的目的、患者的年齡、給藥的方式等。
組合物可以被局部、口服或全身給藥。就在PDT中的用途而言，局部給藥的組合物是優(yōu)選的，該組合物包括凝膠劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、噴霧劑、洗劑、油膏劑、藥棒、藥皂、粉劑、陰道環(huán)、氣霧劑、滴劑、溶液劑和本領(lǐng)域任何其他常規(guī)的藥物劑型。對不可接近部位的局部給藥可以借助本領(lǐng)域已知的技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)，例如利用導(dǎo)管或其他適當(dāng)?shù)乃幬镝尫畔到y(tǒng)。
或者，組合物可以做成適合于口服或腸胃外給藥的形式，例如皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。另外一些藥物劑型因而包括普通或包衣片劑、膠囊劑、混懸劑和溶液劑，其中含有活性組分，可選地與一種或多種惰性常規(guī)載體和/或稀釋劑一起。
如上所述化合物在組合物中的濃度依賴于化合物的預(yù)期用途、組合物的屬性、給藥的方式、所要治療的病癥和患者，可以根據(jù)選擇加以改變或調(diào)整。不過一般就在PDT中的用途而言，光敏劑的濃度范圍可以在0.01至50％的范圍內(nèi)，例如0.05至20％，例如1-10％，按重量計(jì)。就在PCI中的用途而言，重要的是光敏劑的濃度是這樣的，一旦被細(xì)胞攝取，例如進(jìn)入或者締合于一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)腔室，并且被照射活化，則一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，例如一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)腔室被溶解或破壞。例如，可以按10至50μg/ml的濃度使用光敏劑。就體外使用而言，該范圍可以更寬得多，例如0.05-500μg/ml。就人體內(nèi)用而言，當(dāng)全身給藥時(shí)，可以在0.05-20mg/kg體重的范圍內(nèi)使用光敏劑，或者用于局部用藥使用0.1-20％的溶液。當(dāng)在PCI中使用本文所述化合物時(shí)，用光敏劑培育細(xì)胞的時(shí)間(也就是“接觸”時(shí)間)可以從幾分鐘至若干小時(shí)不等，例如甚至長達(dá)48小時(shí)或更長。培育時(shí)間應(yīng)當(dāng)是這樣的，以便光敏劑被適當(dāng)?shù)募?xì)胞攝取。用光敏劑培育細(xì)胞可以任選地繼之以用無光敏劑培養(yǎng)基培育一段時(shí)間，然后使細(xì)胞暴露于光和/或加入轉(zhuǎn)移分子。
確定本發(fā)明用的靶分子的合適劑量對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)實(shí)踐。若轉(zhuǎn)移分子是蛋白質(zhì)或肽，就體外應(yīng)用而言，一般將使用劑量小于5mg/ml(例如0.1-5mg/ml)的轉(zhuǎn)移分子，就體內(nèi)應(yīng)用而言，一般將使用劑量小于5mg/kg(例如0.1-5mg/kg)的轉(zhuǎn)移分子。若轉(zhuǎn)移分子是核酸，就體外應(yīng)用而言，轉(zhuǎn)移分子的示范劑量將是大約0.1-50μg核酸每104個(gè)細(xì)胞，就體內(nèi)應(yīng)用而言為大約10-6-1g核酸每次注射于人。
