專利名稱：一種干涉GDF9基因表達(dá)的 siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9 (⑶F9)基因表達(dá)的SiRNA片段。
背景技術(shù)：
RNAi (RNA interference),即RNA干擾，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。RNAi是通過(guò)雙鏈RNA誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，導(dǎo)致目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后緘默的現(xiàn)象或機(jī)制。此現(xiàn)象于1998年在對(duì)線蟲(chóng)的研究中首次發(fā)現(xiàn)。siRNA是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源dsRNA或內(nèi)源產(chǎn)生的dsRNA，被Dicer酶切割成為21_23nt長(zhǎng)的小分子，這種siRNA是RNAi機(jī)制中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，具有非常強(qiáng)的RNAi效應(yīng)。 RNAi 途徑中，RISC (RNA induced silencing complex)的形成發(fā)揮了極大的作用。RISC是由小分子RNA(siRNA / miRNA), Dicer, DadR蛋白和Argonaute家族蛋白組成的復(fù)合體，其作用是直接造成與復(fù)合體中siRNA高度互補(bǔ)的mRNA被降解。RISC作用過(guò)程中，mRNA的切割發(fā)生在對(duì)應(yīng)的siRNA 5’端10 11位核苷酸間，切割將mRNA —分為二，切割后mRNA從RISC上釋放。完成一次切割后，引導(dǎo)siRNA仍然結(jié)合在RISC中，繼續(xù)完成更多輪的切割。生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9 ,GDF9)主要在卵泡中表達(dá)，同時(shí)在非性腺組織中有表達(dá)，能促進(jìn)始基卵泡的發(fā)育，與FSH協(xié)同刺激卵泡生長(zhǎng)，主要調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖功能。⑶F9基因敲除小鼠因初級(jí)卵泡發(fā)育受阻，從而影響生殖。而體外給予生物活性的⑶F9可誘導(dǎo)竇前卵泡生長(zhǎng)和細(xì)胞分泌。以上表明⑶F9對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育影響是有階段依耐性。Hanrahan等(2004)發(fā)現(xiàn)⑶F9的FecGH突變(G8突變)能顯著提高雜合綿羊的排卵率。siRNA作為一種新型的基因工具來(lái)抑制特定基因的表達(dá)，目前大規(guī)模應(yīng)用于生物細(xì)胞、組織和個(gè)體，特別是用來(lái)制備基因敲低模式動(dòng)物，從動(dòng)物整體水平研究基因的功能，siRNA的抑制特定基因的優(yōu)點(diǎn)是其他基因技術(shù)都無(wú)法比擬的。而對(duì)于水牛生長(zhǎng)分化因子9的siRNA還未見(jiàn)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過(guò)下調(diào)GDF9基因的部分功能來(lái)提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍較低，本發(fā)明提供了一種抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9(⑶F9)基因表達(dá)的siRNA。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9 (⑶F9)基因表達(dá)的siRNA，分別命名為⑶F9-1、⑶F9-2和⑶F9-3，其核苷酸雙鏈中正義鏈序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。
所述siRNA與⑶F9基因mRNA反向互補(bǔ)，其長(zhǎng)度為19 27bp。含有上述siRNA 的 shRNA。上述shRNA的編碼基因，兩端帶有I和I酶切位點(diǎn)的序列，便于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，雙鏈核苷酸序列如下
⑶F9-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；
⑶F9-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；
⑶F9-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。一種表達(dá)載體，由上述shRNA的編碼基因與出發(fā)載體構(gòu)建的，即將shRNA編碼基因插入出發(fā)載體上構(gòu)建而成。慢病毒載體可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定，作為上述出發(fā)載體中的優(yōu)選方案，其中病毒載體最優(yōu)選pshRNA-copGFP Lentivector。該載體具有完整的shRNA插入位點(diǎn)以及綠色突光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)了靶基因shRNA的高效表達(dá)、病毒包裝以及轉(zhuǎn)基因的直觀展示。本發(fā)明的siRNA可以制備成基因藥物或其他合適的制劑用于下調(diào)水牛生長(zhǎng)分化因子9的表達(dá)，從而提聞水牛的繁殖性能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的siRNA沉默效果好，能夠特異性的下調(diào)GDF9基因的表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)定量Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各干擾片段能使⑶F9 mRNA表達(dá)量有的發(fā)生100%的抑制現(xiàn)象，ELISA檢測(cè)⑶F9蛋白表達(dá)量也相應(yīng)降低。發(fā)明人構(gòu)建了含有上述siRNA的編碼基因的pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行了體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，并制備了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，結(jié)果證明了pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后能表達(dá)shRNA，并對(duì)水牛⑶F9基因進(jìn)行特異性的抑制，從而在制備用于GDF9下調(diào)的生物制劑中有應(yīng)用價(jià)值。


