專(zhuān)利名稱(chēng)：重組腺病毒tmem166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒TMEM166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用，特別涉及含有該重組腺病毒TMEM166的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因治療藥物，并且本發(fā)明還涉及該重組腺病毒TMEM166與化療藥物聯(lián)合給藥來(lái)制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物體的一切生命活動(dòng)，從出生、成長(zhǎng)、衰老、到出現(xiàn)疾病直至死亡都與基因有夫，基因調(diào)控著細(xì)胞的各種功能。人們現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腫瘤是基因異常的疾病，而惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率較高，已經(jīng)成為危害人類(lèi)生命的第一、二位殺手。近年來(lái)，關(guān)于腫瘤治療，基因治療尤為引人注目，到目前為止提出了各種各樣的基因治療法，并進(jìn)行了臨床試驗(yàn)(例如 參見(jiàn) Freeman SM, Whartenby KA, Freeman JL, Abboud CN, Marrogi AJ. In situ use ofsuicide genes for cancer therapy. Semin Oncol. 1996Feb ；23(1) :31-45.)?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技木。目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問(wèn)題是有效性和安全性。事實(shí)上，自1995年以來(lái)，全世界基因治療領(lǐng)域的科學(xué)家們?cè)诟纳苹驅(qū)胂到y(tǒng)和載體方面作了大量的努力，新思路、新技術(shù)和新方法層出不窮。目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩大主流一是非病毒載體系統(tǒng)；ニ是病毒載體系統(tǒng)。由于非病毒系統(tǒng)導(dǎo)入基因的效率相對(duì)較差，故在基因治療臨床試驗(yàn)中的使用率不到20% ;病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，大約70%的治療方案采用了病毒載體，包括各種逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘病毒等。其中腺病毒載體是基因治療中最常用的病毒載體，它具有包裝容量較大、制備方便且易純化和濃縮、宿主范圍廣、感染效率高等特點(diǎn)(例如參見(jiàn)Deng Hong-Xin, Tian Ling, WeiYu—Quan.しurrent status,problems and prospects in gene therapy. Chinese Bulletinof Life Sciences. 2005 ; 17 (3) 196-200 ；Kovesdi I, Brough D. E, Bruder J.T. andWickham T. J. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin Biotechnol,1997,8:583-589.)。廣為人知的重組人p53腺病毒自1995年在美國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，目前已有51項(xiàng)各種臨床試驗(yàn)方案在世界各國(guó)實(shí)施，涉及到如肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、腦瘤等多種類(lèi)型的腫瘤治療(例如參見(jiàn)Nie B, Shen Z, Wen J. B, Wong 0. G, Hsueh ff. D, HuoL.F, Kung H. F, Jiang B and Lin M. C. 2008. AAV-HGFK1 and Ad_p53 cocktail therapyprolongs survival of mice with colon cancer. Mol Cancer Ther 7 :2855-2865. ；Yoo,G. Η. , M. P. Piechocki, J. Oliver, F. Lonardo, L. Zumstein, H. S. Lin, H. Kim, T. Y. Shibuya,N. bhehadeh,and j. F. Ensley. Enhancement of Ad_p53 therapy with docetaxel in headand neck cancer. Laryngoscope,2004,114 1871-1879. ；Swisher, S. G. , and J. A. Roth.Clinical update of Ad_p53 gene therapy for lung cancer. Surg Oncol Clin N Am,2002，11 :521-535.)。
程序性細(xì)胞死亡(programmed Cell Death, PO))是細(xì)胞的一種主動(dòng)死亡過(guò)程，基于形態(tài)可以將P⑶分為兩型，I型P⑶又稱(chēng)凋亡性細(xì)胞死亡，II型P⑶又稱(chēng)自噬性細(xì)胞死亡、例如參見(jiàn) Levine B and Daniel Klionsky J. Development by self-digestion:molecular mechanisms and Diological functions of autophagy.Dev cell,2004,6(4)463-477 ；Xiang J, Chao DT, Korsmeyer SJ.BAX-induced cell death may not requireinterleukin I β -converting enzyme-like proteases. Proc Natl Acad Sci,1996,93 :14559-14563)自噬性細(xì)胞死亡與凋亡在生化指標(biāo)、參與分子和機(jī)理方面均有密不可分的關(guān)系，在某些情況下可以相互拮抗或促進(jìn)，可先后發(fā)生或同時(shí)共存于同一細(xì)胞(例如參見(jiàn) Cuervo AM. Autophagy in sickness ana in health. Trends Cell Biol, 2004,14(2) :70-77 ；bhmtani T. Autophagy in health and disease a double-edged sword.Science, 2004，306 (5698) :990-995)。對(duì)自噬研究的不斷深入，不僅進(jìn)ー步掲示了真核生物自身調(diào)控的復(fù)雜性和多祥性，更為腫瘤的治療提供了新的思路。大量研究表明，在多種人類(lèi)腫瘤中存在有自噬活性的降低，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系(例如參見(jiàn)Bertin b, Pierrefite-uarle Autopnagy and toll-like receptors a new link in cancercells. Autophagy. 2008 Nov 16 ；4(8) :1086-1089)。目前人們已經(jīng)將干預(yù)腫瘤細(xì)胞自卩遼作為為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)和檢測(cè)腫瘤藥物療效的新靶點(diǎn)。本發(fā)明人利用突光素酶報(bào)告基因方法(例如參見(jiàn)Lorenz ffff,Longiaru M,CormierMJ. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ;88 (10) :4438-42.)篩選出一個(gè)能夠明顯下調(diào)內(nèi)參活性并且同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的新基因TMEM166。