在本文所述化合物或組合物的給藥(例如對肌體表面)之后，使所治療的區(qū)域暴露于光，以達(dá)到所需效果，例如光化學(xué)內(nèi)在化或光化學(xué)治療效果?；罨饷魟┑墓庹丈洳襟E可以按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和工藝加以進(jìn)行。能夠提供所需波長和光強(qiáng)度適合的光源是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明的方法中肌體表面或細(xì)胞暴露于光的時(shí)間可以各不相同。例如，在PCI中，轉(zhuǎn)移分子內(nèi)在化至胞質(zhì)內(nèi)的效率似乎隨著暴露于光的時(shí)間增加而增加。一般而言，照射步驟的時(shí)間長度為幾分鐘至若干小時(shí)，例如優(yōu)選至多60分鐘，例如1至30分鐘，例如0.5至3分鐘或1至5分鐘，或者1至10分鐘，例如3至7分鐘，優(yōu)選大約3分鐘，例如2.5至3.5分鐘。適當(dāng)?shù)墓鈩┝靠梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員加以選擇，將依賴于蓄積在靶細(xì)胞或組織中的光敏劑的量。照射一般將按40至200焦耳/cm2的劑量水平施用，例如100焦耳/cm2，能流范圍小于200mW/cm2。在本文所述方法中，用波長在500-750nm、例如550至700nm范圍內(nèi)的光照射特別適合于體內(nèi)使用。
本發(fā)明在進(jìn)一步方面因而提供外部或內(nèi)部肌體表面疾病或異常的治療方法，所述方法包含對受影響的表面給以本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，使所述表面暴露于光，優(yōu)選光的波長范圍為300-800nm，例如500-700nm。
肌體不同部位的照射方法是本領(lǐng)域熟知的，例如用燈或激光(例如參見Van den Bergh，Chemistry in Britain，May 1986 p.430-439)。就不可接近的區(qū)域而言，利用光導(dǎo)纖維易于實(shí)現(xiàn)。
可以將本發(fā)明化合物與其他光敏劑例如ALA或Photofrin，或者可以增強(qiáng)光化學(xué)治療效果的其他活性組分一起配制和/或給藥。例如，可以包括螯合劑與如氨基多元羧酸(例如EDTA)，目的是增強(qiáng)Pp的蓄積，從而增加光敏效果。螯合劑適宜按0.05至20％例如0.1至10％按重量計(jì)的濃度使用。
還可以使用表面滲透助劑，特別是二烷基亞砜例如二甲基亞砜(DMSO)，以增強(qiáng)光化學(xué)治療效果。適宜在0.2至50％例如約10％按重量計(jì)的濃度范圍內(nèi)提供表面滲透劑。
根據(jù)所治療的病癥和組合物的屬性，用在本發(fā)明中的化合物可以與這類其他任選用的試劑共同給藥，例如在單一的組合物中，或者它們可以先后或單獨(dú)給藥。實(shí)際上在很多情況下，在用在本發(fā)明中的化合物的給藥之前，在單獨(dú)的步驟中用表面滲透助劑預(yù)處理，可以獲得特別有益的光化學(xué)治療效果。
從另一方面來看，本發(fā)明因而提供一種產(chǎn)品，包含本文所述光敏劑例如式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及至少一種表面滲透助劑，任選地和一種或多種螯合劑，作為組合的制劑，同時(shí)、單獨(dú)或先后用于治療響應(yīng)于光化學(xué)療法的外部或內(nèi)部肌體表面的疾病或異常。
或者認(rèn)為，本發(fā)明在這方面還提供試劑盒，用在外部或內(nèi)部肌體表面疾病或異常的光化學(xué)療法中，該試劑盒包含
a)第一容器，含有本文所達(dá)光敏劑，例如式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽；b)第二容器，含有至少一種表面滲透助劑；和任選包含c)一種或多種螯合劑，包含在所述第一容器內(nèi)或第三容器中。
不言而喻，采用本文所述化合物的治療方法不可避免地牽涉所治療疾病或異常的熒光。這種熒光的強(qiáng)度可以用于消除異常的細(xì)胞，同時(shí)熒光的定位可以用于使該異?；蚣膊〉拇笮?、程度和情形可視化。
如此鑒別或確認(rèn)在研究部位的異?；蚣膊∪缓罂梢酝ㄟ^另一種的治療技術(shù)加以治療，例如手術(shù)或化學(xué)治療，或者借助本發(fā)明的治療方法，繼續(xù)構(gòu)建熒光或者進(jìn)一步施用本發(fā)明化合物于適當(dāng)?shù)牟课?。不言而喻，診斷技術(shù)可能要求可視化的熒光水平低于治療性處置。因而一般而言，0.2至30％、例如1-5％(w/w)的濃度范圍是適合的。在用于治療之前已經(jīng)考慮過給藥的部位、方法和方式，也可用于這里所述的診斷用途。
