專利名稱：14β－H－甾醇,包含該甾醇的藥物組合物以及這些衍生物在制備減數(shù)分裂調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物活性甾醇，包含這些甾醇作為活性物質(zhì)的藥物組合物以及這些新的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。更具體而言，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的甾醇可用于調(diào)節(jié)減數(shù)分裂。
減數(shù)分裂是生殖細(xì)胞的獨(dú)特而且是最終的過(guò)程，而有性繁殖是以這些生殖細(xì)胞為基礎(chǔ)的。減數(shù)分裂包括兩個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程。在第一個(gè)分裂過(guò)程中，先進(jìn)行母體基因與父體基因之間的交換，然后染色體對(duì)分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。它們僅包含染色體和2c DNA數(shù)量(1n)的一半。第二個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程不涉及DNA合成。因此，該分裂過(guò)程導(dǎo)致僅有1c DNA的單倍生殖細(xì)胞形成。
減數(shù)分裂過(guò)程在雄和雌生殖細(xì)胞中是類似的，但是時(shí)間程序以及導(dǎo)致卵及精子形成的分化過(guò)程有非常大的差異。在生命的早期，通常在出生之前，所有的雌生殖細(xì)胞都進(jìn)入第一個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程的前期，但所有的細(xì)胞隨后在該前期中都以卵母細(xì)胞的形式停止(dictyate狀態(tài))，直至青春期后形成卵。這樣，從生命的早期，雌性就已具有卵母細(xì)胞儲(chǔ)備，并用至該儲(chǔ)備耗盡。雌性中的減數(shù)分裂在受精后才完成，而且每個(gè)生殖細(xì)胞僅產(chǎn)生一個(gè)卵子和兩個(gè)流產(chǎn)極體。相反地，雄性生殖細(xì)胞中的一些僅在青春期后進(jìn)入減數(shù)分裂，并在整個(gè)生命過(guò)程中形成干群(stem population)生殖細(xì)胞。一旦開(kāi)始，雄性細(xì)胞中的減數(shù)分裂將沒(méi)有任何延遲地進(jìn)行，并產(chǎn)生4個(gè)精子。
對(duì)于控制雄性和雌性中減數(shù)分裂啟動(dòng)的機(jī)理僅知道很少。在卵母細(xì)胞中，新的研究表明卵泡嘌呤、次黃嘌呤或腺嘌呤有可能是減數(shù)分裂停止的原因(Downs，S.M.等人，Dev Biol 92(1985)454-458；Epplg.J.J.等人，DevBiol 119(1986)313-321；以及Downs，S.M.，Mol Reprod Dev 35(1993)82-94)。Byskov等人首次描述了在胚胎鼠性腺的培養(yǎng)體系中存在擴(kuò)散性減數(shù)分裂調(diào)節(jié)物質(zhì)(Byskov，A.G.等人，Dev Biol 52(1976)193-200)。減數(shù)分裂活化物質(zhì)(MAS)是由其中進(jìn)行減數(shù)分裂的胚胎鼠卵巢分泌的，而防止減數(shù)分裂的物質(zhì)(MPS)是由具有休止且非減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞的、已發(fā)生形態(tài)分化的睪丸釋放的。這表明MAS和MPS的相對(duì)濃度調(diào)節(jié)雄性和雌性生殖細(xì)胞中減數(shù)分裂的開(kāi)始、停止和重新開(kāi)始(Byskov，A.G.等人，在The Physiology of Reproduction[Knobil，E.和Neil，J.D.編輯]中，Raven Press，New York(1994))。已清除地知道，如果可以調(diào)節(jié)減數(shù)分裂，則可控制繁殖。最近的一篇文章(Byskov，A.G.等人，Nature 374(1995)，559-562)描述到可從牛睪丸和人卵母細(xì)胞液中分裂出某些活化卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的甾醇(T-MAS和FF-MAS)。
已知在WO96/27658、WO97/00884、WO98/28323和WO98/52965中描述了可調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的化合物。
本發(fā)明的目的是提供可在雄性和雌性、特別是人中通過(guò)抑制減數(shù)分裂而用作避孕藥的新化合物。
本發(fā)明涉及以下通式I的14β-H-甾醇或其酯 其中R3代表氫原子或者與R3′一起代表額外的鍵，R3′代表氫原子或者與R3一起代表額外的鍵，R4代表氫原子或者甲基，R4′代表氫原子或者甲基，R7代表氫原子或者與R8一起代表額外的鍵，R8代表氫原子或者與R7或與R9一起代表額外的鍵，R9代表氫原子或者與R8或與R11一起代表額外的鍵，R15代表氫原子、羥基、鹵原子或者與R15′一起代表氧代基團(tuán)或者與R16一起代表額外的鍵或者與R22′一起代表氧橋，R15′代表氫原子、C1-C8直鏈或支鏈烷基、C6-C10芳基或者與R15一起代表氧代基團(tuán)，R16代表氫原子、羥基、鹵原子或者與R15一起代表額外的鍵或者與R22一起代表額外的鍵，R22代表氫原子、C1-C8直鏈或支鏈并任選取代的烷基或者烯基、任選取代的C6-C10芳基或者與R16一起代表額外的鍵或者與R22′一起代表C1-C8直鏈或支鏈亞烷基，R22′代表氫原子、羥基或者與R15一起代表氧橋或者與R22一起代表C1-C8
直鏈或支鏈亞烷基。
當(dāng)在說(shuō)明書(shū)以及權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，無(wú)論單獨(dú)還是組合使用，烷基都可以是直鏈或者支鏈烷基。C1-C8烷基代表具有1-8個(gè)碳原子的烷基優(yōu)選的例子是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基和環(huán)己基。術(shù)語(yǔ)烯基是指不飽和烷基。優(yōu)選的例子是乙烯基、烯丙基、異戊烯基、和異戊二烯基。術(shù)語(yǔ)鹵素是指氟、氯、溴或碘。當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，諸如R15與R15′一起代表氧代基團(tuán)的說(shuō)明是指，氧代基團(tuán)(＝O)存在于15位，而且因此在15位處沒(méi)有氫原子。術(shù)語(yǔ)C6-C10芳基代表任選被鹵素、(C1-C4)烷氧基、羥基或者(C1-C4)烷基取代的苯基。術(shù)語(yǔ)C1-C8直鏈或支鏈亞烷基是指具有1-8個(gè)碳原子的亞烷基。該基團(tuán)通過(guò)一個(gè)雙鍵連接在甾醇的22位碳原子上。優(yōu)選的例子是亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞異丙基、亞丁基、亞異丁基、亞戊基、亞異戊基、亞新戊基和亞環(huán)己基。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在14位(碳原子的編號(hào)是根據(jù)IUPAC命名法)處的氫原子為β構(gòu)型對(duì)于減數(shù)分裂抑制活性是非常重要的。存在14β-H-甾醇時(shí)，F(xiàn)F-MAS的減數(shù)分裂活化作用被降低或者完全消除。目前已知的減數(shù)分裂調(diào)節(jié)物質(zhì)是14α-H和△14-膽甾烷衍生物(Byskov，A.G.等人，Nature 374(1995)，559-562)，而且表現(xiàn)出減數(shù)分裂激活活性或者低的抑制活性。相反地，本發(fā)明的14β-H甾醇強(qiáng)烈拮抗天然FF-MAS的作用，而且因此是減數(shù)分裂抑制劑。這些發(fā)現(xiàn)使得所述化合物對(duì)于避孕是特別有利的。優(yōu)選的式I化合物是在如實(shí)施例13所述的卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中測(cè)試時(shí)，至少抑制生發(fā)泡破碎達(dá)20％，優(yōu)選至少抑制40％，特別優(yōu)選抑制至少60％，而且在如實(shí)施例12所述的卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中不激活減數(shù)分裂。