通過(guò)TMEM166的表達(dá)，可以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，同時(shí)為研制治療癌癥的重組腺病毒基因治療藥物奠定了基礎(chǔ)。TMEM166是ー種定位于溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新型跨膜蛋白(例如參見(jiàn)Wang L.，Yu C，Lu Y, He P, Guo J, Zhang C，Song Q, Ma D, Shi T and Chen Y. TMEM 166，a noveltransmembrane protein, regulates cell autophagy and apoptosis. Apoptosis, 200(,12 :1489-1502.)。過(guò)表達(dá)TMEM166，可以明顯抑制Hela細(xì)胞的克隆形成，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，形態(tài)學(xué)的改變具有細(xì)胞自噬和凋亡的雙重特征，且自噬的發(fā)生早于凋亡的出現(xiàn)。提示TMEM166可能具有調(diào)節(jié)凋亡和自噬的雙重作用。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們也構(gòu)建了腺病毒TMEM166，希望利用腺病毒載體的優(yōu)越性進(jìn)ー步探討TMEM166的抗腫瘤活性，為其真正作為腫瘤基因治療試劑奠定基礎(chǔ)(例如參JAL Roth, J. A. 2006. Adenovirus p53 gene therapy. Expert Opin Biol Ther 6:55-61·)。前期結(jié)果顯示，利用制備的兔抗人TMEM166特異性抗體，結(jié)合組織芯片、免疫組化的方法，以及實(shí)時(shí)定量PCR分析了人體正常組織和腫瘤組織中TMEM166的表達(dá)情況，證明腫瘤細(xì)胞中TMEM166的表達(dá)明顯下調(diào)，在正常組織中高表達(dá)，提示TMEM166可能是潛在的腫瘤基因治療靶點(diǎn)(例如參見(jiàn) He P，Peng Z，Luo Y，Wang L，Yu P，Deng ff, An Y，Shi Tand Ma D. High—throughput functional screening for autophagy—reiated genes andidentification of TM9SF1 as an autophagosome-inducing gene. Autophagy,2009,5 52-60.)。構(gòu)建了 TMEM166腺病毒重組表達(dá)載體(人重組Ad5_TMEM166)。本發(fā)明利用腺病毒重組表達(dá)載體人重組Ad5-TMEM166進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，以期闡明TMEM166的抗腫瘤活性。體外的研究證明TMEM166抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人重組Ad5-TMEM166感染對(duì)于食管癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，在TMEM166感染的腫瘤組織中，出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡、外圍血管密度降低、組織缺血壞死等，表明腺病毒介導(dǎo)的TMEM166轉(zhuǎn)基因具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種含有人TMEM166基因的重組腺病毒。本發(fā)明所提供的重組腺病毒，是將人TMEM166基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、人TMEM166的cDNA和終止子。所述人TMEM166基因的表達(dá)盒中，啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子，所述終止子為SV40的終 止子。所述人TMEM166基因的表達(dá)盒還包括SV40polyA信號(hào)序列。所述人TMEM166基因的表達(dá)盒通過(guò)如下方法插入Ad5的基因組DNA中利用pAdxsi系統(tǒng)(microbix公司，購(gòu)自本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司)將人TMEM166的cDNA插入pShuttle-CMV的多克隆位點(diǎn)區(qū)，然后將重組后pShuttle-CMV-TMEM166中的TMEM166表達(dá)盒經(jīng)酶切后連接到pAdxsi載體上，最后將重組后Ad5-TMEM166轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，得到含有TMEM166基因的重組腺病毒。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因治療藥物。該基因治療藥物可用于非實(shí)體瘤細(xì)胞或?qū)嶓w瘤細(xì)胞。本發(fā)明還進(jìn)ー步提供了該基因治療藥物在制備與化療藥物聯(lián)合給藥來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。該化療藥物可以是任何ー種化療藥物，優(yōu)選3-MA和LY294002。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的重組腺病毒在體內(nèi)外均有抗腫瘤活性。本發(fā)明的重組腺病毒可廣泛用于腫瘤的基因治療。


圖IA為pShuttle_TMEM166的BamHI和EcoR I雙酶切鑒定電泳IB為人重組Ad5_TMEM166的鑒定圖譜圖 2A Western Blot 檢測(cè)人重組 Ad5_TMEM166 在 MGC803、SGC7901、AGS、U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，呈濃度依賴(lài)性圖 2B Western Blot 檢測(cè)人重組 Ad5-TMEMl66 在 U20S、Saos-2, BGC823, KYSE150腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，呈時(shí)間依賴(lài)性圖3A CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人重組 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫瘤細(xì)胞存活率，呈時(shí)間依賴(lài)性圖3B CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人重組 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫
瘤細(xì)胞存活率，呈濃度依賴(lài)性圖4 人重組 Ad5-TMEM166 誘導(dǎo) U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。