本發(fā)明的化合物還可以用于體外診斷技術(shù)，例如用于檢查包含在體液中的細(xì)胞。與非正常組織有關(guān)的熒光更高，可以是異常或疾病的指征。這種方法是非常靈敏的，可以用于清楚地檢測異?；蚣膊?，例如膀胱癌或肺癌，分別檢查尿樣或唾液樣本中的上皮細(xì)胞。除了尿和唾液以外，其他可以用于診斷的體液包括血液、精液、淚、脊髓液等。還可以評價(jià)組織樣本或制備物，例如活組織檢查的組織或骨髓樣本。本發(fā)明因而延及本發(fā)明化合物或其鹽按照上述光化學(xué)治療方法用于診斷的用途，和用于進(jìn)行所述診斷的產(chǎn)品和試劑盒。
本發(fā)明在另一方面涉及通過測定患者體液或組織樣本來體外診斷異?；蚣膊〉姆椒?，所述方法包含至少下列步驟i)混合所述體液或組織與本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，ii)使所述混合物暴露于光，例如波長在300-800nm范圍內(nèi)的光，iii)確定熒光的水平，和iv)比較熒光水平與對照物水平。
參照附圖，下列非限制性實(shí)施例將詳細(xì)描述本發(fā)明，圖中

圖1顯示在暴露于單色光不同時(shí)間階段之前和之后，在三乙胺(TEA)的苯溶液存在下的TPPS2a吸收光譜。
圖2顯示暴露光對TPPS2a的646-655nm峰最大光密度的影響。使含有TPPS2a的溶液在TEA的苯溶液的存在下暴露于單色光，并測量光密度。
圖3顯示TPPS2a暴露于光所生成的衍生物的HPLC色譜分析。使TPPS2a在TEA的苯溶液的存在下暴露于非單色光，借助反相HPLC評價(jià)熒光性衍生物的生成。使溶液暴露于光，分離樣本用于測量。
圖4顯示TPCS2a和用TPCS2a處理的V79細(xì)胞的細(xì)胞提取物的HPLC色譜分析。按照圖3暴光10分鐘后生成TPCS2a，將V79細(xì)胞用1μg/mlTPCS2a處理(a)。培育18小時(shí)后從細(xì)胞中提取TPCS2a，用HPLC評價(jià)(b)。峰保留時(shí)間標(biāo)于圖上。
圖5顯示用TPPS2a和TPCS2a處理的V79細(xì)胞的熒光顯微圖。將細(xì)胞用(a)1μgml TPPS2a或(b)1μg/ml TPCS2a培育18小時(shí)，繼之以在無致敏劑培養(yǎng)基中培育1小時(shí)，然后進(jìn)行顯微鏡評價(jià)。
圖6顯示V79細(xì)胞中β-AGA活性失活的能流-響應(yīng)曲線，使V79細(xì)胞暴露于1μg/ml TPCS2a達(dá)18小時(shí)，繼之以在無致敏劑培養(yǎng)基中培育1小時(shí)，然后暴露于紅光。
圖7顯示用TPPS2a和TPCS2a培育并且暴露于(a)紅光或(b)藍(lán)光的V79細(xì)胞的劑量-響應(yīng)曲線。將細(xì)胞用1或2μg/ml TPPS2a或1μg/ml TPCS2a培育18小時(shí)，繼之以在無致敏劑培養(yǎng)基中培育1小時(shí)，然后暴露于光。
圖8顯示V79細(xì)胞中在光化學(xué)與核糖體失活蛋白聯(lián)合處理后的蛋白質(zhì)合成。在沒有(實(shí)心圓)或有(空心圓)1μg/ml核糖體失活蛋白的存在下將細(xì)胞用1μg/ml TPCS2a處理，暴露于紅光。本圖和前圖中的線段顯示一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例材料和方法材料光敏劑TPPS2a由Porphyrin Products(Logan，UT，USA)提供。將TPPS2a的儲(chǔ)備溶液(2mg/ml)溶于DMSO，DMSO來自Sigma(St.Louis，MO，USA)。核糖體失活蛋白購自Sigma。毒素儲(chǔ)備溶液(2mg/ml)是這樣制備的，將核糖體失活蛋白粉末溶于PBS，pH8.5，保存在-20℃下備用。對-硝基苯基-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷購自Sigma(St.Louis，MO，USA)。