通式I的化合物在其分子中具有多個(gè)手性中心，而且因此存在幾個(gè)異構(gòu)體形式。所有這些異構(gòu)體以及它們的混合物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)(除非另有說(shuō)明)。優(yōu)選的通式I化合物是其中具有3β-OH基團(tuán)和一個(gè)△8雙鍵。另外還優(yōu)選的式I化合物是，其中R15代表氫原子或者羥基。其他優(yōu)選的通式I化合物是其中R22代表C1-C8直鏈或支鏈并任選取代的烷基或者與R22’一起代表C1-C8直鏈或支鏈亞烷基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通式I化合物的酯。所述酯通常是用酸酯化式I化合物中的一個(gè)或多個(gè)羥基而形成的，所述酸可例如選自于琥珀酸、戊二酸以及其他脂族二羧酸、煙酸、異煙酸、乙基碳酸、磷酸、磺酸、氨基磺酸、苯甲酸、乙酸、丙酸和其他脂族單羧酸。
特別優(yōu)選的本發(fā)明式I化合物如下4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-7，9(11)，15-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，23(E)-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，15，22-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇?xì)涠《狨ィ?，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，15，22-三烯-3β-醇?xì)涠《狨ィ?20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15 α-二醇，(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇，(20S)-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇。
根據(jù)本發(fā)明的通式I化合物可用類似于已知化合物的方法來(lái)合成。因此，式I化合物的合成可遵循甾醇以及甾體化合物文獻(xiàn)中描述的已知合成路線。以下參考書(shū)可用作合成中的主要來(lái)源L.F.Fieser & M.FieserSteroidsReinhold Publishing Corporation，NY 1959；Rood′s Chemistry ofCarbon Compounds(編輯S.Coffrey)Elsevier Publishing Company，1971；以及Dictionary of Steroids(R.A.Hill；D.N.Kirk；H.L.J.Makin和G.M.Murphy編輯)Chapman & Hall。最后-個(gè)參考書(shū)包括眾多原始文獻(xiàn)，覆蓋至1990。
具體而言，本發(fā)明的化合物可根據(jù)以下總的方法來(lái)合成。
用作起始物的甾醇可根據(jù)以下文獻(xiàn)方法合成4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇(Biochem.J.132(1973)，439)、4，4-二甲基-5α-麥角甾-8，14，22-三烯-3β-醇(苯甲酸酯J.Org.Chem.51(1986)，4047)、5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇(J.Am.Chem.Soc.75(1953)，4404)、5α-麥角甾-8，14，22-三烯-3β-醇(J.Org.Chem.53(1988)，1563)。
以下將詳細(xì)描述具有4，4-二甲基的化合物。在4位未被取代的化合物是通過(guò)類似方法制得的。
由△-8，14-二烯體系1通過(guò)保護(hù)醇、環(huán)氧化并隨后使環(huán)氧化物開(kāi)環(huán)可合成14β-H-衍生物(合成路線1)。3-醇可以苯甲酸酯的形式保護(hù)。環(huán)氧化反應(yīng)可在不同的催化劑、m-CPBA以及其他過(guò)酸存在下用諸如二甲基dioxirane、過(guò)氧化氫等試劑來(lái)完成。用不同的酸或者Lewis酸如三氟化硼處理，由此可實(shí)現(xiàn)重排為去共軛酮4(參見(jiàn)Chem.Pharm.Bull.38(1990)，1796)。
合成路線1 這些反應(yīng)可在不同的甾體側(cè)鏈(Rs)存在時(shí)進(jìn)行，例如膽甾醇、麥角甾醇、谷甾醇和豆甾醇側(cè)鏈。
如果通式4的15-酮用氫化鋁還原，可得到通式5的3β，15β-二醇。通過(guò)硼氫化鈉還原，可以通式6之少量非對(duì)映異構(gòu)體的形式得到相應(yīng)的15α-醇。隨后脫除3-OH基團(tuán)的保護(hù)基，得到通式7的3β，15α-二醇(合成路線2)。
合成路線2 通式10的△8，15-二烯可通過(guò)以下反應(yīng)得到。用硼氫化鈉還原酮4，產(chǎn)生15β-醇8，其是主要的非對(duì)映異構(gòu)體。可用Martin′s sulfurane進(jìn)行消除反應(yīng)，得到通式9的△8，15-二烯。脫除保護(hù)基，得到通式10的希望醇(合成路線3)。
合成路線3 15位飽和的衍生物是通過(guò)以下反應(yīng)制得的。通式8的15β-醇與甲烷磺酰氯反應(yīng)。甲磺酸酯11用氫化鋁鋰還原，得到通式12的化合物(合成路線4)。
合成路線4
側(cè)鏈改性可通過(guò)使通式4化合物中的麥角甾醇側(cè)鏈臭氧化來(lái)進(jìn)行(其中R甾醇＝麥角甾醇側(cè)鏈)。用硼氫化鈉還原處理后，可將22-醇13轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)如甲苯磺酸酯(合成路線5)。該甲苯磺酸酯14可在銅催化劑存在下與不同的支鏈或直鏈烷基、烯基或芳基格氏試劑反應(yīng)，形成通式15的化合物。
合成路線5 如上所述，這些化合物可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3，15-二醇(見(jiàn)合成路線2)、△8，15-二烯(合成路線3)或者15位飽和的化合物(合成路線4)。
其他側(cè)鏈改性，如24-酮、24-羥基和△24-化合物，可通過(guò)以下路線實(shí)現(xiàn)。使化合物4臭氧化，隨后用三苯基膦處理，得到醛16。該醛可在3-羥基丁醛反應(yīng)中與異丙基一甲基酮偶聯(lián)，以非對(duì)映異構(gòu)體混合物的形式形成化合物17。用Martin′s sulfurane進(jìn)行消除反應(yīng)，然后進(jìn)行氫化及還原反應(yīng)，以非對(duì)映異構(gòu)體混合物的形式得到二醇20(合成路線6)。
合成路線6 二醇20進(jìn)行消除反應(yīng)，形成以下甾醇。用Martin′s sulfurane處理，產(chǎn)生單消除和雙消除產(chǎn)物。隨后通過(guò)還原反應(yīng)可容易地?cái)嗔驯郊姿狨ィ謩e產(chǎn)生二醇23和三烯24(合成路線7)。
合成路線7 通過(guò)以下合成路線可制得在C16和C22之間具有另一個(gè)鍵的化合物。甲苯磺酸酯14用堿如二異丙基酰胺鋰或者不同的格氏化合物處理，以使酮脫除16位質(zhì)子。烯醇化物使22-甲苯磺酸酯進(jìn)行分子內(nèi)烷基化，形成pentacyclus 25。該化合物25用氫化鋁鋰處理，形成二醇26和27(合成路線8)。
合成路線8 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含一種或更多種通式I化合物作為活性物質(zhì)的藥物組合物。這些組合物可進(jìn)一步包含藥物學(xué)上可接受的本領(lǐng)域已知的賦形劑，如載體、稀釋劑、吸收促進(jìn)劑、防腐劑、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、片劑崩解劑、以及本領(lǐng)域通常使用的其他成分。固體載體的例子是碳酸鎂、硬脂酸鎂、糊精、乳糖、蔗糖、滑石、明膠、果膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟以及可可脂。
