專利名稱：一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨軟骨生物修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生活的發(fā)展，骨軟骨缺損的發(fā)病率逐年上升，據(jù)保守估計(jì)，美國(guó)每年大約有700萬因骨科疾病就診，醫(yī)療消耗約2150億美元。我國(guó)每年因多種病因誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)病也為數(shù)眾多，消耗巨大。目前臨床采用的關(guān)節(jié)假體置換為有效的治療方法之一。但手術(shù)置換關(guān)節(jié)，不僅價(jià)格昂貴，且有并發(fā)癥危險(xiǎn)。近年來應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)技術(shù)、原理研究開發(fā)替代用組織工程軟骨為軟骨缺損的修復(fù)開辟了新途徑和新方法。隨著組織工程技術(shù)發(fā)展，組織工程骨軟骨因同時(shí)具有類似骨、軟骨和骨軟骨間無縫移行區(qū)的結(jié)構(gòu)，完全模擬構(gòu)建自然的骨軟骨結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，具有廣泛的應(yīng)用前景。因而， 加強(qiáng)組織工程骨軟骨的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，闡明其在軟骨組織修復(fù)中的作用和轉(zhuǎn)歸機(jī)制，對(duì)于提高對(duì)組織工程骨軟骨的認(rèn)識(shí)，拓展其應(yīng)用范圍具有重要的科學(xué)意義。聚乳酸/ 聚羥基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，在美國(guó)已通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典。這類材料無毒，無抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力學(xué)強(qiáng)度，可以通過控制成份含量來調(diào)節(jié)材料的降解速度，是目前骨軟骨組織工程研究和應(yīng)用最為廣泛的一類材料。然而由于PLGA材料表面缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)以及親水性和細(xì)胞親和性不足，影響了細(xì)胞在其表面上的粘附生長(zhǎng)，很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。近年來，隨著對(duì)PLGA改性研究的不斷進(jìn)行，其性能得到不斷優(yōu)化，一些新型PLGA材料相繼出現(xiàn)。例如①膠原修飾改性的PLGA仿生材料，采用離子表面處理方法在材料表面引入功能基團(tuán)或功能鏈，可提高支架材料表面的黏附性。采用等離子處理PLGA膜，引入陽離子化的凝膠抗基，有效改善了細(xì)胞對(duì)PLGA降解支架材料的親和性。一種由HA/膠原/PLGA三層結(jié)構(gòu)組成的納米復(fù)合膜，顯著提高了材料的生物活性。② 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)修飾改性PLGA，用交聯(lián)劑將RGD結(jié)合到PLGA微球表面進(jìn)行改性，顯示提高細(xì)胞的粘附和細(xì)胞生長(zhǎng)率。③羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA) 修飾改性PLGA，制備磷灰石/PLGA，多孔的PLGA/HA復(fù)合材料具有較好的韌性，提高骨結(jié)合能力。目前基于PLGA微球的組織工程支架，由于具有制備簡(jiǎn)便，生物降解可控且降解產(chǎn)物毒性低、緩控釋等優(yōu)點(diǎn)，而受到研究者的青睞。然而基于PLGA微球的組織工程骨軟骨在修復(fù)軟骨缺損中形成新生軟骨組織的數(shù)量和質(zhì)量都遠(yuǎn)未滿足臨床需要，主要原因是PLGA 微球大小不均一，粘附性低，孔隙率不均一，大多數(shù)細(xì)胞僅帖服在材料表面，無法向材料深部長(zhǎng)入，缺乏足量的細(xì)胞種植，而無法獲得充足的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，很大程度上限制了 PLGA 微球支架組織工程軟骨在臨床的應(yīng)用。干細(xì)胞作為種子細(xì)胞一直是組織工程骨研究的熱點(diǎn)之一。胚胎干細(xì)胞(Embryonicstem cells, ESCs)系全能干細(xì)胞，具有無限增殖和體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍具有可誘導(dǎo)產(chǎn)生從滋養(yǎng)層到內(nèi)、中、外胚層所有細(xì)胞的能力，但由于倫理學(xué)和致畸發(fā)生率偏高等原因使得基于 ESCs的組織工程骨研究相對(duì)滯后。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)能在體外增殖維持非分化狀態(tài)并具有分化成骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織的潛能，目前已在機(jī)體多個(gè)組織器官中成功提取到具有分化潛能的MSCs。在多來源的MSCs中，又以人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)較多被應(yīng)用于組織工程骨軟骨的研究，這些研究提示hBMSC將在組織工程骨軟骨方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，該微球支架微球橋連均勻，表面結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)生明顯溶解，保持理想孔隙率，可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)PLGA微球支架具有TGF-β 3/BMP-2梯度釋放特征。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)單、易于控制。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復(fù)復(fù)合材料中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，首先制備？11^均質(zhì)微球以及16 -0 3和81^-2/ 11^ 微球，分別凍干備用，將凍干的上述微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調(diào)整ddH20在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結(jié)上述微球，即形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。其中PLGA為聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物(polydactic-co-glycolic acid), PLGA)，TGF- β 3 為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 _ β 3 (transforming growth factor β 3，TGF- β 3)， ΒΜΡ-2 為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2 )，ddH20 為雙蒸水。本發(fā)明所述的PLGA均質(zhì)微球通過以下方法制備獲得按摩爾比為1:0.3-3，取乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合生成PLGA，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將PLGA 溶解液經(jīng)過均質(zhì)形成均質(zhì)聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經(jīng)攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成PLGA均質(zhì)微球，儲(chǔ)存?zhèn)溆眉纯?。其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為1_5%，聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的混合溶液中PVA的質(zhì)量百分含量為0. 1-1. 0%，攪拌時(shí)間為3-4h，凍干時(shí)間為 45-50h，儲(chǔ)存溫度為-20°C。采用本發(fā)明方法制備獲得PLGA微球具有良好梯度釋放性能、降解率、生物相容性，同時(shí)是一種均一直徑的微球，可顯著提高力學(xué)性能，同時(shí)可攜帶多種功能性的生物生長(zhǎng)因子，間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA支架上具有良好的成骨和軟骨分化能力。采用本發(fā)明方法制備的PLGA微球，微球大小均一適中，支架空隙率均一，隨著 PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，進(jìn)而可形成類似于松質(zhì)骨的空間結(jié)構(gòu)，可為骨軟骨再生重建提供物理支架和最佳的化學(xué)環(huán)境，伴隨種子細(xì)胞釋放進(jìn)入支架內(nèi)部，更有助于后期新生骨軟骨組織形成。