四苯基二氫卟酚二磺酸鹽，即TPCS2a，的制備基本上按照Harel等所述方法，從TPPS2a制備四苯基二氫卟酚二磺酸鹽(TPCS2a)(Photochem.Photobiol.23337-341，1976)。
制備950μl苯/三乙胺(TEA)(18∶7)、32μl二甲基亞砜(DMSO)與18μlTPPS2a(來自1mg/ml DMSO溶液)的混合物，并在1ml比色杯中用氮飽和5分鐘。然后使混合物暴露于來自500W高壓氙燈的光，該燈裝有Bauschand Lomb光柵單色儀。使比色杯按15W/m2暴露于545±15nm光。借助UDT 11A光檢測器和223放射濾波器監(jiān)測能流比率。借助Perkin-ElmerLambda 15UV/VIS分光光度計(jì)有規(guī)律地測量吸收光譜。光通過路徑為1cm。
為TPCS2a的大規(guī)模生產(chǎn)(用于細(xì)胞研究)，在蓋有塑料箔的燒瓶內(nèi)制備混合物，在暴光期間連續(xù)用氮沖洗。保持光的路徑小于1cm。使混合物暴露于一組TL’/03燈，在暴露于光期間輕輕地?fù)u動(dòng)。照射后，將混合物冷凍干燥，溶于DMSO。
細(xì)胞培養(yǎng)使用來自中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞的既定細(xì)胞系V79(ATCC CCL-93)的細(xì)胞。在37℃下，在用含5％CO2的空氣沖洗的恒溫箱內(nèi)，使細(xì)胞生長在MEM培養(yǎng)基中，其中含有10％胎牛血清(FCS，Gibco，Paisley，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Gibco)。將細(xì)胞每周次代培養(yǎng)兩次。
用光敏劑標(biāo)記將細(xì)胞接種在25cm2燒瓶(Nunclon，Denmark)內(nèi)，其中含有含10％FCS的MEM培養(yǎng)基，在37℃下放置4-5小時(shí)，以充分地附著于酶解物。隨后，將細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌3次，暴露于含1μg/ml TPPS2a或TPCS2a的含血清培養(yǎng)基達(dá)18小時(shí)。隨后將細(xì)胞用無致敏劑培養(yǎng)基洗滌3次，在暴露于光之前培育1小時(shí)。然后使細(xì)胞暴露于通過Cinemoid 35濾波器過濾的紅光(Phillips TL 20 W/09)或藍(lán)光(Appl.Photophysics，Nood.3026，London)。來自紅燈和藍(lán)燈到達(dá)細(xì)胞的能流比率分別為1.35mW/cm2和1.5mW/cm2。
毒性測定借助集落生成試驗(yàn)測量細(xì)胞存活率，如Berg等所述(Photochem.Photobiol.53203-210，1991)。將1500個(gè)細(xì)胞接種在25cm2塑料組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，如上所述用光敏劑和光處理。光化學(xué)處理后，將V79細(xì)胞在37℃含血清培養(yǎng)基中放置5天，以便生成可計(jì)數(shù)的集落。然后將細(xì)胞固定在乙醇中，用亞甲基藍(lán)染色，計(jì)數(shù)集落。向蛋白質(zhì)中摻入[3H]-亮氨酸，評估對蛋白質(zhì)合成的抑制作用，在暴露于光之后24小時(shí)測量，如Llorente等所述(FEBS Lett.431200-204，1998)。
HPLC在酸化的甲醇(含5μl濃HCl的10ml甲醇)中刮取細(xì)胞，從細(xì)胞中提取卟啉，如Berg等所述(Br.J.Cancer 74688-697，1996)。使細(xì)胞碎屑沉淀，收集上清液。將提取物用N2沖洗直至體積減少至大約150-200μl和使另外沉淀的蛋白質(zhì)形成沉淀，濃縮卟啉。將100μl上清液與235μl10mM Na2PO4混合，借助5M KOH調(diào)節(jié)pH至大約10.5，直接用于HPLC分析。借助這種工藝從細(xì)胞中定量提取卟啉。將光敏劑的儲(chǔ)備溶液直接稀釋在起始緩沖液中。