液體組合物包括無(wú)菌溶液、混懸液和乳液。此等液體組合物可適用于注射或者用于活體外及體外受精。液體組合物可包含本領(lǐng)域通常使用的其他成分，其中一些如上所述。另外，可以藥貼的形式提供用于經(jīng)皮給藥本發(fā)明化合物的組合物，以及以液體或粉末鼻腔噴霧劑的形式提供用于鼻腔給藥的組合物。
本發(fā)明化合物的使用劑量可由醫(yī)師確定，而且取決于多種因素，如所使用的具體化合物、給藥途徑、以及使用目的。通常情況下，本發(fā)明的組合物是如下制備的使活性化合物與液體或固體輔助成分充分混合，然后如果需要的話，將產(chǎn)品成型為所希望的劑型。
通常情況下，哺乳動(dòng)物(包括人)每天的給藥劑量為不超過(guò)1000mg、優(yōu)選不超過(guò)100mg、而且在一些優(yōu)選情況下不超過(guò)10mg的通式I化合物。
本發(fā)明涉及通式I的化合物在制備調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物影響卵母細(xì)胞以及雄性生殖細(xì)胞中的減數(shù)分裂。通式I的化合物可用作新型生育力調(diào)節(jié)劑，而不會(huì)有目前所用激素避孕藥物對(duì)體細(xì)胞的常見(jiàn)副作用，目前的激素避孕藥物是基于雌激素和/或孕激素。
在此方面，非常重要的是注意孕酮的生物合成在經(jīng)培養(yǎng)的人顆粒細(xì)胞(濾泡的體細(xì)胞)中不受減數(shù)分裂調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，而目前在激素避孕藥中使用的雌激素和孕激素對(duì)于孕酮的生物合成具有副作用。
雌性中的避孕作用可通過(guò)給藥抑制減數(shù)分裂的本發(fā)明化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，使得不產(chǎn)生成熟的卵母細(xì)胞。類似地，雄性中的避孕作用可通過(guò)給藥抑制減數(shù)分裂的本發(fā)明化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，使得不產(chǎn)生成熟的精細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的方法，其包括向需要此等調(diào)節(jié)作用的受體給藥有效量的一種或多種通式I化合物。
包含本發(fā)明化合物的組合物的給藥途徑可以是有效地將活性化合物轉(zhuǎn)運(yùn)至作用部位處的任何一種途徑。
因此，在將本發(fā)明的化合物給藥于哺乳動(dòng)物時(shí)，其通常是以包含至少一種本發(fā)明的化合物以及藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的形式提供。在口服使用時(shí)，此等組合物優(yōu)選為膠囊或片劑。
在用作避孕藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可連續(xù)或者周期性地給藥。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及甾醇化合物中14β-氫基團(tuán)在增加減數(shù)分裂抑制性物質(zhì)之抑制活性中的應(yīng)用。
將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例14，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15β-二醇a)4，4-二甲基-5α-麥角甾-8，14，22-三烯-3β-基-苯甲酸酯在60℃下將40ml苯甲酰氯分兩次添加在30.9g的4，4-二甲基-5α-麥角甾-8，22-二烯-3β-醇在154ml吡啶中的溶液內(nèi)。在相同的溫度下攪拌反應(yīng)物1小時(shí)，然后傾倒在冰水中。收集沉淀物，用冰冷卻的乙醇洗滌，由二氯甲烷/甲醇中重結(jié)晶，然后干燥12小時(shí)，得到32g的4，4-二甲基-5α-麥角甾-8，14，22-三烯-3β-基-苯甲酸酯(mp146℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.80-1.12(8×CH3)，4.75(dd，J＝16Hz，4Hz，1H，H-3α)，5.22(m，2H，H-22/23)，5.38(br s，1H，H-15)，7.46(t，2H)，7.57(t，1H)，8.07(d，2H)b)4，4-二甲基-14，15α-環(huán)氧基-5α-麥角甾-8，22-二烯-3β-基-苯甲酸酯將18g的4，4-二甲基-5α-麥角甾-8，14，22-三烯-3β-基-苯甲酸酯在60ml二氯甲烷中的溶液冷卻至10℃。添加3g的間硝基-氟乙酰苯和10ml飽和碳酸氫鈉溶液后，攪拌反應(yīng)物15分鐘。添加12ml過(guò)氧化氫(30％水溶液)，在10℃下攪拌該溶液20小時(shí)。添加20ml飽和硫代硫酸鈉溶液，并攪拌該混合物20分鐘，用二氯甲烷稀釋，然后用氫氧化鈉水溶液(5％)、水和鹽水洗滌。干燥(硫酸鎂)并真空除去溶劑，得到粗的環(huán)氧化物(20g)，其未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。c)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮20g的粗環(huán)氧化物溶解在300ml二惡烷中。機(jī)械攪拌該黃色溶液，并用2.5ml的三氟化硼-乙醚合物處理30分鐘，然后傾倒在冰水中。收集沉淀物，用冰水洗滌，然后干燥。粗產(chǎn)物用色譜純制，得到11.55g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮(mp176℃)。
1H-NMR(d5-吡啶)δ＝0.85(2×d，J＝7Hz，6H，H-27/26)，0.91(s，3H，4-β-CH3)，0.93(d，J＝7Hz，3H，H-28)，1.05(s，3H，H-18)，1.06(s，3H，4-α-CH3)，1.07(s，3H，H-19)，1.13(d，J＝7Hz，3H，H-21)，4.89(dd，J＝12Hz，4Hz，1H，H-3α)，5.37(m，2H，H-22/23)，7.49(t，2H)，7.57(t，1H)，8.27(d，2H)d)4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15β-二醇在攪拌下將50mg的氫化鋁鋰添加在300mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮在30ml乙醚中的溶液內(nèi)，然后在室溫下攪拌該混合物30分鐘。添加1ml飽和氯化銨溶液。10分鐘后，過(guò)濾溶液，然后真空除去溶劑。色譜分離殘留物，得到100mg的4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15β-二醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.78-1.2(8×CH3)，3.24(dd，J＝12Hz，4Hz，1H，H-3α)，3.7(br dd，J＝4Hz，4Hz，1H，H-15α)，5.24(m，2H，H-22/23)實(shí)施例24，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15α-二醇a)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15α-醇1g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮在75ml四氫呋喃和25ml甲醇中的溶液用750mg的硼氫化鈉處理。在室溫下攪拌30分鐘后，添加1ml的飽和氯化銨水溶液，并在室溫下攪拌該混合物15分鐘。過(guò)濾，真空除去溶劑，然后用色譜純制，得到60mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15α-醇，另外還有770mg相應(yīng)的15β-醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.8-1.12(8×CH3)，4.07(br t，J＝4Hz，1H，H-15β)，4.76(dd，J＝12Hz，4Hz，1H，H-3α)，5.23(m，2H，H-22/23)，7.44(t，2H)，7.57(t，1H)，8.07(d，2H)b)4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15α-二醇如實(shí)施例1d所述，在室溫下40mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15α-醇在10ml乙醚中的溶液用10mg的氫化鋁鋰處理30分鐘。