A :共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3的斑點(diǎn)狀定位；B :統(tǒng)計(jì)學(xué)分析人重組Ad5_TMEM166誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)GFP-LC3斑點(diǎn)細(xì)胞的數(shù)目；C =Western Blot檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)GFP-LC3-I蛋白的變化圖5Western Blot檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166誘導(dǎo)U20S、Saos_2腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)P62蛋白的變化圖 6Western Blot 檢測(cè)人重組 Ad5_TMEM166 誘導(dǎo) U20S、Saos-2, BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)mT0R/p70S6K信號(hào)通路的變化圖7A 流式細(xì)胞術(shù)分析人重組 Ad5-TMEM166 誘導(dǎo) U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150 腫瘤細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴(lài)性圖7B流式細(xì)胞術(shù)分析人重組Ad5_TMEM166誘導(dǎo)U20S腫瘤細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間依賴(lài)性 圖8熒光分光光度計(jì)檢測(cè)人重組Ad5-TMEM166誘導(dǎo)U20S、KYSE150的腫瘤細(xì)胞Caspase-3 活性圖9流式細(xì)胞術(shù)分析人重組Ad5-TMEM166對(duì)相對(duì)正常HEK293細(xì)胞的影響圖10為Ex vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5_TMEM166對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A :分析細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠成瘤性；B :第20天處死裸鼠取出瘤體并稱(chēng)重；C :腫瘤組織照片；D :動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠動(dòng)物體重。圖11為In vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5_TMEM166對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A :分析細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠成瘤性；B :第20天處死裸鼠取出瘤體并稱(chēng)重；C :腫瘤組織照片；D :動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠動(dòng)物體重。圖12為In vivo實(shí)驗(yàn)免疫組化方法檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166對(duì)移植瘤細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)。A :免疫組化方法分析細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5_TMEM166組腫瘤細(xì)胞Ki-67的表達(dá)；B :統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果圖13為In vivo實(shí)驗(yàn)=TUNEL方法檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。A =TUNEL方法分析細(xì)胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5_TMEM166組腫瘤細(xì)胞凋亡細(xì)胞；B :統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果圖14為In vivo實(shí)驗(yàn)免疫組化方法檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166對(duì)移植瘤組織微血管密度(Microvessel Density, MVD)的影響。A :免疫組化方法分析細(xì)胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166組腫瘤細(xì)胞⑶31蛋白的表達(dá)；B :細(xì)胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166組腫瘤組織的H&E染色。圖15為In vivo實(shí)驗(yàn)H&E染色分析細(xì)胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5_TMEM166處理組重要臟器的影響圖16為In vivo實(shí)驗(yàn)Western Blot分析細(xì)胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166處理組中腫瘤組織中自噬蛋白P62的表達(dá)表I為Ad_TMEM166對(duì)U20S細(xì)胞的化療協(xié)同效應(yīng)表2為Ad-TMEM166對(duì)BGC823細(xì)胞的化療協(xié)同效應(yīng)
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、人Ad5_TMEM166重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定及純化經(jīng)PCR擴(kuò)增得到TMEM166的cDNA片段，然后將TMEM166的片段和pShutt le-CMV (來(lái)自本室)用 BamHI 和 EcoR I (購(gòu)自 New England Biolabs 公司)切開(kāi)，純化和回收相應(yīng)的片段后，用T4連接酶(購(gòu)自北京晶美生物公司)將TMEM166基因連接到pShuttle-CMV質(zhì)粒上，篩選 陽(yáng)性克隆，得到含有TMEM166基因(參見(jiàn)序列表I)的質(zhì)粒，構(gòu)建成 pShuttle-CMV-TMEM166。其中，pShuttIe-CMV質(zhì)粒含有以下元件I. Kanr :為質(zhì)粒在E. coli (如DH5 α )中擴(kuò)增提供卡納抗性(終濃度100 μ g/ml)。2. ori :質(zhì)粒在E. coli中的復(fù)制起點(diǎn)。3. Ad =Ad序列，可以與Ad基因組質(zhì)粒發(fā)生同源重組。4. CMV :來(lái)自MCMV病毒的立早啟動(dòng)子。5. SV40polyA :來(lái)自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信號(hào)。將重組后的pShuttle-CMV_TMEM166用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果參見(jiàn)圖1A,其中，M :Marker (lkb DNAladder), I :為陽(yáng)性克隆。將重組pShuttle-CMV_TMEM166酶切后與pAdxsi載體(來(lái)自本室)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，最終得到含有TMEM166基因的重組腺病毒。對(duì)Ad_TMEM166重組腺病毒進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果參見(jiàn)圖IB所不，M :Marker (lkb DNA ladder), I :為陽(yáng)性克隆對(duì)照病毒Ad-null和Ad5_GFP (不含外源目的基因的重組腺病毒)用同樣方式構(gòu)建。病毒繁通、純化、滴度測(cè)定按Graham等人(Graham F L,Prevce L,Gene transfer andexpression protocols Methods in Molecular Biology,Vol 7. Murray Z J ed. Clifton,NJ The Humane Press Inc, 1991. 109-128)的方法進(jìn)行。Ad_TMEM166 及 Ad-null 毒種各生產(chǎn)50個(gè)125cm2培養(yǎng)瓶病毒，收獲的病毒經(jīng)純化后進(jìn)行質(zhì)檢，滴度為I X 10nPFU/ml。實(shí)施例2 Ad5-TMEM166在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的1640培養(yǎng)基中，置于37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)。