專利名稱：一種組織工程化房室結(jié)及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療心臟房室傳導(dǎo)阻滯疾病的組織工程化房室結(jié)及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前生物起搏治療房室傳導(dǎo)阻滯的思路是利用基因轉(zhuǎn)染或細(xì)胞移植的方法在傳導(dǎo)阻滯部位以下(如室間隔或左右心室壁)建立一個新的穩(wěn)定起搏點，提供并提高心室自主節(jié)律，或?qū)⑵鸩?、起搏?xì)胞導(dǎo)入傳導(dǎo)阻滯部位，修復(fù)病損的傳導(dǎo)組織，從而使患者避免接受電子心臟起搏器的植入，達(dá)到生物心臟起搏所倡導(dǎo)的理想治療狀態(tài)。然而，轉(zhuǎn)染起搏類基因雖然提高和產(chǎn)生了心肌細(xì)胞的自律性，初步證明可以創(chuàng)建異位起搏點，但依然面臨巨大的挑戰(zhàn)，如外源基因在體內(nèi)缺乏長期穩(wěn)定的表達(dá)并且難以有效的調(diào)控；不能得到高效、安全、導(dǎo)向性好的載體系統(tǒng)等。利用細(xì)胞移植的方法創(chuàng)建新的起博點，理論上可以克服上述基因?qū)氲木窒扌裕摲椒ㄊ菍⒕哂休^高起博活性的外源細(xì)胞移植到心室，使其與宿主心肌細(xì)胞之間形成電機(jī)械耦聯(lián)，從而可以作為一個發(fā)放沖動的有效起搏點驅(qū)動心室收縮，達(dá)到治療目的。然而該種細(xì)胞由于移植到心臟后微環(huán)境適應(yīng)能力差以及取材來源問題，來 艮難應(yīng)用至Ij臨床治療。Potapova 等(Irina Potapova, et a 1. Human Mesenchymal Stem Cells as a Gene Delivery System to Create Cardiac Pacemakers. Circulation Research. 2004 ；94 :952.)將起搏基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到竇停模型動物心室中， 但移植的細(xì)胞極易在心臟內(nèi)遷移、彌散，不能形成穩(wěn)定統(tǒng)一的心臟節(jié)律或傳導(dǎo)通路。特別是，導(dǎo)入基因和細(xì)胞在心室創(chuàng)建新的起搏點、力圖提高心室自主節(jié)律治療房室傳導(dǎo)阻滯的思路，和安置電子起搏器一樣，畢竟只是對傳導(dǎo)阻滯所產(chǎn)生癥狀的一個緩解治療，對心臟功能的全面改善和疾患的徹底治愈作用有限。針對上述基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞移植治療房室傳導(dǎo)阻滯存在的問題和面臨的困難，并綜合考慮生物起搏治療研究的現(xiàn)狀，體外構(gòu)建組織工程化的房室結(jié)，將之移植到心臟中修復(fù)或再建心臟傳導(dǎo)通路，應(yīng)為房室傳導(dǎo)阻滯治療課題的理想解決方案。目前國內(nèi)、外尚無構(gòu)建組織工程化房室結(jié)的研究報道，僅有個例報道關(guān)于利用工程化組織構(gòu)建物建立房室傳導(dǎo)通路的研究。Choi等(Choi YH, et al. 2006，Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006 ； 169(1) :72-85.)利用骨豁肌細(xì)胞和matrigel (水凝膠)在體外構(gòu)建了一個組織體，并將之移植到大鼠心臟冠狀溝心外膜下，對再建房室傳導(dǎo)通路做了初步的嘗試。結(jié)果表明該構(gòu)建物可以和周圍宿主心肌建立電機(jī)械耦聯(lián)，并且允許房室之間有電沖動傳導(dǎo)，初步證明了利用組織工程化組織再建房室傳導(dǎo)通路的可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程化房室結(jié)及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明人設(shè)想，利用起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以膠原海綿為支架材料，體外構(gòu)建組織工程化的房室結(jié)，將之移植到心臟中修復(fù)或再建心臟傳導(dǎo)通路，應(yīng)為房室傳導(dǎo)阻滯治療課題的理想解決方案。房室傳導(dǎo)阻滯的位點一般發(fā)生在房室間隔內(nèi)的傳導(dǎo)路徑上，大體位置約在Koch三角的區(qū)域，包括房室結(jié)以及與之相連的房結(jié)區(qū)和結(jié)束區(qū)。理論上， 將組織工程化房室結(jié)移植到房室交界處的心外膜下，即將組織工程化房室結(jié)連接到心臟冠狀溝兩側(cè)房室心肌中，可越過阻滯位點并溝通其兩端的傳導(dǎo)，達(dá)到對房室阻滯的治療目的。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用膠原海綿和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞，構(gòu)建組織工程化房室結(jié)。本發(fā)明的關(guān)鍵在于如何采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，膠原海綿作為支架，在體外構(gòu)建具有起搏特性和心電傳導(dǎo)特性的組織工程化房室結(jié)，為治療心臟房室傳導(dǎo)阻滯疾病提供移植體。膠原海綿是一種可降解的生物支架材料，在體外培養(yǎng)條件下隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變和時間的推移會逐漸的萎縮和降解。且種子細(xì)胞在其上的生長是否良好亦受種植的時間、濃度、方式的影響。因此，控制種子細(xì)胞種植的時間、濃度、方式以及支架材料的大小、形狀等，是利用膠原海綿和心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建組織工程房室結(jié)的關(guān)鍵。