柱色譜純制后，分離出25mg的4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15α-二醇白色固體(mp148℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.78-1.7(8×CH3)，3.25(dd，J＝11Hz，5Hz，1H，H-3α)，4.04(t，J＝4Hz，1H，H-15α)，5.22(m，2H，H-22/23)實(shí)施例34，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇a)4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-3β-基-苯甲酸酯1.0g的4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-3β-醇在5ml吡啶中的溶液用1.5ml的苯甲酰氯處理。在室溫下攪拌3小時(shí)后，將溶液傾倒在水中，并用乙酸乙酯萃取含水層。合并有機(jī)層，并用0.1N鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，過(guò)濾并減壓濃縮，所得油狀物進(jìn)行柱色譜純制，得到900mg的4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-3β-基-苯甲酸酯白色固體(mp158℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.83(s，3H，H-18)，0.87+0.88(2×s，3H，H-26/27)，0.95(d，J＝6Hz，3H，H-21)，4.76(dd，J＝11Hz，5Hz，1H，H-3α)，5.38(br s，21，H-15)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.06(d，2H)b)4，4-二甲基-14，15α-環(huán)氧基-5α-膽甾-8-烯-3β-基-苯甲酸酯于0℃下攪拌4，4-二甲基-5α-膽甾-8，14-二烯-3β-基-苯甲酸酯在120ml二氯甲烷中的懸浮液，并在其中添加二甲基dioxirane溶液(130ml，0.09-0.11 M丙酮溶液)。在0℃下攪拌30分鐘后，真空濃縮反應(yīng)混合物至干。所得粗環(huán)氧化物未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。c)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮1g的4，4-二甲基-14，15α-環(huán)氧基-5α-膽甾-8-烯-3β-基-苯甲酸酯在15ml二惡烷中的溶液用0.1ml三氟化硼-乙醚復(fù)合物處理。該溶液在室溫下攪拌20分鐘，然后傾倒在飽和碳酸氫鈉水溶液中。含水層用乙酸乙酯萃取，用水和鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，然后減壓濃縮。進(jìn)行柱色譜純制，得到440mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮白色固體(mp153℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.83-1.1(7×CH3)，2.31(br s，1H，H-14β)，4.76(dd，J＝11Hz，5Hz，1H，H-3α)，7.44(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)d)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮(440mg，0.83mmol)在無(wú)水四氫呋喃(15ml)和甲醇(1ml)中的溶液在室溫下用硼氫化鈉(125mg)處理。2小時(shí)后，將溶液傾倒在0.1N鹽酸中，并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水及鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過(guò)濾，然后減壓濃縮，得到白色泡沫狀物質(zhì)，其未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。e)4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯500mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇在10ml二氯甲烷中的溶液冷卻至0℃，然后一次性添加1.1g的Martin′s sulfurane。反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)。真空除去溶劑。通過(guò)色譜法純制殘留物，得到315mg的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯，其為蠟狀固體，并直接使用。f)4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇如實(shí)施例1d所述，315mg的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯在無(wú)水乙醚中的溶液用35mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜純制，并隨后重結(jié)晶，得到135mg白色針狀的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇(mp138℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.81(s，3H，H-18)，0.83-1.02(6×CH3)，2.49(brs，1H，H-14β)，3.24(m，1H，H-3α)，5.64+5.79(2×m，1H，H-15/16)實(shí)施例44，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇a)(20S)-3β-苯甲酰氧基-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-15-酮以及(20S)-3β-苯甲酰氧基-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-15β-醇將2.18g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮(實(shí)施例1c)在88ml二氯甲烷、30ml甲醇和1ml吡啶中的溶液冷卻至-70℃。在該溶液中通入臭氧/氧混合物(1∶4)12分鐘(用TLC色譜進(jìn)行控制)。
添加130mg硼氫化鈉，并使經(jīng)攪拌的反應(yīng)混合物在2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)溫?zé)嶂?℃，然后傾倒在飽和氯化銨水溶液中。用乙酸乙酯萃取該溶液，經(jīng)合并的萃取物進(jìn)一步用水和鹽水洗滌，然后在硫酸鈉上干燥。過(guò)濾該溶液，并真空蒸發(fā)。粗產(chǎn)物通過(guò)色譜純制，得到1.28g的(20S)-3β-苯甲酰氧基-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-15-酮(mp238.8℃)以及330mg相應(yīng)的15β-羥基化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.9-1.1(4×CH3)，1.16(d，J＝6Hz，3H，H-21)，2.33(br s，1H，H-14β)，3.42(m，1H，H-22a)，3.63(m，1H，H-22b)，4.75(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)b)(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-21-甲苯磺?；趸?5α，14β-孕-8-烯-15-酮使385mg的(20S)-3β-苯甲酰氧基-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-15-酮在5ml吡啶中的溶液冷卻至0℃。添加190mg對(duì)甲苯磺酰氯后，在6℃下攪拌反應(yīng)混合物20小時(shí)，然后傾倒在鹽水中，并攪拌20分鐘。收集沉淀物，用冰水洗滌，然后在真空中于50℃下干燥。粗產(chǎn)物(500mg)未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。c)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮在攪拌和50℃下將3.42g的2-甲基丙基溴于30分鐘的時(shí)間內(nèi)緩慢地添加在鎂(粉末1.6g)在25ml無(wú)水四氫呋喃中的懸浮液內(nèi)，形成澄清的格氏試劑溶液。之后將混合物冷卻至-10℃并滴加3.32ml的Li2CuCl4溶液(其是通過(guò)混合99mg氯化銅、86mg氯化鋰和10ml四氫呋喃而制得的)。