本發(fā)明所述的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球通過如下方法制備獲得將TGF-β 3溶于牛血清白蛋白BSA中制成TGF- β 3原液，將ΒΜΡ-2溶于牛血清白蛋白BSA中制成ΒΜΡ-2原液，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將TGF- β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液混勻，冰上超聲攪拌后形成均勻的乳液，將該乳液經(jīng)過均質(zhì)形成均質(zhì)聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經(jīng)攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成TGF- β 3/BMP-2-PLGA 微球，儲(chǔ)存?zhèn)溆眉纯?。采用本發(fā)明方法制備獲得的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球，其中TGF- β 3和ΒΜΡ-2 生長(zhǎng)因子作為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子，可促進(jìn)種子細(xì)胞向成骨和軟骨細(xì)胞方向分化， 有利于更多的原始細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞向損傷區(qū)域聚集，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴(kuò)散。該 TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球安全無毒、具有良好的生物相容性、生物降解性，具有良好的成囊和成膜的性能。其中TGF- β 3原液的最終濃度為l_5Pg/mL，ΒΜΡ-2原液的最終濃度為0. 1-0. 5μδ/ mL, PLGA的溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為1_5%，TGF-β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液的體積比為1:1:20，冰上超聲攪拌時(shí)的時(shí)間為10-30秒，震動(dòng)幅度為30-60% ；聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的溶液中PVA的質(zhì)量百分含量為0. 3-1%，攪拌時(shí)間為3-4h，凍干時(shí)間為45-50h，儲(chǔ)存溫度為-20°C。本發(fā)明所述的PLGA均質(zhì)微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的粒徑為 50-300Mm。本發(fā)明所述的PLGA均質(zhì)微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的質(zhì)量比1 1。本發(fā)明采用可編程控制注射泵將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，所述的模具為圓柱形玻璃容器，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3-2/3，采用無水乙醇燒結(jié)PLGA均質(zhì)微球以及TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球0. 5-1.證，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥后，在_20°C儲(chǔ)存即可。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架的制備方法，含以下步驟
(1)制備PLGA均質(zhì)微球，凍干備用；
(2)制備TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，凍干備用；
(3)將凍干的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調(diào)整ddH20在模具中用量，在模具中堆積TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球，采用無水乙醇燒結(jié)TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復(fù)復(fù)合材料中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明采用的原材料均為安全無毒的聚合物體系，PLGA由兩種單體一乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國(guó)PLGA通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥
(2)本發(fā)明制備的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球中，TGF- β 3和ΒΜΡ-2作為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子，可促進(jìn)種子細(xì)胞向成骨和軟骨細(xì)胞方向分化，有利于更多的原始細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞向損傷區(qū)域聚集。(3)本發(fā)明制備的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球支架有一定的材料力學(xué)強(qiáng)度，使 PLGA微球支架在修復(fù)負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損中的應(yīng)用成為可能，新型合成技術(shù)制備PLGA微球支架可減少微球表面變性發(fā)生，有利于大量種子細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部，類似于松質(zhì)骨的空間結(jié)構(gòu)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的擴(kuò)散，隨著PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，可為骨軟骨再生和重建提供物理支架和最佳的化學(xué)環(huán)境，有助于后期新生骨軟骨組織形成，與周圍組織緊密接觸，易于操作、最大限度減少創(chuàng)傷，降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、減少感染危險(xiǎn)、 疤痕形成和治療費(fèi)用。(4)本發(fā)明制備獲得微球支架中，成骨和軟骨誘導(dǎo)因子(ΒΜΡ-2和TGF-β 3)分別沿微球支架兩端向?qū)?cè)以最大濃度梯度釋放，種子細(xì)胞在PLGA支架內(nèi)沿生長(zhǎng)因子濃度梯度分化誘導(dǎo)形成類軟骨和類成骨細(xì)胞，并獲得類似自然結(jié)構(gòu)的骨、軟骨和無縫移行區(qū)，可為骨軟骨的再生和重建提供最佳的空間環(huán)境，為骨軟骨再生重建提供最佳的物理化學(xué)環(huán)境， 模擬天然骨軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分，使材料具有優(yōu)異的生物相容性及可調(diào)的物理機(jī)械性能、生物降解性能，更有助于后期新生骨軟骨形成。(5)本發(fā)明制備的新型梯度釋放PLGA微球支架不僅保留了 PLGA原有的良好生物相容性，而且還顯著提高了 PLGA微球支架的力學(xué)性能、骨軟骨誘導(dǎo)作用和攜帶種子細(xì)胞能力，具有優(yōu)異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細(xì)胞，用于由腫瘤、外傷、嚴(yán)重感染、先天畸形等多種疾病造成的骨軟骨缺損的治療。(6)本發(fā)明制備工藝易于控制，操作簡(jiǎn)便，采用本發(fā)明方法制備獲得微球支架可最大限度減少創(chuàng)傷，降低手術(shù)難度、減少病人痛苦、減少感染危險(xiǎn)、疤痕形成和治療費(fèi)用，在組織工程骨軟骨研究領(lǐng)域具有一定的先進(jìn)性和創(chuàng)新性，可為組織工程骨軟骨研究和臨床應(yīng)用提供新思路和新方法，該支架材料能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，相關(guān)產(chǎn)品具有較大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，可以很好地應(yīng)用到各類基于軟骨缺損的修復(fù)中，充分發(fā)揮其良好、自然的修復(fù)能力，具有廣闊的臨床應(yīng)用和市場(chǎng)前景。


