專利名稱：基因limg編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在乳腺癌診斷和/或治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體，具體講，涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體的在乳腺癌診斷和/或治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
UMG基因位于人9號染色體長臂，全長453個堿基，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。我們克隆到的LIMG的ORF有453個堿基，編碼一個150個氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為17kDa。圖I為UMG的基因結(jié)構(gòu)示意圖，UMG基因ORF為150個氨基酸，下劃線部分為EF-hand(52-112aa)結(jié)構(gòu)域，下方所示為LIMG的蛋白序列。 在現(xiàn)有技術(shù)的報道中，還沒有該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的功能的報道，為了進一步研究該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的功能，發(fā)明人進行了深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出一種用于診斷乳腺癌的試劑盒。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應(yīng)用。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應(yīng)用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。當(dāng)采用定量PCR法檢測基因UMG的表達，用定量PCR儀檢測，當(dāng)待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因UMG水平2±0. 05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當(dāng)待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因LMG水平2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。本發(fā)明還涉及一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，該試劑盒為定量PCR的試劑盒，包括提取DNA的試劑盒、正常參比組的DNA、UMG基因的引物。本發(fā)明還涉及另一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，該試劑盒采用免疫檢測法，包括提取蛋白質(zhì)的試劑盒、LMG抗體包被的孔板、LIMG的單克隆或多克隆抗體、作為濃度參比標(biāo)準(zhǔn)的UMG純化蛋白、第二抗體、ELISA顯色試劑，用于檢測的酶標(biāo)儀，其中，UMG抗體為單抗或多抗。本發(fā)明還涉及基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應(yīng)用。所述的基因UMG在性激素及類似物的作用下增加表達。
經(jīng)動物實驗表明，當(dāng)刺激UMG的表達增加時，雌性小鼠的乳腺發(fā)育加快。前期試驗證明UMG基因直接作用于0ct4等轉(zhuǎn)錄因子，這些因子對于細(xì)胞的自我更新和繁殖十分重要。LIMG基因為刺激乳腺增長和發(fā)育提供了一個新的途徑。本發(fā)明還涉及基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在檢測乳腺發(fā)育中的應(yīng)用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選定量PCR、免疫印跡法、雙抗體夾心法。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應(yīng)用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。當(dāng)采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當(dāng)待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因UMG水平的2 ± O. 05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當(dāng)待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。通過獲得足夠量的乳腺癌病例和正常例，用統(tǒng)計學(xué)95%可信區(qū)間的方法初步設(shè)定正常值范圍，從而在分子水平上實現(xiàn)乳腺癌的初步診斷。本發(fā)明的檢測方法簡便、快速，可作為大規(guī)模篩查使用，也可作為臨床上的檢測手段，為乳腺癌的檢測提供了一種新途徑。


圖I為UMG的基因結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為在大腸桿菌BL21中表達UMG-GST融合蛋白的電泳圖譜；圖3為用純化蛋白作為抗原制備的抗體，Western Blot法可以檢測過表達的LIMG ；圖4為乳腺腫瘤和遠(yuǎn)端正常乳腺中LMG表達水平的比較；圖5為UMG在小鼠乳腺發(fā)育過程中的表達水平的變化。
具體實施例方式實施例I :LIMG抗體的制備利用BL21大腸桿菌細(xì)胞表達純化UMG-GST蛋白質(zhì)，用此蛋白制備了特異性UMG多克隆抗體及體外蛋白功能檢測首先采用PCR的方法擴增出LIMG片段，然后進行瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，再進行酶切及過夜連接，將LMG片段克隆至pGEX4T3質(zhì)粒，將UMG/pGEX4T3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細(xì)胞中，采用經(jīng)典的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達方法，誘導(dǎo)目的蛋白表達，之后裂解大腸桿菌用GST-beads純化UMG-GST融合蛋白。LIMG/pGEX4T3 質(zhì)粒合成方法pGEX_4T3購自AmershamBiosciences公司，根據(jù)LIMG全長基因序列，設(shè)計擴增LIMG截短的基因片段的特異引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 1所示，