在-30℃下將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，然后在0℃下添加0.5g(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-21-甲苯磺酰基氧基-5α，14β-孕-8-烯-15-酮在10ml四氫呋喃中的溶液。在0℃下2小時(shí)后，在室溫下攪拌混合物過(guò)夜。添加乙酸乙酯以及飽和氯化銨溶液，并攪拌該溶液15分鐘。有機(jī)萃取物用1N鹽酸、水及鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，然后蒸發(fā)至干。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜純制，得到250mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮，其為白色泡沫狀物質(zhì)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82-1.09(7×CH3)，2.31 (br s，1H，H-14β)，4.75(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.44(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)d)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇如實(shí)施例2a所述，130mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3-酮用100mg的硼氫化鈉處理。加水處理，得到130mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇，其為白色泡沫狀物質(zhì)，而且未經(jīng)純制直接使用。e)4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯將400mg的Martin′s sulfurane一次性添加在100mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇在10ml二氯甲烷中的溶液內(nèi)。在室溫下攪拌該混合物18小時(shí)。減壓蒸發(fā)并進(jìn)行色譜純制，得到100mg油狀的4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯，其未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。f)4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇如實(shí)施例1d所述，100mg的4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-基-苯甲酸酯用20mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物用柱色譜分離，然后進(jìn)行重結(jié)晶(己烷/乙酸乙酯)，得到36mg的4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇(mp104.3℃)1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H，H-18)，0.83-1.03(6×CH3)，2.49(brs，1H，H-14β)，3.24(m，1H，H-3α)，5.65+5.8(m，1H，H-15/16)實(shí)施例54，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇a)15β-甲烷磺?；趸?4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-基苯甲酸酯40mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇在3ml吡啶中于0℃下用0.2ml的甲烷磺酰氯處理。在室溫下攪拌2小時(shí)后，反應(yīng)混合物用水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取。萃取物合并，然后用1N鹽酸、水及鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，然后過(guò)濾。除去溶劑，得到40mg的15β-甲烷磺?；趸?4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-基苯甲酸酯，其未進(jìn)行純制即直接使用。b)4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇如實(shí)施例1d所述，44mg的15β-甲烷磺?；趸?4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-基苯甲酸酯用10mg氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)色譜純制，得到32mg的4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.81(s，3H，H-18)，0.82-1.03(6×CH3)，3.25(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)實(shí)施例64，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15β-二醇如實(shí)施例1d所述，30mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-15β-醇用10mg氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)色譜純制，得到23mg的4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾，-8-烯-3β，15β-二醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H，H-18)，0.84-1.04(6×CH3)，3.25(brd，J＝12Hz，1H，H-3α)，3.7(br q，J＝7Hz，1H，H-15α)實(shí)施例7+8(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇和(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15α-二醇a)(20R)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-15-酮類似于實(shí)施例4c，1.10g的(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-21-甲苯磺?；趸?5α，14β-孕-8-烯-15-酮用52mmol的苯基溴化鎂處理。色譜純制后，得到560mg的(20R)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-15-酮，另外還有通過(guò)苯基格氏試劑由甲苯磺酸酯取代產(chǎn)生的其他產(chǎn)物。b)(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇和(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15α-二醇如實(shí)施例1d所述，460mg的(20R)-3β-苯甲酰氧基-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-15-酮用50mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜純制后得到40mg的(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇和30mg的(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15α-二醇。