圖1是實(shí)施例2中燒結(jié)制備的PLGA微球多孔性的支架的SEM圖以及人臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在支架中培養(yǎng)2周時(shí)的實(shí)時(shí)圖像，其中序號(hào)1和2 表示SEM顯示燒結(jié)制備的PLGA 微球多孔性的支架，序號(hào)1的圖中可見典型的微連接網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比例尺序號(hào)1和序號(hào)2分別為100 Mm和50 Mm，序號(hào)3和4的圖是人臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在支架中培養(yǎng)2周時(shí)的實(shí)時(shí)圖像，比例尺1000 Mm；
圖2是實(shí)施例2中燒結(jié)制備的PLGA微球多孔性的支架接種細(xì)胞培養(yǎng)3周熒光顯微照片，其中序號(hào)1表示活細(xì)胞和死細(xì)胞，序號(hào)2的圖表示活細(xì)胞，序號(hào)3的圖表示死細(xì)胞。比例尺100 Mm。圖3是實(shí)施例2中構(gòu)建的TGF-β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架圖，其中序號(hào) 1表示制備的骨軟骨整體圖，序號(hào)2表示微觀圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。實(shí)施例1
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球
制備直徑50Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :1的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用二氯甲烷DCM (DCM 30%ff/V,質(zhì)量體積比)溶解 PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為3%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有 0. 5% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干48小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
100 μδ ΒΜΡ-2加入10 mLO. 5 Pg/mL牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到 0. 2 Pg/mLBMP-2 原液。50 μδ TGF-β 3 用 25 Pg/mL BSA 溶解為 1 Pg/mL 的 TGF-β 3 原液， 500 mg PLGA 溶于 5mL DCM (WT6. 5 克，20%W/V)。250 μ ΒΜΡ_2 和 TGF-β 3 原液分別與 5 mL PLGA溶液混合，冰上超聲攪拌(50%震動(dòng)幅度，20秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴， 流入含有質(zhì)量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干48小時(shí)，-20°C 儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。不同粒徑的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。3.構(gòu)建TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架
將直徑為50Mm的凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球按質(zhì)量體積(g/ mL)比為2. 5%分散在ddH20中，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1分別裝入20 mL注射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具 (直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結(jié)PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球 1小時(shí)，形成TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，_20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例2
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球
制備直徑IOOMffl的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :0. 3的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質(zhì)量體積比) 溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為1%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有0.8% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干50小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 3 Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為2Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質(zhì)量百分含量為21 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動(dòng)幅度，20秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有質(zhì)量百分含量為0. 3%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干50小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用上述制備獲得的直徑100 Mm TGF-i3 3和BMP-2 /PLGA微球以及直徑為IOOMm的空白PLGA微球制備4 mm (高)x 4 mm(直徑)的圓柱體結(jié)構(gòu)支架。凍干TGF-β 3和ΒΜΡ-2/ PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5%W/V)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1分別裝入20 mL注射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的2/3，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結(jié)PLGA微球、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時(shí)，形成內(nèi)部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例3
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球
制備直徑150Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :2的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質(zhì)量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有 1.0% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干45小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 4 Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為3Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質(zhì)量百分含量為3% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動(dòng)幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有質(zhì)量百分含量為0. 8%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干50小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑150 Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為150Mm的空白PLGA微球制備4 mm (高)χ 4 mm(直徑)的圓柱體結(jié)構(gòu)支架。凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5%W/V)，其中TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1，分別裝入20mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積 PLGA微球、TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結(jié)PLGA微球、TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球1小時(shí)，形成內(nèi)部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2 天，-20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例4
