專利名稱：基因重組蛛絲蛋白－高聚物組織工程多孔支架材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體說涉及一種組織工程支架材料，尤其是重組蛛絲蛋白-高聚物多孔支架材料。
背景技術(shù)：
組織和器官的衰竭、損傷是最主要的臨床醫(yī)學(xué)問題，而目前的治療方法主要是器官移植、外科修復(fù)、人工取代物，這些方法雖然能起到一定的作用，但它們都存在這樣或那樣的不足，如器官移植是以犧牲健康組織為代價的“以傷治傷”的方法；現(xiàn)有人工取代物存在生物相容性的問題。直到20世紀(jì)80年代，美國學(xué)者提出了組織工程再生醫(yī)學(xué)，它是利用生命科學(xué)和工程科學(xué)的原理和方法，研究和開發(fā)用于替代組織或器官的一部分或全部功能的取代物(Langer R，Vacanti J P.Tissue engineering.Science，1993，260920)。組織工程的發(fā)展，提高了組織工程組織和器官的衰竭、損傷的治療水平，改善了患者的生活質(zhì)量，有效地降低醫(yī)療成本.
組織工程學(xué)研究的主要科學(xué)問題之一是可供細(xì)胞進(jìn)行生命活動的支架材料以及細(xì)胞與支架材料的相互作用，核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。理想的生物材料在組織工程中起關(guān)鍵作用，并成為組織工程研究的主流。
在生物材料的研究經(jīng)歷了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性質(zhì)之后，已發(fā)展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料(L.L.Hench etal.Science，2002，2951014)。
目前，組織工程中天然生物材料的主要是膠原蛋白，人工合成的替代物主要是聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)。要獲取理想的天然支架材料有一定困難，而且也存在一些問題，如膠原蛋白的抗原性強(qiáng)、力學(xué)強(qiáng)度不夠，在處理過程中膠原蛋白容易變性等；人工合成的替代物雖然也具有可生物降解特點(diǎn)，如美國FDA認(rèn)可的體內(nèi)植入材料，已被制成可吸收的縫線、夾板、螺釘及敷料等，但這些材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面還需改進(jìn)。因此，目前研究的著重點(diǎn)更多的是尋找可人工合成、生物相容性好、可降解的支架材料。
作為組織工程的第三代生物新材料開發(fā)，蜘蛛絲蛋白具有得天獨(dú)厚的條件。蜘蛛絲膜具有很好的透明性、生物可降解性和水-空氣界面的通透性。與膠原蛋白和彈性蛋白相似，蜘蛛絲蛋白具自裝配性質(zhì)，通過二級結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)以提供機(jī)械支撐；與聚酯比較，絲的柔韌性和彈性使其經(jīng)得起重壓和疲勞。絲蛋白生物相容性好，與膠原起同樣的細(xì)胞粘附、擴(kuò)展、分化和生長的作用。絲基質(zhì)還有機(jī)械誘導(dǎo)作用，通過調(diào)整絲基質(zhì)的硬度，提供控制基質(zhì)的最終機(jī)械特性來模仿天然機(jī)體組織的機(jī)械特性和支持宿主組織內(nèi)生長。因此它在醫(yī)學(xué)應(yīng)用、外科縫合線、生物材料襯膜和支架、細(xì)胞生長支撐支架和控制釋放基質(zhì)上表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力(Winkler S，Kaplan DL.Molecular biology of spidersilk.Reviews in Molecular Biotechnology，2000，7485)。
福建師范大學(xué)李敏等在福建省自然科學(xué)基金重大科技項目(2001F 006)、教育部重點(diǎn)項目(02072)和國家自然科學(xué)基金項目(30370414)的支持下分別于2002年(李敏，章文賢，黃建坤等.蜘蛛拖絲蛋白基因的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)，生物工程學(xué)報，2002，18(3)331)和2004年(李敏，黃建坤，涂桂云等，RGD-蜘蛛拖絲蛋白基因的構(gòu)建、表達(dá)與純化，生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004，21(6)1006)先后公開了該研究小組根據(jù)蜘蛛絲的結(jié)構(gòu)和功能特性，應(yīng)用基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)，利用原核生物表達(dá)體系，結(jié)合鳥槍法與物理圖譜法對蜘蛛拖絲蛋白全基因進(jìn)行克隆、測序與表達(dá)，構(gòu)建了多種特殊序列的蛛絲蛋白基因，建立了可生產(chǎn)化的發(fā)酵罐高密度發(fā)酵工藝條件等技術(shù)，使得公眾能以簡便易行、低成本和有效的分離純化方法規(guī)?；苽渲亟M蛛絲蛋白，為大量應(yīng)用蜘蛛絲蛋白作為組織工程新材料奠定了研究開發(fā)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有組織工程材料在生物相容性、生物降解性和機(jī)械性能的不足，本發(fā)明的目的就是根據(jù)蜘蛛絲獨(dú)特的機(jī)械特性和生物相容性以及其本質(zhì)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用已經(jīng)公開的可規(guī)?；苽涞闹亟M蜘蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物為主要原料制備生物相容性好、可降解的組織工程支架材料。該支架材料不僅能被降解成人體可吸收氨基酸，具有很好的生物相容性和較好的機(jī)械性能，且可批量生產(chǎn)。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是以基因重組蜘蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物為主要原料制備生物相容性好、可降解的支架材料。其中基因重組蜘蛛絲蛋白所占的質(zhì)量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質(zhì)量百分比為45-5％。
本發(fā)明中生物可降解的高聚物是指聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚對二氧雜環(huán)己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羥基丁酸、其他線性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲殼素、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚氧乙烯中一種或他們的組合。