HPLC系統(tǒng)由泵(Spectra Physics 8800)、反相柱(Supelcosil LC-18-T(4.6×250mm)，Supelco，S.A.，Gland，Switzerland)、熒光檢測器(LDCfluoromonitor III)和積分儀(Spectra Physics Data-jet)組成，連接有計(jì)算機(jī)。溶劑A是甲醇與水的混合物(體積比30∶70)，含有1.5mM磷酸鹽，調(diào)節(jié)至pH7.0。溶劑B是甲醇與水的混合物(體積比95∶5)，含有1.5mM磷酸鹽，調(diào)節(jié)至pH7.5。應(yīng)用在40％與20％溶劑A之間的30分鐘線性梯度，繼之以5分鐘線性梯度至100％溶劑B。在330-400nm的波長范圍內(nèi)激發(fā)，檢測熒光。借助截留濾波器消除熒光中的散射光，該濾波器僅發(fā)射波長長于410nm的光。
熒光顯微鏡檢查在顯微鏡研究中使用28cm2皿(Falcon 3002，Becton Dickinson，Plymouth，UK)。將細(xì)胞用PBS洗滌一次，將蓋玻片小心地置于PBS層頂部。隨后借助裝有epifluorescence的Zeiss Axioplan顯微鏡(Zeiss，Obercochen，Germany)研究細(xì)胞。利用HBO/100W汞燈進(jìn)行激發(fā)。借助冷卻了的電荷偶合器件(CCD)照相機(jī)(TE2，Astromed，Cambridge，UK)研究細(xì)胞和細(xì)胞熒光。計(jì)算機(jī)控制照相機(jī)的操作，用于數(shù)字圖象的處理和儲(chǔ)存。顯微鏡裝有390-440nm帶通濾波器、470nm二色分束器和610nm長路徑濾波器。
酶測定如Beaufay等所述測量溶酶體酶β-AGA的光化學(xué)失活(J.Cell Biol.61188-200，1974)。該方法基于對-硝基苯酚的生成(從底物對-硝基苯基-N-乙?；?D-氨基葡糖苷生成)，可以在420nm下借助分光光度法測量之。在暴光之后立即分離細(xì)胞，準(zhǔn)備用于酶分析。
實(shí)施例1TPPS2a的光化學(xué)還原按照Harel等所述方法(Photochem.Photobiol.23337-341，1976)，在用氮飽和的三乙胺(TEA)的苯溶液中使TPPS2a暴露于光。在比色杯中使溶液暴露于545nm的光，如上“材料和方法”所述。
圖1顯示在暴露于光之后的吸收光譜變化和終產(chǎn)物的光譜，后者是二氫卟酚所特有的。Q-帶第1帶的峰從646nm移動(dòng)到655nm，最大處的強(qiáng)度增加5.8倍(圖2)。在593nm以及505nm、518nm和577nm處觀測等消光點(diǎn)。照射后的吸收帶是二氫卟酚的特征。
為了擴(kuò)大二氫卟酚的制備規(guī)模用于細(xì)胞研究，使更大體積的TPPS2a暴露于光，如“材料和方法”所述進(jìn)行準(zhǔn)備。655nm吸收峰增加的時(shí)間比例與上述相似，如圖2所示。生成二氫卟酚后進(jìn)行HPLC，如圖3所示，顯示生成了若干二氫卟酚異構(gòu)體。暴露于光達(dá)10分鐘的溶液進(jìn)一步用于培養(yǎng)物中細(xì)胞的處理。照射10分鐘后，約23％產(chǎn)物具有與TPPS2a相似的保留時(shí)間，但是峰顯示典型的二氫卟酚吸收光譜。
實(shí)施例2TPCS2a的光生物學(xué)評價(jià)使用細(xì)胞系V79的中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行二氫卟酚TPCS2a的光化學(xué)效應(yīng)的生物學(xué)評價(jià)。將細(xì)胞用二氫卟酚培育過夜，從細(xì)胞中提取光敏劑，用HPLC評價(jià)提取物。如圖4所示，細(xì)胞提取物中熒光峰的圖樣與儲(chǔ)備溶液相似。利用反相C-18柱進(jìn)行色譜分析，保留時(shí)間一般隨化合物的疏水性而增加。發(fā)現(xiàn)二氫卟酚的細(xì)胞攝取隨異構(gòu)體的疏水性而增加。