圖I. pcDNA3. I (+/_)載體圖 2. pPUC19-GDF9 酶切電泳圖，M DL15000 makeer, I :空質(zhì)粒，2 : BanR I 單酶切，3 Bam^ I/ BcoR I 雙酶切；
圖 3. pcDNA3. I (-)載體酶切圖，I -.BatiiA I/ I 雙酶切，2 -.BamR I 單酶切，3 :空質(zhì)粒，M 15000bp make ；
圖4.重組質(zhì)粒pcDNA3. I-⑶F9菌落鑒定電泳圖，箭頭所指⑶F9基因擴(kuò)增片段；
圖 5. pshRNA-copGFP Lentivector 載體圖 6. pshRNA-copGFP Lentivector 載體酶切圖，I :空質(zhì)粒,2 -.BamW I 單酶切，3 -.BanfAI/ I雙酶切；
圖7.退火產(chǎn)物鑒定電泳圖 8.重組質(zhì)粒 Lv-shRNA 鑒定，1、2 Lv-shRNAl, 3、4 Lv-shRNA2, 5 Lv-shRNA3, M 50bp maker ；
圖9.細(xì)胞總RNA電泳檢驗(yàn) 圖10.水牛pcDNA3. I㈠-GDF9及LV_siRNA共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞48h熒光顯微鏡圖(40X)；
圖11.慢病毒干擾質(zhì)粒對(duì)水牛⑶F9 mRNA表達(dá)水平的影響，其中*表示差異顯著Gd< O. 05)；
圖12.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和慢病毒質(zhì)粒后CHO細(xì)胞裂解液中GDF9蛋白濃度變化，其中*表不差異顯者(/* < O. 05)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例I構(gòu)建P⑶NA3. I-⑶F9真核表達(dá)載體
I.合成水牛生長(zhǎng)分化因子9 (⑶F9)序列(GenBank登錄號(hào)NM_174681)，連接于載體PUC19上，酶切為點(diǎn)為I與BamH。雙酶切(&oR I與BamH)和測(cè)序證明合成片段正確(見(jiàn)圖2)。2.構(gòu)建pCDNA3. 1-GDF9真核表達(dá)質(zhì)粒
(I)酶切反應(yīng)
反應(yīng)體系WcoR I與BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物。BcoR I與BamH I雙酶切pcDNA3. I (-)，酶切體系10 X Buffer K 2 μ UEcoR I I μ L，BamH I I μ L，質(zhì)粒 6 μ L，蒸餾水 10 μ L，總體積20yL。反應(yīng)條件37°C作用I. 2h，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，最后各以30 μ L水洗脫DNA，-20°C保存。(2)連接反應(yīng)
反應(yīng)體系線性化pcDNA3. 1(_) 4μ , IOXLigation Buffer 2μ ,Τ4 DNA Ligase μ ,⑶F9目的片段13μ ，總體積為20 μ L。反應(yīng)條件16°C連接過(guò)夜，獲得重組pCDNA3. 1-GDF9真核表達(dá)質(zhì)粒。3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
篩選步驟2中P⑶NA3. 1-GDF9真核表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，通用引物(T7和BGH)，序列號(hào)分別為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 ;擴(kuò)增有1300bp左右長(zhǎng)度的插入片段釋放出者視為陽(yáng)性重組體(見(jiàn)圖4)。從上述方法鑒定的陽(yáng)性克隆中挑選2個(gè)克隆，接種于LA培養(yǎng)基中制備新鮮菌液，經(jīng)測(cè)序鑒定插入片段正確，構(gòu)建PCDNA3. 1-GDF9真核表達(dá)載體成功。實(shí)施例2構(gòu)建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質(zhì)粒
I.根據(jù)水牛生長(zhǎng)分化因子9的mRNA序列設(shè)計(jì)方法和原則篩選出靶序列，設(shè)計(jì)siRNA，與水牛生長(zhǎng)分化因子9基因mRNA反向互補(bǔ)，分別命名為⑶F9-1、⑶F9-2、⑶F9-3，其正義鏈序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。2.再根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)構(gòu)建抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9基因表達(dá)的siRNA載體所需的DNA序列⑶F9 shRNA模板，兩端引入I和I酶切位點(diǎn)，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體序列如下(F表示正義鏈，R表示反義鏈)
⑶F9-lshRNA F SEQ ID NO:4 ；
⑶F9-lshRNA R SEQ ID NO:5 ；
⑶F9-2shRNA F SEQ ID NO:6 ；