本發(fā)明提供了一種組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法，具體技術(shù)方案如下A、與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為起搏細(xì)胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取竇房結(jié)組織進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得竇房結(jié)細(xì)胞。然后利用細(xì)胞培養(yǎng)池(Transwell)將竇房結(jié)細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)液中添加lOmmol/L的5-氮雜胞苷結(jié)合10_8M的內(nèi)皮素_1，培養(yǎng)時間6_7天，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為心臟起搏細(xì)胞。通過倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察搏動情況以及形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)特征；利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX40、CX43、CX45的表達(dá)；以及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測細(xì)胞的膜電流情況，記錄動作電位等方法進(jìn)行心臟起搏細(xì)胞鑒定。B、與心耳肌細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為心臟傳導(dǎo)細(xì)胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取心耳部位組織進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細(xì)胞。然后利用細(xì)胞培養(yǎng)池(Transwell)將心耳肌細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)， 并且施加旁分泌因子內(nèi)皮素-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 (濃度范圍1 X IO-8M-L 5X 10_8M)，培養(yǎng)時間6-7天，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為心臟傳導(dǎo)細(xì)胞。通過對縫隙鏈接蛋白40、HCN2等標(biāo)記物的檢測進(jìn)行心臟傳導(dǎo)細(xì)胞鑒定。C、利用膠原海綿和誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建組織工程化房室結(jié)將誘導(dǎo)成功的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞按一定的比例(1 1 1 2)制備成混合細(xì)胞懸液(混合細(xì)胞懸液的濃度范圍IX IO6個/ml-1. 2 X IO6個/ml)，采用沉淀法(參見《組織工程學(xué)教程》，人民軍醫(yī)出版社，2001版。將細(xì)胞懸液滴到支架材料上，不使其溢出為準(zhǔn))種植該混合細(xì)胞到膠原海綿支架上(種植密度3X105個/cm3-6X105個/cm3)，定期更換培養(yǎng)液在體外條件下培養(yǎng)15天，直到細(xì)胞支架復(fù)合體形成有功能的房室結(jié)，體外電刺激檢測傳導(dǎo)速率。上述的組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法中，竇房結(jié)細(xì)胞、心耳肌細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以選自犬、大鼠、兔子、小鼠等。上述的組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法中，膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提{共。上述的組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法中，步驟C具體為將膠原海綿剪成1. 5X 1. 0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用；分別取誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml， 于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液，1200轉(zhuǎn)低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為IXlO6個/ml，將兩種細(xì)胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合細(xì)胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?；?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細(xì)胞懸液，將膠原海綿置于細(xì)胞懸液中，待海綿將細(xì)胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細(xì)胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育 1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法制備得到的組織工程化房室結(jié)。本發(fā)明還提供了上述組織工程化房室結(jié)在制備治療房室傳導(dǎo)阻滯疾病移植體中的應(yīng)用。經(jīng)動物實驗將構(gòu)建成功的本發(fā)明組織工程化房室結(jié)移植治療房室傳導(dǎo)阻滯取得良好效果。通過移植手術(shù)，將構(gòu)建成功的組織工程化房室結(jié)移植到心右纖維三角，顯微外科縫合，分別于兩周和一個月后給移植動物造成房室傳導(dǎo)阻滯，心電圖監(jiān)測組織工程化房室結(jié)改善房室傳導(dǎo)的情況。