(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.73(s，3H，H-18)，0.82(s，3H，H-19)，1.02(s，6H，4-CH3)，1.09(d，J＝8Hz，3H，H-21)，2.72(m，1H，H-16α)，3.25(m，1H，H-3α)，4.07(q，J＝8Hz，1H，H-15α)(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15α-二醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.79(s，3H，H-18)，0.85(s，3H，H-19)，1.0-1.08(3×CH3)，2.34(d，J＝6Hz，3H，H-14β)，2.68(m，1H，H-16α)，3.25(m，1H，H-3α)，4.07(q，J＝8Hz，1H，H-15β)實(shí)施例94，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-3β，15β-二醇a)(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-15-氧代-5α，15β-孕-8-烯-20-甲醛將2.2g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-15-酮在87ml二氯甲烷和53ml甲醇中的溶液冷卻至-78℃。在該溶液中通入臭氧/氧混合物(1∶4)共16分鐘。添加2.62g的三苯基膦，并使溶液達(dá)到室溫。真空除去溶劑，而殘留物通過(guò)色譜純制，得到1.26g的(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-15-氧代-5α，15β-孕-8-烯-20-甲醛(mp205℃)。
1H-NMR(d5-吡啶)δ＝0.90(s，3H，H-19)，0.98(s，3H，H-18)，1.04(s，6H，4-CH3)，1.2(d，J＝6Hz，3H，H-21)，2.41 (br s，1H，H-14β)，4.83(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.5(t，2H)，7.58(t，1H)，8.27(d，2H)，9.82(d，J＝2Hz，1H，H-22)b)3β-苯甲酰氧基-22-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮在-78℃下將2.58ml的正丁基鋰溶液(1.6M己烷溶液)添加在6ml二異丙基酰胺在48ml四氫呋喃中的溶液內(nèi)。該混合物攪拌20分鐘。添加4.5ml的3-甲基-2-丁酮在10ml四氫呋喃中的溶液，然后在-78℃下攪拌混合物15分鐘。在氮?dú)庵袑⑺脛?dòng)態(tài)烯醇化物通過(guò)導(dǎo)管轉(zhuǎn)移至6.0g的(20S)-3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-15-氧代-5α，14β-孕-8-烯-20-甲醛在40ml四氫呋喃中的冷溶液(-78℃)內(nèi)。在1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)使混合物達(dá)到0℃，然后傾倒在飽和氯化銨水溶液中。該混合物用乙酸乙酯萃取，合并的有機(jī)萃取物進(jìn)一步用水及鹽水洗滌，然后在硫酸鈉上干燥。真空除去溶劑，所得殘留物通過(guò)柱色譜分離，得到6.26g油狀的3β-苯甲酰氧基-22-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.9-1.2(7×CH3)，2.33(br s，1H，H-14β)，4.1(m，1H，H-22)，4.74(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)c)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，22-二烯-15，24-二酮將4.78g的3β-苯甲酰氧基-22-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮在60ml二氯甲烷中的溶液冷卻至0℃，然后一次性添加9.31g的Martin′s sulfurane。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘。真空除去溶劑。通過(guò)柱色譜純制殘留物，得到4.18g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，22-二烯-15，24-二酮(mp163℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.9-1.2(7×CH3)，2.31(br s，1H，H-14β)，4.75(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，6.14(d，J＝16Hz，1H，H-23)，6.71(m，1H，H-22)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)d)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮將500mg的鈀-碳(10％)添加在4.2g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，22-二烯-15，24-二酮在60ml乙酸乙酯中的溶液內(nèi)。在氫氣氛中攪拌混合物3小時(shí)。過(guò)濾混合物。真空除去溶劑，得到4.22g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮(mp129℃)，其為白色晶體狀物質(zhì)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.92-1.16(7×CH3)，2.33(br s，1H，H-14β)，4.74(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)e)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二醇和3β-苯甲酰氧基-24-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮4.2g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二酮在45ml二氯甲烷中的溶液用1.8g的叔丁基胺-硼烷復(fù)合物處理。該溶液回流1小時(shí)。冷卻至0℃后，添加30ml的1N鹽酸水溶液。混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。用1N鹽酸水溶液、水、飽和碳酸氫鈉水溶液以及鹽水洗滌。在硫酸鈉上干燥后，真空除去溶劑。柱色譜純制得到1.71g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二醇和1.82g的3β-苯甲酰氧基-24-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮，它們是白色泡沫狀物質(zhì)。