U20S、Saos-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% FBS (購(gòu)自 HyClone, SH30084. 03)的 DMEM(購(gòu)自 HyClone,SH30022. 01B)培養(yǎng)基中，置于 37°C，5 % C02 孵箱中培養(yǎng)。SGC7901、MGC803、BGC823 細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含 5% FBS (購(gòu)自 HyClone，SH30084. 03)的 DMEM (購(gòu)自 HyClone，SH30022. 01B)培養(yǎng)基中，置于37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)。AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS(購(gòu)自HyClone，SH30084. 03)的 F12(購(gòu)自 HyClone, SH30026. 01B)培養(yǎng)基中，置于 37°C，5% C02 孵箱中培養(yǎng)。(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC)分別感染MOI為100、200、400、800、1600的Ad5_TMEM166和MOI為200的Ad5-Null，24小時(shí)后，收集細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的免疫印記程序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150四種腫瘤分別感染MOI為200的Ad5_TMEM166和MOI為200的Ad5-Null，24、48、72小時(shí)后，收集細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的免疫印記程序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作。ー抗使用抗TMEM166多克隆抗體(由本實(shí)驗(yàn)室制備)，然后將膜用相應(yīng)的Alexa Fluor 780-標(biāo)記的IgG第二抗體(購(gòu)自LI-C0R BIOSCIENCE INC)室溫避光孵育I小吋。TBS-T洗膜三次，每次10分鐘。固定于膜上的可被紅外線激發(fā)的熒光團(tuán)在780nm激發(fā)光的作用下，其波長(zhǎng)為820nm的發(fā)射光可被LI-COR紅外成像系統(tǒng)(購(gòu)自LI-COR BI0SCIENCEINC)的信號(hào)檢測(cè)器檢測(cè)到。結(jié)果參見(jiàn)圖2所示，人重組Ad5_TMEM166在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性(圖2A)和時(shí)間依賴(lài)性(圖2B)。實(shí)施例3 Ad5-TMEM166降低腫瘤細(xì)胞存活率，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)性U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為200的Ad5-TMEM166或MOI為200的Ad5_Null，感染24、48、72小時(shí)后，加入10μ L的CCK8試劑(Cell Counting Kit_8，購(gòu)自日本同仁化學(xué)CK04)，繼續(xù)培養(yǎng) 2 小時(shí)，用 EL-311SX ELISA Reader (購(gòu)自 Bio-Tec Instruments)測(cè)定 450nm 波長(zhǎng)的吸光度。細(xì)胞存活率為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值/對(duì)照組的吸光度值X 100%。^<0.05，# < O. 01，***p < O. 001
結(jié)果參見(jiàn)圖3A所示，人重組Ad5-TMEM166時(shí)間依賴(lài)性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞存活率。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為100、200、400、800的Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培養(yǎng)72小時(shí)后，加入IOyL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，用EL-311SX ELISAReader(購(gòu)自Bio-TecInstruments)測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度。細(xì)胞存活率為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值/對(duì)照組的吸光度值 X 100%。*p < O. 05，**p < O. 01，***p < O. 001。結(jié)果參見(jiàn)圖3B所示，人重組Ad5-TMEM166濃度依賴(lài)性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞存活率。實(shí)施例4 Ad5-TMEM166誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬我們將U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150四種腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為50的Ad5-GFP-LC3和MOI為200的Ad5_TMEM166，或MOI為50的Ad5-GFP-LC3和MOI為200的Ad5_Null，17-20小時(shí)后共聚焦熒光顯微鏡(購(gòu)自美國(guó)Laica公司)觀察GFP-LC3的斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)，GFP-LC3計(jì)數(shù)結(jié)果為GFP-LC3斑點(diǎn)細(xì)胞數(shù)/總GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。同時(shí)Western Blot分析GFP-LC3蛋白水平，ー抗使用LC3抗體(購(gòu)自Cell Signaling公司)，ニ抗使用Alexa Fluor 780-標(biāo)記的IgG抗體(購(gòu)自LI-CORBIOSCIENCE INC)。結(jié)果參見(jiàn)圖4，人重組Ad5-TMEM166感染后的腫瘤細(xì)胞，GFP-LC3呈斑點(diǎn)/塊狀分布的細(xì)胞比例明顯增加(圖4A，4B)。并且發(fā)現(xiàn)I型GFP-LC3蛋白的含量顯著減低，提示細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的消耗增加(圖4C)。我們進(jìn)ー步分析了代表自噬流量的標(biāo)志物p62的變化(圖5)。U20S和Saos_2腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為100、200、400、800、1600 的 Ad5-TMEM166 和 MOI 為 400 的 Ad5_Null，24 小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行 WesternBlot, —抗使用p62抗體(購(gòu)自日本MBL公司)，ニ抗使用AlexaFluor 780-標(biāo)記的IgG抗體(購(gòu)自 LI-COR BIOSCIENCE INC)。結(jié)果參見(jiàn)5，隨著MOI濃度的增高，p62蛋白水平明顯下調(diào)，顯示自噬流的增カロ(Kabeya, Y. , N. Mizushima, T. Ueno, A. Yamamoto, T. Kirisako, T. Noda, E. Kominami,Y. Ohsumi, and T. Yoshimori. 