本發(fā)明獲取了一種具有起搏特性和心電傳導(dǎo)特性、可用于治療移植的組織工程化房室結(jié)，為治療心臟房室傳導(dǎo)阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。實施例1 誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備心起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞1.分離、培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、犬竇房結(jié)細(xì)胞和犬心耳肌細(xì)胞(1)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)犬全骨髓直接貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抽取成年雜交犬(第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，15千克)髂骨骨髓10ml，900Xg離心lOmin，棄上清與脂肪；加入紅細(xì)胞裂解液TrisNH4Cl,40C 5min去除紅細(xì)胞，以IX 106/ml接種于纖粘連蛋白(FN) (Sigma公司) 包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為60% DMEM-F12 (Gibco公司),10% FCS(Gibco公司)UOng/ml EGF(cytolab公司)UOOOU/ml LIF(Chemicon公司)。24h后去除懸浮未貼壁細(xì)胞，每3天換液1次，直到需要傳代。(2)新生犬竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)出生24h的犬心臟，在解剖顯微鏡下，于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部取犬竇房結(jié)組織；剪成Imm大小的碎塊，在0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C過夜消化。第一次的消化液棄去，再加入新鮮0. 07%的胰酶，37°C消化15分鐘，吸出消化液并中止消化，重復(fù)2 3次，直至全部組織塊消化完全。將消化液用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，IOOOrpm離心 8min，加入含 20% FBS(Gibco 公司)的 DMEM-F12 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，37°C 5% CO2 培養(yǎng)4小時，吸出含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液在6孔板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1 X 105/ml細(xì)胞，每孔接種2ml。培養(yǎng)48小時后換液。每孔加入2ml含0. lmmol/L BrdU和20% FBS的DMEM-F12
培養(yǎng)基。(3)犬心耳肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)取新生犬心耳肌組織塊；剪成Imm大小的碎塊，在 0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C過夜消化。第一次的消化液棄去，再加入新鮮0. 07%的胰酶，37°C消化15分鐘，吸出消化液并中止消化，重復(fù)2-3次，直至全部組織塊消化完全。將消化液用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，IOOOrpm離心8min，加入含20% FBS (Gibco公司)的 DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，37°C 5% CO2培養(yǎng)4小時，吸出含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液在6 孔板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1 XlO5Ail，每孔接種anl。培養(yǎng)48小時后換液。每孔加入aiil 含0. lmmol/L BrdU(Sigma公司)禾口 20% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟起搏細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入Transwell小室，密度為每孔IX IO4個細(xì)胞。將種植細(xì)胞的Transwell小室插入生長竇房結(jié)細(xì)胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。M小時后，施加IOmmol/L的5-氮雜胞苷(Sigma)結(jié)合1(Γ8Μ的內(nèi)皮素_1 (Tocris)，連續(xù)培養(yǎng)7 天后進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞的檢測鑒定。倒置相差顯微鏡可以觀察到單個細(xì)胞的搏動，細(xì)胞形態(tài)大部分為梭形和三角形。 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX45 (Abeam公司)的表達(dá)陽性；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測單個細(xì)胞的動作電位，顯示舒張末期有自動去極化，證明誘導(dǎo)后細(xì)胞為起搏細(xì)胞。(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟傳導(dǎo)細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入Transwell小室，密度為每孔IX IO4個細(xì)胞。