⑶F9-2shRNA R SEQ ID NO:7 ；
⑶F9-3shRNA F SEQ ID NO:8 ；
⑶F9-3shRNA R SEQ ID NO:9。3.將合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀釋至濃度為I μ g/μ L，將上述6條序 列分成 3 對(duì)，其中⑶F9-lshRNA F 和⑶F9_lshRNA R 為 I 對(duì)，⑶F9_2shRNA F 和⑶F9_2shRNAR為I對(duì)，⑶F9-3shRNA F和⑶F9_3shRNA R為I對(duì)。3對(duì)序列分別進(jìn)行退火反應(yīng)。退火反應(yīng)體系如下DNA模板單鏈I (⑶F9-lshRNA F)1 μ I,DNA模板單鏈2 (⑶F9_lshRNA R)1 μ 1，IOX退火溶液I μ 1，ddH20 17 μ I。反應(yīng)條件混勻，95°C加熱IOmin ;室溫靜置過(guò)夜；稀釋至終濃度 IOng/μ I。-20°C備用。⑶F9-2shRNA F 和⑶F9_2shRNA R，以及⑶F9_3shRNA F和⑶F9-3shRNA R的退火反應(yīng)體系同上，DNA模板單鏈替換成相應(yīng)核苷酸序列即可。4. LV-shRNA-GFP 空質(zhì)粒載體(即 pshRNA-copGFP Lentivector 空質(zhì)粒,見(jiàn)圖 6)酶切，酶切體系如下:漢·H I I μ I,BcoR I I μ 1，10XBuffer K 2 μ I，LV-shRNA-GFP空質(zhì)粒6 μ I, ddH20 10 μ I。37°C作用lh，進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖6。Omega凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。將步驟3所得的退火產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒載體連接，連接體系如下雙酶切質(zhì)粒LV-ShRNA-GFP (O. I μ g/μ I) I μ I，退火產(chǎn)物 I μ 1，Τ4 DNA Ligase Buffer 2 μ 1，T4 DNALigase I μ l，ddH20 15 μ I。充分混勻，16 1水浴連接，反應(yīng)過(guò)夜。5.轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆的PCR鑒定轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，挑取單個(gè)菌落，接種到LA液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)3h。PCR鑒定陽(yáng)性克隆，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)引物，其中上游引物序列為SEQ ID NO: 12，下游引物序列為SEQ ID NO: 13，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增包括插入目的基因的DNA片段。PCR擴(kuò)增片段為156bp，反應(yīng)采用50μ 反應(yīng)體系。體系的組成為=IOXPCR緩沖液5PL，2. 5mM dNTP 4μ ，上游引物(10pmol/>L) μ ，下游引物(10pmol/>L) μ ，步驟 5 中轉(zhuǎn)化后的菌液3PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ,補(bǔ)加ddH20至50μ 。按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)-MV，5min ；94°C，30sec ；60°C，30sec ；72°C, 30sec，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin 延伸后結(jié)束反應(yīng)。分別取5PL PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳，檢查目的基因的擴(kuò)增效果，電泳結(jié)果見(jiàn)圖8。6.陽(yáng)性克隆測(cè)序挑選陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序(由Invitrogen公司進(jìn)行3730型測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析)。利用生物分析軟件DNAMAN進(jìn)行同源性分析。構(gòu)建成功的三種慢病毒干擾質(zhì)粒分別命名為L(zhǎng)V-siRNA I、LV-siRNA II和LV_siRNA III (LV_siRNA是對(duì)于用pshRNA-copGFP Lentivector構(gòu)建的干擾質(zhì)粒的簡(jiǎn)稱,里面插入了 RNA干擾的dsDNA的序列)。實(shí)施例3 RNA干擾有效靶點(diǎn)的篩選 I.三種慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
將 pcDNA3. 1-GDF9 分別和 LV-siRNA I ,LV-siRNA II 和 LV-siRNA III共轉(zhuǎn)染入 CHO 細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。設(shè)pcDNA3. I-⑶F9和LV-shRNA-GFP空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞作為對(duì)照，目的為與處理組轉(zhuǎn)染背景一致，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。其中pcDNA3. I-⑶F9與慢病毒干擾質(zhì)粒的比例為1:1。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，按照Polyfect (購(gòu)自QIAGEN公司)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(I)轉(zhuǎn)染前一天，在新六孔板培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，完全吹散細(xì)胞以保證細(xì)胞均勻的分布。當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞最好鋪滿培養(yǎng)皿的40-90%。(2)將pcDNA3. I-⑶F9和慢病毒干擾質(zhì)粒按I: I共4ug，加RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)至IOOul,溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育5min ；