以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)光敏劑TPPS2a定位于用這種化合物培育的細(xì)胞的胞吞小泡中(Berg et al. Photochem.Photobiol.52481-487，1990)。發(fā)現(xiàn)TPCS2a的細(xì)胞內(nèi)的定位與TPPS2a相似，表明TPCS2a也定位于胞吞小泡中(見圖5)。溶酶體酶β-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶的光化學(xué)失活進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)(見圖6)。因而，通過比較溶酶體定位性光敏劑TPPS2a的細(xì)胞內(nèi)熒光圖樣，借助熒光顯微鏡檢查和直接借助溶酶體酶β-AGA的光化學(xué)失活測量，顯示TPCS2a間接定位于V79細(xì)胞的胞吞小泡中。
在光動(dòng)力學(xué)療法中使用二氫卟酚代替卟啉的益處是二氫卟酚在紅光波長區(qū)的消光系數(shù)更高。通過比較用TPPS2a和TPCS2a處理的細(xì)胞暴露于藍(lán)光和紅光，清楚地證明了這一點(diǎn)(見圖7)。圖7中可以見到，用TPPS2a或TPCS2a處理的細(xì)胞對藍(lán)光是同等敏感的，而用TPCS2a處理的細(xì)胞對紅光的敏感性比用卟啉TPPS2a處理的細(xì)胞高6倍(圖7a)。
借助I型核糖體失活蛋白質(zhì)毒素核糖體失活蛋白的內(nèi)在化評價(jià)TPCS2a在胞吞小泡中的細(xì)胞內(nèi)定位，因而及其可能的在大分子光化學(xué)內(nèi)在化(PCI)中的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核糖體失活蛋白單獨(dú)或者與光聯(lián)合都發(fā)揮低毒性(Berg et al.Cancer Res.591180-1183，1999)。在用1μg/ml核糖體失活蛋白處理18小時(shí)的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的合成減少了約10％。不過如圖8所示，在暴光之后24小時(shí)測量蛋白質(zhì)合成，發(fā)現(xiàn)TPCS2a和光大大加強(qiáng)核糖體失活蛋白的細(xì)胞毒性。由單獨(dú)TPCS2a誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成有輕微(20％)的減少，這在clonogenicity測定中沒有觀察到。結(jié)果證明，核糖體失活蛋白在用TPCS2a光化學(xué)處理后被內(nèi)在化于細(xì)胞內(nèi)。
討論本研究顯示，在厭氧條件下，在TEA的存在下，二磺化的四苯基卟吩能夠借助光化學(xué)還原作用還原為它的二氫卟酚形式。光化學(xué)還原作用引起由若干二氫卟酚異構(gòu)體的生成所導(dǎo)致的Q-帶第I帶的消光系數(shù)增加5.8倍。當(dāng)與母體卟啉TPPS2a比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)在V79細(xì)胞中二氫卟酚TPCS2a使細(xì)胞對光失活作用敏感的光敏能力在藍(lán)光下是等效的，在紅光下的效率高6倍。
熒光顯微鏡檢查顯示TPCS2a間接定位于V79細(xì)胞的胞吞小泡中。借助溶酶體酶β-AGA的光化學(xué)失活測量直接確認(rèn)了這一點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)β-AGA失活率相對于細(xì)胞存活率而言與以前關(guān)于TPPS2a的發(fā)現(xiàn)相似(Berg et al.，Int.J.Cancer 59814-822，1994)，表明這些化合物在胞吞小泡的膜與腔之間存在相似的分布。
還顯示可以采用TPCS2a作為大分子光化學(xué)內(nèi)在化(PCI)的光敏劑，正如核糖體失活蛋白的PCI所證明的。
權(quán)利要求
1.光敏劑，包含磺化的中-四苯基二氫卟酚或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的光敏劑，其中存在于所述二氫卟酚中的四個(gè)苯基環(huán)至少有一個(gè)被一個(gè)磺酸酯基取代。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所要求保護(hù)的光敏劑，其中存在于所述二氫卟酚中的兩個(gè)苯基環(huán)各自被單一的磺酸酯基取代。