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, islocalized in autophagosome membranes after processing. Embo J 19:5720-5728·)。實(shí)施例5 Ad5-TMEM166誘導(dǎo)細(xì)胞自噬通過(guò)mT0R/p70S6K信號(hào)通路為進(jìn)ー步掲示Ad5-TMEM166感染引起細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，我們將KYSE150、BGC823、U20S以及Saos-2細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為400的Ad5-TMEM166、MOI為400的Ad5_Null或未處理的細(xì)胞，培養(yǎng)17-20小時(shí)后，收獲細(xì)胞并進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，分析磷酸化的mTOR(購(gòu)自美國(guó)Cell SignalingTechnology 公司)、憐酸化的 p70S6K (購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司)以及p62(購(gòu)自日本MBL公司)蛋白水平,ニ抗使用Alexa Fluor 780-標(biāo)記的IgG抗體(購(gòu)自LI-COR BIOSCIENCE INC)。結(jié)果參見(jiàn)圖6，Ad5-TMEM166 感染的 KYSE150、BGC823、U20S 以及 Saos-2 腫瘤細(xì)胞中，p-mT0R、p-p70S6K以及p62蛋白水平均有所下降，并且mT0R、S6K總量沒(méi)有明顯變化，結(jié)果提示Ad5-TMEM166誘導(dǎo)細(xì)胞自噬是通過(guò)抑制經(jīng)典的mT0R/p70S6K信號(hào)通路介導(dǎo)的。 實(shí)施例6 Ad5-TMEM166誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性目前認(rèn)為，程序性細(xì)胞死亡主要包括細(xì)胞凋亡和自噬性程序性細(xì)胞死亡，并且許多調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要信號(hào)分子都直接參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，例如mT0R，p70S6K等。于是在進(jìn)行細(xì)胞自噬檢測(cè)的同時(shí)，本發(fā)明也對(duì)人重組人重組Ad5-TMEM166能否引起細(xì)胞凋亡進(jìn)行了鑒定。將U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為100、200、400、800、1600的人重組Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于離心管，胰酶消化細(xì)胞，一井轉(zhuǎn)入離心管，I，500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于200 μ I結(jié)合緩沖液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mMNaCl, ImM MgCl2, 5mM KC1,2. 5mM CaCl2)，加入終濃度為 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (購(gòu)自美國(guó)BD公司556547)，室溫避光反應(yīng)20分鐘后加入終濃度為I μ g/ml的PI (購(gòu)自美國(guó)BD公司556547)，根據(jù)細(xì)胞濃度補(bǔ)上200-400 μ I結(jié)合緩沖液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V的陽(yáng)性細(xì)胞，為細(xì)胞凋亡的數(shù)目(圖7Α)。U20S腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后分別于24小時(shí)后和48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于離心管，胰酶消化細(xì)胞，一井轉(zhuǎn)入離心管，l,500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于200 μ I結(jié)合緩沖液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mM NaCl，ImM MgCl2, 5mM KCl，2· 5mM CaCl2)，加入終濃度為 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (購(gòu)自美國(guó)BD公司556547)，室溫避光反應(yīng)20分鐘后加入終濃度為I μ g/ml的PI (購(gòu)自美國(guó)BD公司556547)，根據(jù)細(xì)胞濃度補(bǔ)上200-400 μ I結(jié)合緩沖液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V的陽(yáng)性細(xì)胞，為細(xì)胞死亡的數(shù)目(圖7Β)。U20S和KYSE150腫瘤細(xì)胞(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養(yǎng)20小時(shí)后，收獲細(xì)胞并應(yīng)用POLARstar Galaxy熒光分光光度計(jì)(購(gòu)自德國(guó)BMG公司)檢測(cè)Caspase-3活化情況。具體操作如下細(xì)胞在全細(xì)胞裂解液(IOmM Tris-HCl，pH7. 5，130mM NaCl,l% Triton X-100，ImM PMSF)中冰上裂解30分鐘，蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定(Pierce，USA)。取5yg細(xì)胞總蛋白，與Caspase-3活性檢測(cè)緩沖液(25mM HEPES，pH 7. 5, IOOmM NaCl,ImM EDTA,0. 1% CHAPS, IOmM DTT)，熒光底物 Ac-DEVD_AMC(20 μ M)在 37°C共同孵育。使用POLARStar (BMG Labtechnology, Germany)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)AMC釋放量，激發(fā)光380nm，發(fā)射光460nm。每10分鐘測(cè)定一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)120分鐘。以熒光強(qiáng)度的增加值代表Caspase-3酶活性，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)孔。結(jié)果參見(jiàn)圖7-8，Ad5_Null不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但人重組Ad5_TMEM166能夠明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。同時(shí)，與Ad5-Null比較，U20S, KYSE150細(xì)胞感染人重組Ad5_TMEM166后，能夠明顯激活的Caspase-3活化。實(shí)施例7人重組Ad5_TMEM166不能誘導(dǎo)相對(duì)正常的細(xì)胞死亡為了進(jìn)ー步判斷人重組Ad5_TMEM166用于基因治療的可能性，本發(fā)明用其感 染相對(duì)正常細(xì)胞并檢測(cè)其毒性。我們將人胚腎HEK-293細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，收獲細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(圖9A)。人胚肺二倍體成纖維2BS細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)感染MOI為200人重組Ad5-TMEM166或Ad5-Null，培養(yǎng)48小時(shí)，收獲細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(圖9B)。