3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.88-1.1(7×CH3)，3.33(m，1H，H-24)，3.74(m，1H，H-15)，4.75(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)3β-苯甲酰氧基-24-羥基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15-酮1H-NMR(CDCl3)δ＝0.88-1.1(7×CH3)，2.32(br s，1H，H-14β)，3.33(m，1H，H-24)，4.74(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)f)3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-15β-醇和4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-基-苯甲酸酯如實(shí)施例3e所述，1.0g的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-15，24-二醇用3.88g的Martin′s sulfurane處理。柱色譜純制，得到305mg白色泡沫狀的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-15β-醇和870mg白色固體狀的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-基-苯甲酸酯。
3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-15β-醇1H-NMR(d5-吡啶)δ＝1.15(s，1H，H-18)，2.84(m，1H，H-7α)，4.1(m，1H，H-15)，4.93(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，5.24(t，J＝8Hz，1H，H-24)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-基-苯甲酸酯1H-NMR(CDCl3)δ＝1.4(s，1H，H-19)，2.19(m，1H，H-7α)，2.51 (brs，1H，H-14β)，4.75(dd，J＝11Hz，4Hz，1H，H-3α)，5.1(t，J＝8Hz，1H，H-24)，5.65(m，1H，H-16)，5.79(m，1H，H-15)，7.45(t，2H)，7.57(t，1H)，8.05(d，2H)g)4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-3β，15β-二醇如實(shí)施例1d所述，120mg的3β-苯甲酰氧基-4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-15β-醇用30mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)快速柱色譜純制，得到80mg白色泡沫狀的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-3β，15β-二醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.8-1.03(5×CH3)，1.6+1.68(2×s，3H，H-26/27)，3.24(m，1H，H-3α)，3.70(m，1H，H-15α)，5.10(t，J＝7Hz，1H，H-24)實(shí)施例104，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-醇如實(shí)施例1d所述，30mg的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-基苯甲酸酯(實(shí)施例9f)用20mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜純制，得到20mg白色固體的4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-醇(mp105℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.81(s，3H，H-18)，0.94-1.02(4×CH3)，2.5(br s，1H，H-14β)，3.23(m，1H，H-3α)，5.11(t，J＝9Hz，1H，H-24)，5.64(m，1H，H-15/16a)，5.79(m，1H，H-15/16b)實(shí)施例11(20S)-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇如實(shí)施例1d所述，60mg的(20S)-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇用20mg的氫化鋁鋰處理。粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜純制，得到42mg的(20S)-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇(mp214℃)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H，H-18)，0.93-1.04(3×CH3)，1.07(d，J＝6Hz，3H，H-21)，3.23(m，1H，H-3α)，3.49(m，1H，H-22a)，3.68(m，1H，H-22b)，3.72(m，1H，H-15α)實(shí)施例12在卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中測(cè)試減數(shù)分裂活化物質(zhì)動(dòng)物由未成熟的體重為13-16克的雌性小鼠(C57B1/6J×DBA/2J F1-雜交，Bomholtgaard，Denmark)得到卵母細(xì)胞，所述小鼠在受控的光照和溫度下飼養(yǎng)。小鼠接受腹膜內(nèi)注射0.2ml的促性腺激素(Gonal F.Serono，Solna，Sweden，包含20 IU FSH，或者，Puregon，Organon，Swords，Ireland，包含20 IU FSH)，48小時(shí)后通過(guò)頸錯(cuò)位將動(dòng)物殺死。卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)剝離出卵巢，使用一對(duì)27號(hào)針手工破壞卵泡，在立體顯微鏡下于Hx-培養(yǎng)基(見(jiàn)下)中分離卵母細(xì)胞。球形的裸卵母細(xì)胞(NO)顯示出完整的生發(fā)泡(GV)，將其放置在α-最小基本培養(yǎng)基(α-MEM，不含核糖核苷，Gibco BRL，目錄號(hào)22561)中，該培養(yǎng)基中添加有3mM的次黃嘌呤(Sigma，目錄號(hào)H-9377)、8mg/ml的人血清白蛋白(HAS，State SerumInstitute，Denmark)、0.23mM的pyrubate(Sigma，目錄號(hào)S-8636)、2mM的谷氨酰胺(Flow目錄號(hào)16-801)、100 IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素(Flow，目錄號(hào)16-700)。該培養(yǎng)基稱為Hx-培養(yǎng)基。卵母細(xì)胞在Hx-培養(yǎng)基中淋洗3次，然后在4孔培養(yǎng)板(Nuncion，Denmark)中培養(yǎng)，在各孔中包含0.4ml的Hx-培養(yǎng)基和35-45個(gè)卵母細(xì)胞。對(duì)照(在沒(méi)有添加測(cè)試化合物的Hx-培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵母細(xì)胞35-45個(gè))用測(cè)試培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行，該測(cè)試培養(yǎng)基具有不同濃度的待測(cè)化合物。