4.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的光敏劑，其中所述二氫卟酚是式(I)化合物 (其中X是-SO3H；n、p、q和r各自獨(dú)立地是0或1；n、p、q和r之和是1至4的整數(shù)，優(yōu)選為至少2，例如2或4)；異構(gòu)體，或任意上述之一的藥學(xué)上可接受的鹽。
5.如權(quán)利要求4所要求保護(hù)的光敏劑，其中n、p、q和r之和是2，每個(gè)基團(tuán)X存在于每個(gè)苯基環(huán)內(nèi)相同的環(huán)位置。
6.如權(quán)利要求5所要求保護(hù)的光敏劑，其中所述環(huán)位置是間-位或?qū)?位。
7.如權(quán)利要求4至6任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的光敏劑，其中n、p、q和r之和是2，取代的苯基環(huán)相鄰于還原的吡咯環(huán)。
8.如權(quán)利要求4所要求保護(hù)的光敏劑，其中所述二氫卟酚是式(II)化合物 異構(gòu)體、或任意上述之一的藥學(xué)上可接受的鹽。
9.可通過還原磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環(huán)中一個(gè)雙鍵而得到的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
10.如權(quán)利要求9所要求保護(hù)的光敏劑，其中所述卟啉大環(huán)是二磺化的中-四苯基卟啉。
11.如權(quán)利要求10所要求保護(hù)的光敏劑，其中所述卟啉是TPPS2a(四苯基卟吩二磺酸酯)。
12.制備如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑的方法，所述方法包含至少一個(gè)下列步驟(a)還原磺化的四苯基卟啉或其鐵螯合物；(b)如果需要的話，分離步驟(a)所生成的化合物的混合物；(c)轉(zhuǎn)化步驟(a)或步驟(b)所生成的化合物為其藥學(xué)上可接受的鹽。
13.藥物組合物，包含如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及至少一種藥物載體或賦形劑。
14.用作藥物的如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
15.如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用在光化學(xué)內(nèi)在化、光化學(xué)療法或診斷方法中。
16.向細(xì)胞的胞質(zhì)引入轉(zhuǎn)移分子的方法，所述方法包含(a)使所述細(xì)胞與如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸；(b)使所述細(xì)胞與所述轉(zhuǎn)移分子接觸；和(c)將所述細(xì)胞用活化該光敏劑有效波長的光進(jìn)行照射。
17.藥物組合物，包含如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、轉(zhuǎn)移分子和至少一種藥物載體或賦形劑。
18.如權(quán)利要求17所要求保護(hù)的藥物組合物，其中所述轉(zhuǎn)移分子選自由有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的片段和核酸組成的組。
19.用在治療中的如權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所要求保護(hù)的藥物組合物。
20.如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽和如權(quán)利要求18所定義的轉(zhuǎn)移分子在藥物制備中的用途，該藥物用在治療中，例如癌癥或基因的治療，其中使所述光敏劑和所述轉(zhuǎn)移分子(單獨(dú)、同時(shí)或先后)與患者的細(xì)胞或組織接觸，再用波長有效活化所述光敏劑的光照射所述的細(xì)胞或組織。