(3)取IOul的Polyfect加入到IOOul DNA/RPMI-1640培養(yǎng)基中溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育lOmin。
(4)在第3步孵育形成轉(zhuǎn)染混合物的同時(shí)，用不含血清和抗生素的RPMI-1640洗細(xì)胞一次，然后加入I. 5mL含10%血清和1%抗生素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。(5)將第3步中產(chǎn)生的DNA/ RPMI-1640試劑混合物逐滴加入第4步中處理的六孔板培養(yǎng)皿中，輕輕地將混合物和培養(yǎng)基混勻，C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48小時(shí)，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，部分細(xì)胞用Trizol收集，_70°C保存，用于RNA提取。2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA提取
采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA。所用器材均經(jīng)O. 1%DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌后在鼓風(fēng)干烤箱中烤干，操作過(guò)程均在超凈臺(tái)中進(jìn)行。具體操作步驟如下
(1)在六孔板中立刻加入ImlTrizol/孔,裂解5min后轉(zhuǎn)移到RNase-free的I. 5ml的離心管中；
(2)每管加入200ul氯仿；
(3)旋潤(rùn)振蕩器上混勻2min,室溫靜置lOmin,4°C 12000rpm離心15min ；
(4)離心后分三層，吸取上層清液(小心盡量不要吸到中層蛋白)到新的離心管中，力口入等體積的異戊醇；
(5)混勻，-20°C靜置沉淀40min, 4°C 12000rpm 離心 15min ；
(6)離心后可見(jiàn)白色沉淀于管底，小心棄掉上清，加入500ul75%乙醇，4°C，7500rpm離心 5min ；
(7)棄去乙醇后再洗滌一次，干燥，加入適量RNase-free水溶解；
(8)RNA定量取IulRNA樣品，加入99ul無(wú)RNA酶水中，混勻，稀釋100倍，用無(wú)RNA酶水做空白對(duì)照，于核酸蛋白分析儀中測(cè)OD值，RNA濃度；
(9)RNA電泳檢測(cè)取Iul樣品上樣，電壓90V，跑30min，照膠。為了防止質(zhì)粒DNA的污染，提取的RNA用無(wú)RNase的DNA酶消化(IOXbuffer2yL，DNA酶O. luL，17.9yL RNA，反應(yīng)總體系20uL，37°C，lh)。然后按加入酚一氯仿抽提，去除DNA酶，異丙醇沉淀，最后用O. P/oDEPC水溶解。I %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果拍照。(見(jiàn)圖9)。3. Real time-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)⑶F9的表達(dá)豐度
GDF9的引物如下，GDF9上游引物SEQ ID NO: 14，下游引物SEQ ID NO: 15, PCR擴(kuò)增片段為151bp。同體系設(shè)倉(cāng)鼠β-actin基因?yàn)閮?nèi)參(β-actin上游引物SEQ ID N0:16，下游引物SEQ ID NO: 17)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增片段為428bp。以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物(工作濃度為IOpmol/μ L)進(jìn)行RT反應(yīng)。取總RNA 10μ L，65°C水浴lOmin，加Oligo-dT引物1μ L，70°C預(yù)變性5min，立即冰浴 5min ;在冰浴狀態(tài)下加入 5 X AMV 緩沖液 6 μ L, Rnasin O. 4 μ L(40U, Promega)，dNTP
I.5μ L, AMV O. 2μ L(8U, Promega)，用水補(bǔ)足至總體積 30μ L，混勻后于 42°C反應(yīng) Ih,80°C滅活5min。所有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用IXTE稀釋4倍，_20°C保存?zhèn)溆?。以RT反應(yīng)產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)(⑶F9擴(kuò)增片段151bp ； β -actin擴(kuò)增片段428bp)，體系的組成為10\ 0 緩沖液541^，2· 5mM dNTP 4μ ，上、下游引物(10pmol/>L)各1KL，模板2PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L)0. 3μ ，補(bǔ)加ddH20至50μ 。反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min ；95°C 30sec,56°C 30sec，72°C，30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。。