結(jié)果圖9A和9B，人重組Ad5_TMEM166不能誘導(dǎo)相對(duì)正常的細(xì)胞死亡，說(shuō)明人重組Ad5-TMEM166可能具有潛在基因腫瘤治療的價(jià)值。實(shí)施例8 Ex vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5-TMEM166在體內(nèi)抑制食管癌KYSE150細(xì)胞的生長(zhǎng)在接種腫瘤細(xì)胞前，連續(xù)兩天腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg體重。然后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力狀態(tài)良好的KYSE150細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)，在體外分別用Ad5-TMEM166及Ad5-Null腺病毒感染細(xì)胞(Μ0Ι 100)，未感染細(xì)胞作為對(duì)照，感染24小時(shí)后將細(xì)胞注射到裸鼠(購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)體內(nèi)(2X 106/100 μ L/點(diǎn))，待細(xì)胞組裸鼠成瘤后，每天測(cè)量腫瘤直徑求得腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。收獲時(shí)，對(duì)小鼠臟器進(jìn)行取材處理。結(jié)果參見(jiàn)圖10Α，與細(xì)胞組和Ad5_Null組相比，人重組Ad5_TMEM166組的裸鼠成瘤非常緩慢甚至不成瘤(P < O. 0001)。第20天處死裸鼠并拍照(圖10C)，同時(shí)取出瘤體并稱(chēng)重，見(jiàn)圖10B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人重組Ad5-TMEM166組的平均瘤重明顯低于細(xì)胞組和Ad5-Null組(P < O. ΟΟΙ,ρ < O. 0001)。同時(shí)，通過(guò)動(dòng)態(tài)檢測(cè)動(dòng)物體重，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人重組Ad5-TMEM166的毒副作用(圖10D)。實(shí)施例9 In vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5_TMEM166抑制食管癌KYSE150細(xì)胞的生長(zhǎng)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，所有動(dòng)物(裸鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)在各分組籠中放置I周，使其適應(yīng)新實(shí)驗(yàn)環(huán)境。接種腫瘤細(xì)胞前，連續(xù)兩天腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg體重。然后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力狀態(tài)良好的KYSE150細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)，制成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞濃度為2X IOfVlOOyLtj隨機(jī)分成3組，每組6只裸鼠。對(duì)照組(6只)0.9%生理鹽水；Ad5-Null對(duì)照組(6只)；Ad5-TMEM166治療組(6只)。于每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種細(xì)胞濃度為2X 106/100 μ L/點(diǎn)，接種后每天觀察接種點(diǎn)有無(wú)紅腫及瘤結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。每隔I天用游標(biāo)卡尺測(cè)腫瘤寬徑(a)、長(zhǎng)徑(b)，觀察腫瘤體積的變化，按V = a2Xb/2換算出腫瘤的近似體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)期間，稱(chēng)量裸鼠體重以評(píng)價(jià)裸鼠對(duì)藥物的副反應(yīng)。待腫瘤體積為100mm3，Ad5-Null對(duì)照組進(jìn)行每隔3天濃度MOI 100的瘤內(nèi)注射，Ad5-TMEM166治療組進(jìn)行每隔3天濃度MOI 100的瘤內(nèi)注射，共四次。待腫瘤長(zhǎng)到單側(cè)大于20mm，或者雙側(cè)大于15mm后，將動(dòng)物處死，剝離腫瘤，稱(chēng)量移植瘤的重量(mg),計(jì)算最大腫瘤抑制率(Maximal tumor inhibition)(處理組/對(duì)照組，τ/c值)，腫瘤組織用10%中性福爾馬林液固定。結(jié)果參見(jiàn)圖11，隨著病毒的瘤內(nèi)注射治療，人重組Ad5_TMEM166處理組的腫瘤體積明顯小于對(duì)照細(xì)胞組和Ad5-Null組，從第16天開(kāi)始與Ad5-Null組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義ΓΡ<0.01)(如圖IlA所示)。這些結(jié)果說(shuō)明在人重組Ad5-TMEM166能減慢裸鼠體內(nèi)KYSE150成瘤的速度。圖12B和12C顯示從裸鼠剝離的瘤體大小。稱(chēng)重后發(fā)現(xiàn)，人重組Ad5-TMEM166組的平均瘤重明顯低于細(xì)胞組和Ad5_Null組ΓΡ < O. 001)。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物體重(圖12D)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人重組Ad5-TMEM166的毒副作用。應(yīng)該指出的是，在TMEM166處理組，常發(fā)現(xiàn)雖然腫瘤組織包膜完整，但是內(nèi)容物卻壞死液化，因而腫瘤重量明顯減輕。實(shí)施例10 In vivo實(shí)驗(yàn)Ki_67檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166明顯抑制移植瘤細(xì)胞的 增殖動(dòng)物的處理同實(shí)施例9。利用免疫組化方法從剝離的腫瘤組織中檢測(cè)細(xì)胞中Ki-67(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)的表達(dá)，分析腫瘤細(xì)胞增殖情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下石蠟切片的制作(I)固定取實(shí)驗(yàn)各組的小鼠腫瘤組織用10%的甲醛溶液及時(shí)充分固定；(2)修塊取固定好的腫瘤組織,用解剖刀分割成5 8mm小塊，70%酒精清洗3次后，浸泡于70%酒精過(guò)夜；(3)脫水經(jīng)梯度こ醇(80% 100% )將組織內(nèi)的水份置換出，具體過(guò)程如下，80%こ醇(2 3小時(shí))一90%こ醇(2 3小時(shí))一95%こ醇I (2小吋)一95%こ醇II (2小吋)一無(wú)水こ醇I (2小吋)一無(wú)水こ醇II (2小吋)；(4)透明將脫好水的組織塊浸入ニ甲苯I 20分鐘，ニ甲苯II 20分鐘，充分透明；(5)浸蠟透明好的組織塊浸入65°C蠟I中30分鐘，65°C蠟II中30分鐘。浸蠟可去除組織中的透明劑，増加其硬度，便于切成薄片。石蠟溫度不宜過(guò)高，以高于石蠟熔點(diǎn)2°C為宜，溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使組織塊變硬，變脆，收縮，不利于切成完整的切片；(6)包埋在組織包埋機(jī)上操作，注意組織切面朝下，擺放平整；(7)切片包埋好的蠟塊置于切片機(jī)，調(diào)節(jié)好所需切片厚度，按操作規(guī)程進(jìn)行切片。用毛筆和眼科鑷子在42°C 45°C的溫水中把切片打開(kāi)，組織切片最好無(wú)褶皺，平整，刀痕、跳片現(xiàn)象。