將種植細(xì)胞的"Transwell小室插入生長心耳肌細(xì)胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。M小時后，向上述六孔板和Transwell小室加入旁分泌因子內(nèi)皮素-I(Tocris)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 (RD公司)，使其終濃度為10_8M，連續(xù)培養(yǎng)7天后進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞的檢測鑒定。倒置相差顯微鏡可以觀察到單個細(xì)胞的搏動，細(xì)胞形態(tài)大部分為梭形和三角形。 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞縫隙連接蛋白40(CX40)和HCN2(Abcam公司)的表達(dá)，結(jié)果顯示CX40和HCN2的陽性表達(dá)明顯升高(ρ < 0. 05)，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)向心臟傳導(dǎo)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測單個細(xì)胞的動作電位，顯示舒張末期有自動去極化，證明誘導(dǎo)后細(xì)胞為傳導(dǎo)細(xì)胞。實施例2 誘導(dǎo)獲得的犬心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞種植到膠原海綿構(gòu)建組織工程
化房室結(jié)1.組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建(1)膠原海綿準(zhǔn)備膠原蛋白來源于牛跟腱的I型膠原，膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提供。將膠原海綿剪成1. 5X1. 0X0. 2cm大小，用鈷6(1照射12小時以上消毒備用。(2)犬心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞混合液接種膠原海綿
分別取誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml，于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞體回縮呈圓形，加含 10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液， IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為IXlO6個/ml，將兩種細(xì)胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合細(xì)胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的混合細(xì)胞懸液，將膠原海綿置于細(xì)胞懸液中，待海綿將細(xì)胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的混合細(xì)胞懸液，置于 37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。2.組織工程化房室結(jié)的檢測鑒定(I)HE染色觀察心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞在膠原海綿上的生長將上述生長2周的心臟起搏細(xì)胞、傳導(dǎo)細(xì)胞和膠原海綿復(fù)合體制備成石蠟切片進(jìn)行HE染色，步驟如下蘇木素液染lOmin，自來水沖洗，75 %鹽酸乙醇溶液分化30s，水洗 lh，95%乙醇1 2min，伊紅復(fù)染1 2min，95%乙醇1 2min，脫水透明，中性樹膠封片。 通過HE染色觀察細(xì)胞膠原海綿復(fù)合體中種子細(xì)胞生長均勻、接觸緊密，心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞與膠原海綿復(fù)合良好。(2)光學(xué)電位檢測儀(Optical mapping)和多導(dǎo)生理儀檢測細(xì)胞膠原海綿復(fù)合體的起搏特性和傳導(dǎo)速率使用光學(xué)電位檢測儀可檢測到膠原海綿復(fù)合體的起搏電位，多導(dǎo)生理儀檢測細(xì)胞膠原海綿復(fù)合體傳導(dǎo)速率，結(jié)果顯示電沖動的傳導(dǎo)速度為0. 014士0. OOlm/s，類似在體房室結(jié)區(qū)電位和傳導(dǎo)速率，證明所構(gòu)建細(xì)胞膠原海綿復(fù)合體(組織工程化房室結(jié))具有類似心臟房室結(jié)的特性。實施例3 組織工程化房室結(jié)移植體內(nèi)觀察傳導(dǎo)效果通過開胸手術(shù)將上述構(gòu)建成功的組織工程化傳導(dǎo)束移植到犬(第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，15千克)房室交界處的心外膜下，即將組織工程化傳導(dǎo)束連接到心臟冠狀溝兩側(cè)房室心肌中，顯微外科縫合；移植前3天開始應(yīng)用環(huán)孢素A (北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，劑量為0. 25mg/天)和潑尼松龍(上海通用藥業(yè)股份有限公司，劑量為0. Img/天)抑制免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果顯示本發(fā)明的組織工程房室結(jié)可以在宿主心肌中存活，移植組織中的細(xì)胞和宿主心肌細(xì)胞形成了電機(jī)械藕聯(lián)；移植一個月后給動物造房室傳導(dǎo)阻滯，心電圖(奧爾科特生物有限公司)監(jiān)測顯示組織工程化房室結(jié)可改善房室間傳導(dǎo)，證實所構(gòu)建的組織工程化房室結(jié)具有再建心臟房室傳導(dǎo)通路的潛能。