首先在熒光定量PCR專用96孔PCR板(置于冰上)的每個(gè)孔里分別加入 μ 模板(樣本的RT產(chǎn)物或系列標(biāo)準(zhǔn)品)，然后加入19μ1預(yù)混溶液(包括10μ1 Realtime PCRMaster Mix、l. 2 μΙΙΟμΜ引物、7. 8μ1滅菌雙蒸水)，總反應(yīng)體系為20μ1。用小心將熒光定量PCR專用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英國(guó))覆蓋在PCR板上，壓緊，保證每個(gè)孔不透氣，短暫離心。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并在每塊板上同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(以水為模板)。按ΑΒΙ7500型熒光定量PCR儀的操作說(shuō)明放入96孔PCR板，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為95 °C /lmin預(yù)變性；95°C /15s變性，56°C /15s退火，72°C延伸40s，循環(huán)40圈。在確認(rèn)目的基因與內(nèi)參照β-actin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率基本接近時(shí)(差異小于5% )，目的基因⑶F9的擴(kuò)增效率為93%，內(nèi)參β -actin的擴(kuò)增效率為91. 3%。目的基因mRNA表達(dá)豐度可以用
^ (I+ Em)Ctx
At/ Am= P計(jì)算得到。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系熒光圖見(jiàn)圖 ο。
￠+Erfrr結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與共轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-GDF9 質(zhì)粒和 pshRNA-copGFP Lentivector 空質(zhì)粒48h后相比，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-GDF9和慢病毒干擾質(zhì)粒LV- siRNA以后，⑶F9 mRNA表達(dá)極顯著下降(見(jiàn)圖11)。結(jié)果顯示三個(gè)慢病毒干擾質(zhì)粒都一定程度抑制了⑶F9的表達(dá)，數(shù)據(jù)分析表明LV- siRNA I和LV- siRNA II抑制效率為均達(dá)到100%，LV- siRNA III抑制效率為90%以上(見(jiàn)圖11)。轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒后的CHO細(xì)胞裂解液中GDF9蛋白濃度明顯下降(見(jiàn)圖12)。綜上所述，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明涉及的⑶F9 shRNA干擾質(zhì)?？捎行У馗深A(yù)⑶F9基因的表達(dá),可用于制造下調(diào)水牛生長(zhǎng)分化因子9基因表達(dá)的制劑,提聞水牛繁殖率。
權(quán)利要求
1.一種抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9基因表達(dá)的siRNA，其特征在于，所述SiRNA的正義鏈具有以下任一序列GDF9-1 SEQ ID NO:I ；GDF9-2 SEQ ID NO:2 ；GDF9-3 SEQ ID NO:3。
2.—種shRNA，其特征在于含有權(quán)利要求I所述的siRNA。
3.如權(quán)利要求2所述shRNA，其特征在于，是以下任一雙鏈核苷酸序列 ⑶F9-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列； ⑶F9-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列； ⑶F9-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDN0:9所示的核苷酸序列。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于是由權(quán)利要求3所述的shRNA編碼基因與出發(fā)載體構(gòu)建。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述出發(fā)載體為慢病毒載體pshRNA-copGFP Lentivector0
6.如權(quán)利要求I所述的siRNA在制備抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求I所述的siRNA在提高水牛繁殖率上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制水牛生長(zhǎng)分化因子9(growthdifferentiationfactor9，GDF9)基因表達(dá)的siRNA，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的siRNA正義鏈具有SEQ ID NO:1～3所示的任一序列。本發(fā)明還公開(kāi)了含有該siRNA的shRNA編碼基因及由其構(gòu)建的慢病毒干擾質(zhì)粒pshRNA-copGFPLentivector。通過(guò)實(shí)時(shí)定量Real-timePCR檢測(cè)，相對(duì)表達(dá)量公式計(jì)算，其中兩個(gè)siRNA片段分別對(duì)水牛GDF9mRNA抑制效率超過(guò)100%，ELISA檢測(cè)GDF9蛋白表達(dá)量也相應(yīng)降低。本發(fā)明的siRNA片段及其表達(dá)載體可用于制備抑制水牛GDF9表達(dá)的制劑，能夠顯著下調(diào)GDF9基因的表達(dá)量。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102965372SQ20121043802
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者習(xí)欠云, 張永亮, 施振旦, 肖敏, 蕉莉, 石德順, 劉慶友 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)