將理想的切片用載玻片(做免疫組化的切片需用涂有明膠粘片劑的載玻片)撈起。標(biāo)記切片，分別置于32°C、37°C、52°C烘箱中烘烤24h以上。免疫組織化學(xué)染色(I)脫蠟前，應(yīng)將組織切片置于55-60°C恒溫箱中烘烤30分鐘；(2)脫蠟石蠟切片置于ニ甲苯替代物Ι、Π中各浸泡20分鐘，至透明為止；(3)梯度酒精水化將脫臘后的組織切片于100 %こ醇、100 %こ醇、95 %こ醇、95 %こ醇、85 %こ醇各浸泡5分鐘X I次；(4)去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶新鮮配置3% H2O2 (135ml甲醇+15ml 30%H2O2),室溫下避光孵育9分鐘；(5)抗原修復(fù)抗原修復(fù)液為朽1檬酸-梓檬酸鈉緩沖液，將抗原修復(fù)液微波高火加熱至沸騰，將切片放入，再用微波高火加熱2分鐘，自然冷卻至室溫；(6)封閉用正常羊血清工作液室溫封閉20分鐘；(7)鼠抗Ki-67單抗反應(yīng)滴片，カロI 250相應(yīng)ー抗(以PBS稀釋)，37°C孵育I小吋；(8) PBS清洗5分鐘X3次；(9) ニ抗反應(yīng)對(duì)應(yīng)加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG (以PBS稀釋)，室溫反應(yīng)20分鐘；(IO)PBS洗5分鐘X3次；(Il)DAB顯色，滴片，鏡下觀察反應(yīng)結(jié)果，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。
每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野由兩位觀察者在雙盲情況下進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占據(jù)總細(xì)胞數(shù)的比例，認(rèn)定為陽(yáng)性率。結(jié)果參見(jiàn)圖12，圖12A所示，人重組Ad5-TMEM166組Ki_67陽(yáng)性信號(hào)最弱，對(duì)照細(xì)胞組和Ad5-Null組Ki-67陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)。高倍鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的比例，如圖12B所示，人重組Ad5-TMEM166組的Ki_67表達(dá)明顯低于對(duì)照細(xì)胞組和 Ad5-Null 組，P < O. 0001。實(shí)施例11 In vivo實(shí)驗(yàn)TUNEL檢測(cè)人重組Ad5_TMEM166明顯誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞的
凋亡
動(dòng)物的處理同實(shí)施例9。用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺ロ末端標(biāo)記法，SPTUNEL法(購(gòu)自美國(guó)羅氏)從剝離的腫瘤組織中檢測(cè)裸鼠移植瘤中凋亡細(xì)胞的情況。具體步驟如下(I)移植瘤組織標(biāo)本甲醛固定后用石蠟包埋，5 μ m連續(xù)切片，脫蠟，脫水；(2)切片加入100 μ L通透液(O. 1% Triton X-100,0. I %枸櫞酸鈉)，覆蓋整個(gè)標(biāo)本，37°C下孵育8分鐘，進(jìn)行標(biāo)本通透性處理；(3) PBS洗三次，每次5分鐘。每個(gè)標(biāo)本滴加3%H202 IOOyL,覆蓋整個(gè)標(biāo)本,室溫下孵育8分鐘，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；(4) PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L TUNEL反應(yīng)混合物(TUNEL reaction mixture)，37°C孵育60分鐘，期間配制標(biāo)記反應(yīng)混合物；(5) PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L Convert-POD，37°C孵育30分鐘；(6)PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L DAB底物，室溫下孵育10分鐘；(7) PBS洗三次，每次5分鐘。(8)蘇木素復(fù)染，HCl分化，梯度酒精脫水干燥，ニ甲苯透明化處理，中性樹(shù)膠封片。
(9)結(jié)果判定細(xì)胞核中有棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察蠟片，即隨機(jī)選擇5個(gè)視野(Χ400)中的凋亡細(xì)胞和凋亡小體，這些區(qū)域中的陽(yáng)性染色細(xì)胞核數(shù)量與總細(xì)胞核數(shù)量的比值被定義為凋亡指數(shù)(apoptosis index,Al) ,Al =(總凋亡細(xì)胞數(shù)量/總腫瘤細(xì)胞數(shù)量)X 100%，取其平均值作為該裸鼠腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果參見(jiàn)圖13A和13B，人重組Ad5_TMEM166組的移植瘤內(nèi)凋亡的細(xì)胞明顯多于對(duì)照細(xì)胞組和Ad5-Null組，P < 0. 0001。實(shí)施例12 In vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5_TMEM166明顯降低移植瘤組織微血管密度(Microvessel Density, MVD)，促進(jìn)腫瘤組織缺血壞死新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的前提，作為多種腫瘤預(yù)后標(biāo)志的腫瘤組織微血管密度(Microvessel Density,MVD)受到廣泛關(guān)注。CD31作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，在非成熟的腫瘤血管及成熟血管中均有表達(dá)，MVD-⑶31能精確反映腫瘤血管數(shù)量。動(dòng)物的處理同實(shí)施例9。利用免疫組化的方法從剝離的腫瘤組織中檢測(cè)了CD31(購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)在移植瘤組織中的表達(dá)。具體實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例10結(jié)果參見(jiàn)圖14，圖14A顯示人重組Ad5_TMEM166組的移植瘤內(nèi)MVD數(shù)目明顯低于對(duì)照細(xì)胞組和Ad5-Null組。另外，腫瘤組織的H&E染色表明，人重組Ad5-TMEM166組的移植瘤內(nèi)有大量的缺血壞死，以及瘤細(xì)胞溶解現(xiàn)象，而對(duì)照細(xì)胞組和Ad5-Null組較少，見(jiàn)圖14B所示。實(shí)施例13 In vivo實(shí)驗(yàn)人重組Ad5-TMEM166對(duì)于KYSE150移植瘤裸鼠的重要臟
器無(wú)明顯毒性動(dòng)物的處理同實(shí)施例9。將KYSE150移植瘤實(shí)驗(yàn)各組裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟重要臟器進(jìn)行石蠟切片，并進(jìn)行H&E染色。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(I)脫蠟60°C烘烤蠟片過(guò)夜，將烘烤好后的切片進(jìn)行脫蠟，ニ甲苯I，室溫，20分鐘一ニ甲苯II，室溫，15分鐘。(2)水化梯度酒精100%こ醇I，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇II，室溫浸泡，5分鐘—95%こ醇,室溫浸泡,5分鐘一90%こ醇,室溫浸泡,5分鐘一80%こ醇,室溫浸泡,5分鐘—70%こ醇，室溫浸泡，5分鐘一蒸餾水I，室溫浸泡，5分鐘一蒸餾水II，室溫浸泡，5分鐘。