21.如權(quán)利要求20所要求保護(hù)的用途，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、病毒感染、牛皮癬、光化性角化病、創(chuàng)傷、骨折、疣、囊性纖維變性、戈林氏綜合征或運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥。
22.如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽和轉(zhuǎn)移分子在藥物制備中的用途，該轉(zhuǎn)移分子選自由編碼治療性蛋白質(zhì)的基因、反義DNA或RNA分子、核酶、適體、構(gòu)成寡核苷酸的三鏈體、肽核酸(PNA)、轉(zhuǎn)錄因子“decoy”DNA和嵌合寡核苷酸組成的組，該藥物用在基因療法中，例如治療癌癥、心血管疾病、病毒感染或單基因疾病如囊性纖維變性的方法。
23.如權(quán)利要求17至19任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的藥物組合物或者如權(quán)利要求20至23任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的用途，其中將所述光敏劑和/或所述轉(zhuǎn)移分子連接于、締合于或者共軛于載體分子、定向分子或載體。
24.如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所定義的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用于治療任何對光化學(xué)療法有反應(yīng)的惡性、惡性前或非惡性異?；蚣膊?，例如腫瘤或其他生長，皮膚疾病，例如牛皮癬或光化性角化病與痤瘡、皮膚磨損，和其他疾病或感染，例如細(xì)菌、病毒或真菌感染，例如皰疹病毒感染。
25.外部或內(nèi)部肌體表面疾病或異常的光化學(xué)治療方法，所述方法包含(a)對受影響的表面給以如權(quán)利要求1至11所要求保護(hù)的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)使所述表面暴露于波長為300-800nm的光。
26.產(chǎn)品，包含如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽以及至少一種表面滲透助劑和/或一種或多種螯合劑，作為聯(lián)合制備物，同時(shí)、單獨(dú)或先后用于治療對光化學(xué)療法有反應(yīng)的外部或內(nèi)部肌體表面疾病或異常。
27.用在外部或內(nèi)部肌體表面疾病或異常的光化學(xué)療法中的試劑盒，包含(a)第一容器，含有如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽；(b)第二容器，含有至少一種表面滲透助劑；和任選地包含(c)一種或多種螯合劑，包含在所述第一容器內(nèi)或第三容器中。
28.通過測定患者體液或組織樣本來體外診斷異?；蚣膊〉姆椒?，所述方法包含i)混合所述體液或組織與如權(quán)利要求1至11任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的光敏劑或其藥學(xué)上可接受的鹽；ii)使所述混合物暴露于光；iii)確定熒光的水平；和iv)比較熒光水平與對照物水平。
全文摘要
本發(fā)明提供光敏劑，它是通過還原磺化的中－四苯基卟啉的卟啉大環(huán)中單一雙鍵而得，該卟啉優(yōu)選為二磺化的中－四苯基卟啉，例如TPPS
文檔編號A61P31/12GK1549729SQ02816909
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月30日
發(fā)明者克勞德·里明頓, 克里斯蒂安·伯格, 迪姆·特蘭, 帕爾·K·塞爾博, K 塞爾博, 克勞德 里明頓, 特蘭, 蒂安 伯格 申請人:Pci生物技術(shù)公司