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球
制備直徑200Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :3的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質(zhì)量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為2%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有 0.3% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干47小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 5Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為5Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質(zhì)量百分含量為5% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(60%震動(dòng)幅度，10秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有質(zhì)量百分含量為1. 0%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干47小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑200 Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為200Mm的空白PLGA微球制備4 mm (高)χ 4 mm(直徑)的圓柱體結(jié)構(gòu)支架。凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5% W/ V)，其中TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積 PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。100%乙醇燒結(jié)PLGA微球1小時(shí)，形成內(nèi)部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，_20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例5
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球
制備直徑250Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :0. 5的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質(zhì)量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為2. 5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有0.6% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干49小時(shí)，_20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。不同粒徑的均質(zhì) PLGA微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 35Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為4. 5Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質(zhì)量百分含量為 3. 5%的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20 混合，冰上超聲攪拌(50%震動(dòng)幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有質(zhì)量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3 和BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干49小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑250Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為250Mm的空白空白PLGA微球制備4mm(高)x4mm(直徑)的圓柱體結(jié)構(gòu)支架。凍干TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球和空白 PLGA微球分散在ddH20(2. 5%ff/V,微球與水的質(zhì)量體積比)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結(jié)PLGA微球、、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時(shí)，形成內(nèi)部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例6
1.構(gòu)建均質(zhì)PLGA微球制備直徑300Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :1的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經(jīng)隨機(jī)聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質(zhì)量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有 0. 5% (質(zhì)量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干48小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。不同粒徑的均質(zhì)PLGA 微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。2.構(gòu)建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. ^g/mLBMP-2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為Wg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質(zhì)量百分含量為1% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動(dòng)幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發(fā)生器，經(jīng)一個(gè)小號(hào)同軸噴針頭，產(chǎn)生均質(zhì)聚合物液滴，流入含有質(zhì)量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時(shí)，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干48小時(shí)，-20°C儲(chǔ)存，測(cè)量微球直徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形態(tài)備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑300Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為300Mm的空白空白PLGA微球制備4mm(高)x4mm(直徑)的圓柱體結(jié)構(gòu)支架。凍干TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球和空白 PLGA微球分散在ddH20(2. 5%ff/V,微球與水的質(zhì)量體積比)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質(zhì)量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個(gè)額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結(jié)PLGA微球、、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時(shí)，形成內(nèi)部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲(chǔ)存。以下為上述實(shí)施例構(gòu)建的TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架的應(yīng)用試驗(yàn) 1. hBMSCs 培養(yǎng)