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法，包括如下步驟A、與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為起搏細(xì)胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取竇房結(jié)組織進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得竇房結(jié)細(xì)胞，然后利用細(xì)胞培養(yǎng)池將竇房結(jié)細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)液中添加 lOmmol/L的5-氮雜胞苷結(jié)合1(Γ8Μ的內(nèi)皮素_1，培養(yǎng)時間6_7天，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為心臟起搏細(xì)胞；B、與心耳肌細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為心臟傳導(dǎo)細(xì)胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取心耳部位組織進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細(xì)胞，然后利用細(xì)胞培養(yǎng)池將心耳肌細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，并且施加旁分泌因子內(nèi)皮素-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1，濃度均為1 X IO-8M-L 5 X 10 培養(yǎng)時間6_7天，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為心臟傳導(dǎo)細(xì)胞；C、利用膠原海綿和誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建組織工程化房室結(jié)將誘導(dǎo)成功的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞按1 1 1 2制備成混合細(xì)胞懸液，混合細(xì)胞懸液的濃度范圍1 X IO6個/ml-1. 2X IO6個/ml，采用沉淀法種植該混合細(xì)胞到膠原海綿支架上，種植密度為3 X IO5個/cm3-6 X IO5個/cm3，定期更換培養(yǎng)液在體外條件下培養(yǎng)15 天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述的竇房結(jié)細(xì)胞、心耳肌細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于犬、大鼠、兔子或小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組織工程化房室結(jié)的構(gòu)建方法，其特征在于其中的步驟 C具體為將膠原海綿剪成1. 5 X 1. 0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用；分別取誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞，加0. 25%胰酶1ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液，1200轉(zhuǎn)低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為IX IO6個/ml， 將兩種細(xì)胞按1 1 1 2混合制成混合細(xì)胞懸液，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?；?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細(xì)胞懸液，將膠原海綿置于細(xì)胞懸液中，待海綿將細(xì)胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細(xì)胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周，每兩天換一次液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一構(gòu)建方法制備得到的組織工程化房室結(jié)。
5.一種如權(quán)利要求4所述的組織工程化房室結(jié)在制備治療房室傳導(dǎo)阻滯疾病移植體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，目前國內(nèi)、外尚無構(gòu)建組織工程化房室結(jié)的研究報道。本發(fā)明提供了一種利用膠原海綿和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的心臟起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建組織工程化房室結(jié)的方法。本發(fā)明采用與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為起搏細(xì)胞，與心耳肌細(xì)胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為心臟傳導(dǎo)細(xì)胞。將此兩種細(xì)胞作為種子細(xì)胞，膠原海綿作為支架，在體外構(gòu)建具有起搏特性及心電傳導(dǎo)特性的組織工程化房室結(jié)。本發(fā)明經(jīng)動物實驗將構(gòu)建成功的組織工程化房室結(jié)移植治療房室傳導(dǎo)阻滯取得良好的治療效果。本發(fā)明獲取了一種具有心電傳導(dǎo)特性、可用于治療移植的組織工程化房室結(jié)，為治療心臟房室傳導(dǎo)阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。
文檔編號A61L27/24GK102488923SQ201110415250
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者劉鎮(zhèn), 姬瑞娟, 張傳森, 張喜, 張璐萍, 李玉泉, 楊向群, 郭金萍, 黃會龍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)