本發(fā)明可以用致孔法來制備多孔支架材料，具體工藝1.配制支架制備液取基因重組蛛絲蛋白粉溶解于80-98％甲酸得到蛋白溶液，再加入高聚物，混勻即得到含基因重組蛛絲蛋白和高聚物的支架制備液。其中基因重組蛛絲蛋白所占的質(zhì)量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質(zhì)量百分比為45-5％。
2.添加致孔劑加入致孔劑如氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入模具中，置于55-90℃烘箱10-60分鐘形成支架。
4.變性將支架浸泡在變性劑溶液(如乙醇)中變性10-15小時后取出，置于蒸餾水浸泡8-12小時。
5.冷凍干燥變性后的支架于-70℃冷凍干燥1-5小時即可得多孔支架材料。
本發(fā)明的有益效果是1.采用基因重組蛛絲蛋白制得的多孔支架材料，由于它的本質(zhì)是天然蛋白質(zhì)分子，使它具有了很好的生物相容性和可降解性。
2.加入生物可降解的高聚物不僅進(jìn)一步提高多孔支架機(jī)械性能、調(diào)控泡沫支架材料的可降解特性，而且也有利于降低泡沫支架的成本。
3.支架的加工工藝簡單，成本低，對于工業(yè)化大批量生產(chǎn)也適合。
附1、圖2是泡沫支架材料外觀圖。
圖3、圖4是泡沫支架材料剖面掃描電鏡圖。
下面根據(jù)實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
具體實施例方式
實施例11.配制支架制備液取2.25g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于7.5ml 98％甲酸得到30％(w/v)蛋白溶液，再加入0.45g聚乙烯醇，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白和聚乙烯醇的支架制備液。
2.添加致孔劑加入1.5g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入圓柱形模具(R＝2cm)中，放入70℃烘箱30分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性15小時，蒸餾水浸泡10小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍2小時即可得多孔支架材料。
實施例21.配制支架制備液取2.5g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于10ml98％甲酸得到25％(w/v)蛋白溶液，加入1.25g殼聚糖，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白和殼聚糖的支架制備液。
2.添加致孔劑加入2.0g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入長方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入60℃烘箱20分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性10小時，蒸餾水浸泡8小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍4小時即可得多孔支架材料。
實施例31.配制支架制備液取2g基因重組蛛絲蛋白粉溶解于6ml98％甲酸得到33％(w/v)蛋白溶液，再加入1.0g殼聚糖和0.25g聚乙烯醇，混勻，即得到含基因重組蛛絲蛋白、殼聚糖和聚乙烯醇的支架制備液。
2.添加致孔劑加入1.0g致孔劑氯化鈉，混勻。
3.倒模、加熱將添加有致孔劑的支架制備液倒入長方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入65℃烘箱30分鐘。
4.變性、蒸餾水浸泡將支架浸泡在乙醇中變性13小時，蒸餾水浸泡12小時。
5.冷凍干燥變性后的支架，-70℃冷凍3小時即可得多孔支架材料。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種組織工程多孔支架材料，其特征在于以基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物共混得到多孔支架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，制備多孔支架材料的蛋白質(zhì)是基因重組蛛絲蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，制備多孔支架材料的高聚物是生物可降解的高聚物，包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚對二氧雜環(huán)己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羥基丁酸、其他線性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲殼素、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚氧乙烯等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述，制備多孔支架材料的高聚物可以是其中的一種或他們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物的配比(質(zhì)量比)為基因重組蛛絲蛋白所占的質(zhì)量百分比為55-95％，生物可降解的高聚物所占的質(zhì)量百分比為45-5％。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料科學(xué)工程領(lǐng)域，涉及一種組織工程支架材料，尤其是多孔支架材料。本發(fā)明以基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物共混得到組織工程支架材料，基因重組蛛絲蛋白和生物可降解的高聚物的配比(質(zhì)量比)為基因重組蛛絲蛋白所占的質(zhì)量百分比為55－95％，生物可降解的高聚物所占的質(zhì)量百分比為45－5％。本發(fā)明得到的多孔支架材料具有很好的生物相容性、可降解性和較優(yōu)越的機(jī)械特性，不僅加工工藝簡單、成本低，而且也適合工業(yè)化批量生產(chǎn)。
文檔編號A61L27/56GK1751748SQ200510076750
公開日2006年3月29日 申請日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者李敏, 陳登龍, 涂桂云, 黃曦, 周志華 申請人:福建師范大學(xué)