(3)染色用濾紙過(guò)濾蘇木精后，將水化好的切片置于其中，室溫浸泡，40秒一自來(lái)水沖洗(稍洗)一I %鹽酸こ醇，室溫浸泡,2秒一自來(lái)水沖洗(稍洗)一I %氨水,室溫浸泡,2秒—蒸餾水I，室溫浸泡，3分鐘一蒸餾水II，室溫浸泡，3分鐘一伊紅，室溫浸泡，I分鐘一蒸懼水稍洗一70%こ醇,室溫浸泡,30秒一80%こ醇,室溫浸泡,30秒一90%こ醇,室溫浸泡，5分鐘一95%こ醇，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇I，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇II，室 溫浸泡，5分鐘一ニ甲苯I，室溫浸泡，10分鐘一甲苯II，室溫浸泡，10分鐘。(4)封片將染色完成的切片，ニ甲苯未完全干燥，迅速用滴管吸取中性樹(shù)膠滴在組織上，蓋好蓋玻片，凝固后便可觀察。結(jié)果參見(jiàn)圖15，人重組Ad5-TMEM166對(duì)于小鼠重要臟器無(wú)毒副作用。實(shí)施例14 In vivo實(shí)驗(yàn)Western Blot證明人重組Ad5_TMEM166處理的腫瘤細(xì)胞自噬水平上調(diào)。動(dòng)物的處理同實(shí)施例9。利用Western Blot從剝離的腫瘤組織中檢測(cè)了 p62 (購(gòu)自日本MBL公司)的表達(dá)水平。結(jié)果參見(jiàn)圖16，人重組Ad5_TMEM166處理的腫瘤組織p62表達(dá)下調(diào)，證明自噬水平上調(diào)。實(shí)施例15腫瘤化療藥物增加TMEM166誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡3-甲基腺嘿呤(3-Methyladenine, 3-MA,購(gòu)自美國(guó) sigma 公司)和 LY294002(購(gòu)自美國(guó)sigma公司)是PI3K/AKT抑制劑，也是腫瘤的化療藥物(例如參見(jiàn)QadirMA, Kwok B，Dragowska WH, To KH, Le D，Bally MB, Gorski SM. Macroautophagyinhibition sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells and enhancesmitochondrial depolarization.Breast Cancer Res Treat.2008，112 :389-403 ；Beurel，E.，M.Kornprobst，M.J. Blivet-Van Eggelpoel, A.Cadoret，J.Capeau, andC. Desbois-Mouthon. 2005. GSK_3beta reactivation with LY294002 sensitizeshepatoma cells to chemotherapy-induced apoptosis. Int J Oncol 27:215-222·)。在人重組Ad5-TMEM166感染的的U20S、BGC823，(上述細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)方式同實(shí)施例3)，加入50 μ M的LY294002，24小時(shí)或48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞死亡的情況。結(jié)果參見(jiàn)表1，Ad-TMEM166能夠誘導(dǎo)的U20S細(xì)胞死亡，MOI為200時(shí)是5. 19%，MOI 400時(shí)為13. 32% ；LY294002藥物單獨(dú)處理的細(xì)胞死亡是5. 88%，當(dāng)LY294002藥物分別與MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞死亡率分別上升到31. 38%和77. 86% (Μ0Ι 400)，兩者聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)胞死亡的數(shù)目顯著升高。3-MA藥物單獨(dú)處理的細(xì)胞死亡是10. 76%，當(dāng)3-MA加入到已轉(zhuǎn)染TMEM166質(zhì)粒的U20S中，24小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞死亡的情況，細(xì)胞死亡的數(shù)目上升到38. 28%。從表2可見(jiàn)，Ad-TMEM166能夠誘導(dǎo)的BGC823細(xì)胞死亡，MOI為200時(shí)是10. 43%,MOI 400時(shí)為15. 82%%；LY294002藥物單獨(dú)處理的細(xì)胞死亡是11. 44%，當(dāng)LY294002藥物分別與MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166聯(lián)合處理細(xì)胞，細(xì)胞死亡率分別上升到25. 83%和36. 47%，兩者聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)胞死亡的數(shù)目顯著升高。上述結(jié)果初步提示，3-MA和LY294002作為腫瘤的化療藥物，能夠增加TMEM166誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡，反過(guò)來(lái)說(shuō)，TMEM166也能増加化療藥物的敏感性，特別是耐藥細(xì)胞的敏感性。表I TMEM166和化療藥物協(xié)同誘導(dǎo)U20S細(xì)胞死亡
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒,其中所述重組腺病毒是將人TMEM166基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、人TMEM166的cDNA和終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表達(dá)盒中，所述啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子，所述終止子為SV40終止子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表達(dá)盒還包括SV40polyA信號(hào)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物制備中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為非實(shí)體瘤細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的實(shí)體瘤細(xì)胞為骨肉瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞以及食管癌細(xì)胞等。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述藥物與化療藥物聯(lián)合給藥來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述的化療藥物為3-甲基腺嘌呤(3-MA)和LY294002 等。
10.ー種藥物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組腺病毒TMEM166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組腺病毒，是將人TMEM166基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、人TMEM166的cDNA和終止子。本發(fā)明的重組腺病毒TMEM166在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均可明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且重組腺病毒TMEM166對(duì)腫瘤化療藥物有很好的協(xié)同作用，本發(fā)明的重組腺病毒TMEM166可廣泛用于多種腫瘤的基因治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102851315SQ201110178440
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者馬大龍, 陳英玉, 常瑩, 許冬, 李艷軍, 郭金海, 王峰, 石太平 申請(qǐng)人:北京大學(xué), 北京諾賽基因組研究中心有限公司