在37℃、100％濕度、5％CO2空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為22-24小時(shí)。卵母細(xì)胞的檢查在培養(yǎng)期結(jié)束后，使用立體顯微鏡或者具有微分干涉相差設(shè)備的倒置顯微鏡計(jì)數(shù)具有生發(fā)泡(GV)或生發(fā)泡破碎(GVB)的卵母細(xì)胞以及具有極體(PB)的卵母細(xì)胞的數(shù)量。在測(cè)試培養(yǎng)基中計(jì)算總卵母細(xì)胞數(shù)量中具有GVB的卵母細(xì)胞百分比以及總卵母細(xì)胞數(shù)量中具有PB的卵母細(xì)胞的百分比，并與對(duì)照培養(yǎng)基相比。實(shí)施例13在卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中測(cè)試減數(shù)分裂抑制物質(zhì)使用如實(shí)施例12中描述的相同方法(見(jiàn)上)，由經(jīng)過(guò)FSH處理的未成熟的雌性小鼠中得到生發(fā)泡(GV)卵母細(xì)胞。裸露的卵母細(xì)胞(NO)在Hx-培養(yǎng)基中淋洗3次。以前已表明4，4-二甲基膽甾-8，14，24-三烯-3β-醇(FF-MAS)可在體外誘導(dǎo)NO中的減數(shù)分裂(Byskov，A.G.等人，Nature 374(1995)559-562)。于4孔培養(yǎng)板(Nunclon，Denmark)中NO在Hx-培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加有5μM的FF-MAS，并與不同濃度的測(cè)試化合物共同培養(yǎng)，各孔包含0.4ml的Hx-培養(yǎng)基和35-45個(gè)卵母細(xì)胞。一個(gè)正對(duì)照(在包含F(xiàn)F-MAS的Hx-培養(yǎng)基中培養(yǎng)的35-45個(gè)卵母細(xì)胞，其中不添加測(cè)試化合物)總是用測(cè)試培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行，該測(cè)試培養(yǎng)基中添加有不同濃度的待測(cè)試化合物。另外，與正對(duì)照同時(shí)進(jìn)行一個(gè)負(fù)對(duì)照(僅在Hx-培養(yǎng)基中培養(yǎng)的35-45個(gè)卵母細(xì)胞)。卵母細(xì)胞的檢查在培養(yǎng)期結(jié)束后，使用立體顯微鏡或者具有微分干涉相差設(shè)備的倒置顯微鏡計(jì)數(shù)具有生發(fā)泡(GV)或生發(fā)泡破碎(GVB)的卵母細(xì)胞以及具有極體(PB)的卵母細(xì)胞的數(shù)量。在測(cè)試培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基(正和負(fù)對(duì)照)中計(jì)算總卵母細(xì)胞數(shù)量中具有GVB+PB的卵母細(xì)胞百分比。測(cè)試化合物的相對(duì)抑制作用根據(jù)以下等式計(jì)算測(cè)試化合物的抑制作用(％)＝100％-[(GVB+PB(測(cè)試化合物)-GVB+PB(負(fù)對(duì)照))×100/GVB+PB(正對(duì)照)-GVB+PB(負(fù)對(duì)照)]％在減數(shù)分裂中停止的卵母細(xì)胞的特征是具有完整的核，該核具有主要的已知稱為胚泡的核仁(GV)。在重新啟動(dòng)減數(shù)分裂時(shí)，核仁及核膜消失，而且具有GV破碎的特征，這就稱為胚泡破碎(GVB)。幾小時(shí)后，卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂，并誘發(fā)第一個(gè)所謂的極體(PB)。結(jié)果表1在裸露的鼠卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂的相對(duì)抑制活性
Hx＝次黃嘌呤，GV＝生發(fā)泡，GVB＝生發(fā)泡碎片PB＝極體，n＝卵母細(xì)胞數(shù)量
權(quán)利要求
1.通式I的化合物或其酯 其中R3代表氫原子或者與R3′一起代表額外的鍵，R3′代表氫原子或者與R3一起代表額外的鍵，R4代表氫原子或者甲基，R4′代表氫原子或者甲基，R7代表氫原子或者與R8一起代表額外的鍵，R8代表氫原子或者與R7或與R9一起代表額外的鍵，R9代表氫原子或者與R8或與R11一起代表額外的鍵，R15代表氫原子、羥基、鹵原子或者與R15′一起代表氧代基團(tuán)或者與R16一起代表額外的鍵或者與R22′一起代表氧橋，R15′代表氫原子、C1-C8直鏈或支鏈烷基、C6-C10芳基或者與R15一起代表氧代基團(tuán)，R16代表氫原子、羥基、鹵原子或者與R15一起代表額外的鍵或者與R22一起代表額外的鍵，R22代表氫原子、C1-C8直鏈或支鏈并任選取代的烷基或者烯基、任選取代的C6-C10芳基或者與R16一起代表額外的鍵或者與R22′一起代表C1-C8直鏈或支鏈亞烷基，R22′代表氫原子、羥基或者與R15一起代表氧橋或者與R22一起代表C1-C8直鏈或支鏈亞烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R3和R3’代表氫原子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中R8和R9一起代表另一個(gè)鍵。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的化合物，其中R15代表氫原子或羥基。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的化合物，其中R22代表C1-C8直鏈或支鏈并任選取代的烷基或者與R22’一起代表C1-C8直鏈或支鏈亞烷基。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的化合物，其是以下化合物4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-7，9(11)，15-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，23(E)-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15，24-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，24-二烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，22-二烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，15，22-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β-醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15β-二醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8-烯-3β，15α-二醇，4，4-二甲基-24-去甲-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α，14β-膽甾-8，15-二烯-3β-醇?xì)涠《狨ィ?，4-二甲基-5α，14β-麥角甾-8，15，22-三烯-3β-醇?xì)涠《狨ィ?20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15α-二醇，(20R)-4，4，20-三甲基-16β，21-環(huán)-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇，(20S)-20-羥甲基-4，4-二甲基-5α，14β-孕-8-烯-3β，15β-二醇。
7.藥物組合物，其包含一種或更多種如權(quán)利要求1-6之一所述的通式I化合物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑。
8.如權(quán)利要求1-6之一所述的通式I化合物在制備調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其是用于制備雌性或雄性、優(yōu)選人用避孕藥。
10.調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的方法，其包括向需要該調(diào)節(jié)作用的患者給藥有效量的一種或多種如權(quán)利要求1-6之一所述的通式I化合物。
11.甾醇中的14β-氫基團(tuán)在增加減數(shù)分裂抑制性物質(zhì)的抑制活性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物活性的14β－H－甾醇、包含這些甾醇的藥物組合物以及新的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。更具體而言,發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的14β－H－甾醇可用于調(diào)節(jié)減數(shù)分裂。
文檔編號(hào)A61K31/56GK1350543SQ00807346
公開(kāi)日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月10日
發(fā)明者彼得·埃斯佩林, 約阿希姆·庫(kù)恩克, 亨利·洛朗, 托爾斯滕·布盧姆, 克麗斯塔·黑格勒－哈通, 莫尼卡·萊塞爾 申請(qǐng)人:舍林股份公司