自體hBMSCs的體外培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)從患者骼后上棘經(jīng)穿刺抽取骨髓10-20 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液上(密度1.073 g/L，Pharmacia公司，美國(guó))，骨髓與分離液的比例為1 2,2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，以2X IO7 cell/cm2 的密度接種于培養(yǎng)皿，進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增，取第四代hBMSCs備用。
表1實(shí)驗(yàn)分組共計(jì)10組
權(quán)利要求
1.一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是通過以下方法制備獲得首先制備PLGA均質(zhì)微球以及TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，分別凍干備用，將凍干的上述微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調(diào)整ddH20在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結(jié)上述微球，即形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即 TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的PLGA均質(zhì)微球通過以下方法制備獲得按摩爾比為1:0. 3-3，取乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合生成PLGA，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將PLGA溶解液經(jīng)過均質(zhì)形成均質(zhì)聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經(jīng)攪拌，過濾、 洗滌和凍干后形成PLGA均質(zhì)微球，儲(chǔ)存?zhèn)溆眉纯伞?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是其中PLGA溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為1_5%，聚合物液滴與聚乙烯醇 PVA混勻后形成的混合溶液中PVA的質(zhì)量百分含量為0. 1-1. 0%，攪拌時(shí)間為3-4h，凍干時(shí)間為45-50h，儲(chǔ)存溫度為_20°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球通過如下方法制備獲得將TGF- β 3溶于牛血清白蛋白BSA中制成TGF-β 3原液，將ΒΜΡ-2溶于牛血清白蛋白BSA中制成ΒΜΡ-2原液，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將TGF- β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液混勻，冰上超聲攪拌后形成均勻的乳液，將該乳液經(jīng)過均質(zhì)形成均質(zhì)聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經(jīng)攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成TGF- β 3/BMP-2-PLGA 微球，儲(chǔ)存?zhèn)溆眉纯伞?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是其中TGF-β 3原液的最終濃度為l_5Pg/mL，ΒΜΡ-2原液的最終濃度為 0. 1-0. 5Pg/mL，PLGA的溶解液中PLGA的質(zhì)量百分含量為1-5%，TGF_3 3原液、ΒΜΡ-2原液和 PLGA溶解液的體積比為1:1:20，冰上超聲攪拌時(shí)的時(shí)間為10-30秒，震動(dòng)幅度為30-60%; 聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的溶液中PVA的質(zhì)量百分含量為0. 3-1%，攪拌時(shí)間為3-4h，凍干時(shí)間為45-50h，儲(chǔ)存溫度為-20°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的PLGA均質(zhì)微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的粒徑為50_300Mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是=PLGA均質(zhì)微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的質(zhì)量比1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，其特征是采用可編程控制注射泵將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，所述的模具為圓柱形玻璃容器，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3-2/3，采用無水乙醇燒結(jié)PLGA均質(zhì)微球以及TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球0. 5-1.證，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥后，在_20°C儲(chǔ)存即可。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架的制備方法，其特征是包含以下步驟(1)制備PLGA均質(zhì)微球，凍干備用；(2)制備TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，凍干備用；(3)將凍干的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調(diào)整ddH20在模具中用量，在模具中堆積TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球，采用無水乙醇燒結(jié)TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質(zhì)微球，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復(fù)復(fù)合材料中的應(yīng)用。
全文摘要
一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長(zhǎng)因子梯度釋放微球支架，該微球支架是通過如下方法制備獲得的首先制備PLGA均質(zhì)微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，將兩微球分散于ddH2O中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設(shè)有過濾裝置的模具中，采用ddH2O過濾并調(diào)整ddH2O在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結(jié)上述微球即形成。本發(fā)明制備的微球支架不僅保留了PLGA原有的良好生物相容性，而且顯著提高了微球支架力學(xué)性能、骨軟骨誘導(dǎo)作用和攜帶種子細(xì)胞能力，具有優(yōu)異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細(xì)胞，用于由腫瘤、外傷、嚴(yán)重感染、先天畸形等多種疾病造成的骨軟骨缺損的治療。
文檔編號(hào)A61L27/18GK102319449SQ20111021564
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者趙亮 申請(qǐng)人:趙亮