下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 2所示，SEQ NO ID :1 :5’ GACGCGTGGATCCCCTTTTCCTCCCTGTTGTCCC3’SEQ NO ID :2 :5’ GTCCGCCGAATTCGACCTTTTGTACAAAGAGGGCA3’誘導(dǎo)上游引物L(fēng)5’端加了限制性內(nèi)切酶BamHI酶切位點，下游引物R5’端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點。用上述引物擴增出截短的UMG基因片段，取5μ I進行1%瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠上切下含有目的片段的凝膠，按照DNA凝膠純化試劑盒操作步驟純化回收目的片段。表達質(zhì)粒的構(gòu)建純化的目的基因片段，經(jīng)T4DNA連接酶與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切反應(yīng)，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T3連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切鑒定，篩選出含目的基因片段的陽性克隆，并測序，得到陽性克隆即為目的質(zhì)粒。誘導(dǎo)目的蛋白表達的方法將含有目的基因重組表達質(zhì)粒UMG/pGEX4T3的BL21菌株，接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，按I : 100比例轉(zhuǎn)種于新鮮2YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)4 5h，取菌體用于SDS-PAGE分析。所得的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色后，推算的UMG分子量與UMG真核表達推算所得相一致，如圖2所示；圖2為在大腸桿菌BL21中表達UMG-GST融合蛋白，圖為經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE膠，圖中1-3列分別為IPTG(O. ImM)誘導(dǎo)2h，3h，4h后純化的LIMG-GST蛋白。第4列為蛋白marker。用該融合蛋白作為抗原免疫兔子,得到的免疫后血清用免疫熒光染色、WesternBlot, ELISA法可以檢測到內(nèi)源表達的UMG。多克隆抗體制備參考教科書《免疫學(xué)》，利迪亞德(Peter M Lydyard) AlexWhelan Michael W Fanger譯者林慰慈,魏雪濤,薛彬,2010年,科學(xué)出版社。所得的血清抗體可以識別外源表達的UMG蛋白，如圖3所示；圖3為western檢測抗體識別蛋白情況，圖為經(jīng)二抗孵育后的經(jīng)SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)膜后的圖，圖中上下兩幅分別代表使用血清抗體和FLAG標(biāo)簽抗體識別外源UMG蛋白表達情況，從左至右分別為對照組(無外源蛋白表達)和實驗組(LIMG蛋白表達)。Western Blot法可以檢測到過表達的UMG，證明我們制備的抗體具有特異性。實施例2 :乳腺腫瘤UMG在人乳腺腫瘤中高表達我們檢測了正常乳腺細(xì)胞系和乳腺腫瘤細(xì)胞系中LIMG在RNA和蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)LIMG在腫瘤細(xì)胞的表達均高于正常。我們通過提取24例病人的遠(yuǎn)端正常組織及22例腫瘤組織的RNA進行RT-PCR檢測了其RNA水平的差異，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的病人腫瘤組織UMG的表達均高于正常。并且與腫瘤惡性程度分級相關(guān)。RNA水平檢測采用的是realtime PCR的方法，具體的RT-PCR的條件引物、體系、循環(huán)溫度和時間等如下上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 4所示；SEQ NO ID :3 :5’ CTTGTCCATTCTCAGCGACA 3’
SEQ NO ID 4 :5’ ACTCCCTCACACCACTGACC 3’反應(yīng)體系購于TAKARA 公司SYBR Premix Ex Taq real-time 檢測試劑
權(quán)利要求
1.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當(dāng)待測組的基因UMG水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性； 采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當(dāng)待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。
4.一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為定量PCR的試劑盒，包括提取DNA的試劑盒、正常參比組的DNA、UMG基因的引物。
5.一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用免疫檢測法，包括提取蛋白質(zhì)的試劑盒、LMG抗體包被的孔板、LIMG的單克隆或多克隆抗體、作為濃度參比標(biāo)準(zhǔn)的UMG純化蛋白、第二抗體、ELISA顯色試劑，用于檢測的酶標(biāo)儀，其中，UMG抗體為單抗或多抗。
6.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因LIMG在性激素及類似物的作用下增加表達。
8.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在檢測乳腺發(fā)育中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選定量PCR、免疫印跡法、雙抗體夾心法。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體，具體講，涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體的在乳腺癌診斷和/或治療中的應(yīng)用。當(dāng)采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當(dāng)待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因LIMG水平2±0.05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測LIMG編碼的蛋白時，當(dāng)待測組的基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因LIMG水平的2±0.05倍及以上時，判定為陽性。本發(fā)明還涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應(yīng)用，以及檢測乳腺發(fā)育中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102952849SQ20111023760
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者李凌松 申請人:李凌松