專利名稱：Tnf結(jié)合肽和tnfr1封閉肽及其在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及能拮抗腫瘤壞死因子-α (TNF-α)生物學(xué)活性的 TNF結(jié)合肽、TNFRl封閉肽等小分子多肽及TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白。
背景技術(shù)：
TNF-α是一類重要的促炎癥細(xì)胞因子，是促炎細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)中的起始因子， 可促進(jìn)一系列促炎細(xì)胞因子(如IL-l、IL-6、IL-8等)的釋放。臨床研究證實(shí)在多種感染或非感染性炎癥及其并發(fā)癥(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病、內(nèi)毒素休克、急性肝壞死、 Crohn' s病等)的發(fā)生和發(fā)展中，全身或炎癥局部TNF-a產(chǎn)生增加起著關(guān)鍵作用；體內(nèi) TNF-α水平過(guò)高，往往預(yù)示病人預(yù)后不良。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單一應(yīng)用大劑量TNF-α即可直接導(dǎo)致內(nèi)毒素樣休克，而用抗TNF抗體則可減輕及阻止內(nèi)毒素性休克的發(fā)生。轉(zhuǎn)TNF-α基因小鼠易患慢性關(guān)節(jié)炎；最近報(bào)道給大鼠輸入TNF-α可誘導(dǎo)胰島素抵抗，此為II型糖尿病發(fā)生的重要機(jī)制。(Williams R0, Methods Molecular Biology, 2006, 361 265-284 ；Yano Y 等，Diabetes Care, 2004, 27 (3) :844_845。)與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外呈大幅度上升的趨勢(shì)。例如，全球II型糖尿病患者總?cè)藬?shù)已超過(guò)1. 5億人，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3億人；在我國(guó)大城市中，20歲以上人群的II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)發(fā)病率達(dá)到10%，另有10%為糖調(diào)節(jié)異常，即每5個(gè)成年人中就有一個(gè)糖代謝異常。在我國(guó)，目前已有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者400 萬(wàn)以上，患病率達(dá)總?cè)丝诘?.32-0. 34%，Crohn' s病(人群潰瘍性結(jié)腸炎)、銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在我國(guó)正在逐年上升。由于TNF-α在多種疾病中有重要的致病作用，因此，以TNF-α或TNF受體為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，有效阻斷上述病理過(guò)程，治療TNF相關(guān)疾病，成為國(guó)際藥學(xué)界研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)(Steed Paul M 等，Science，2003，301，1895 1898 ；Scott D. L.等，The New England Journal of Medicine, 2006, 355 :704-712)。目前，國(guó)際上已獲 FDA 和 EMEA (European Medicines Evaluation Agency)正式批準(zhǔn)，在美國(guó)和歐洲已進(jìn)入臨床試用階段的抗TNF-α 試劑主要有抗TNF抗體鼠人嵌合單克隆抗體(IgGl)，商品名為infliXimab、cA2、Remicade 或 Centocor，(Centocor, Inc, Malvern, PA, FDA licensed. #1242，8/24/1998)靜脈注射，人源化抗 TNF 抗體 adalimumab (商業(yè)名Humira，CDP571 License 12/2002)，全人源化抗體 (D2E7)也已問(wèn)世。可溶性TNF受體TNFRl-Fc融合蛋白(Etanerc印t、Enbrel或Immunex) (Immunex Corp, Seattle, WA, License#1132，6/6/2000)。上述商品化的抗TNF- α試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)雖然已取得較好的臨床治療作用，但仍然存在一系列問(wèn)題，如存在潛在的副作用、來(lái)源受到限制、生物穩(wěn)定差、價(jià)格昂貴等。目前，臨床試驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)上述抗TNF-α試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)存在導(dǎo)致紅細(xì)胞和血小板減少、結(jié)核感染、上呼吸道、尿路感染、皮疹、發(fā)熱、低/高血壓等副作用，嚴(yán)重者有可引發(fā)腫瘤。目前，研究開(kāi)發(fā)安全性好、毒副作用小、成本低的小分子 TNF-α 拮抗劑已受到人們的關(guān)注。(Steed Paul Μ.等，Science，2003，301，1895 1898 ； Gonzale-Rey E 等，Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 (11)4228-4233。)
噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)(phage display techniques, PDT)是九十年代初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興技術(shù)(Lowman H. B.等.Annu. Rev. Biophys. Biomol Struct 1997 ；26 401-24)， 是研究蛋白質(zhì)分子之間相互作用的一個(gè)有效工具。PDT所得到的肽均是來(lái)源于噬菌體肽庫(kù)，氨基酸序列分析得到肽的序列，人工合成進(jìn)行機(jī)制研究。隨著肽庫(kù)構(gòu)建及篩選技術(shù)的不斷發(fā)展、完善，使其對(duì)研究蛋白質(zhì)識(shí)別機(jī)制、確定抗原決定簇、藥物設(shè)計(jì)、疫苗研制等方面提供了全新的思路與先進(jìn)的手段?，F(xiàn)有的噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)主要有兩種非限制性肽庫(kù)(線性肽庫(kù))和限制性肽庫(kù)(例如半胱氨酸環(huán)限制的肽庫(kù)、引入α-螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)的突變庫(kù)等)。一般研究所選用的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)都是線性的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面選擇噬菌體12線肽庫(kù)，以rhTNFRl為誘餌，從中釣取出一條線性的 12肽，該肽可與TNFRl結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF- α與TNFRl的結(jié)合，從而拮抗TNF- α的生物學(xué)效應(yīng)，我們將此肽命名為“TNFR1封閉肽”。但人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內(nèi)的半衰期較短，從而制約其臨床應(yīng)用。為了克服這些缺陷，本發(fā)明又在此工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白表達(dá)載體PIG/3C-TNFR1BP，并借助可高表達(dá)外源蛋白的真核細(xì)胞C0S7成功表達(dá)TNFRlBP/hFc融合蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種融合蛋白也能有效地競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α與TNFRl結(jié)合，從而發(fā)揮拮抗TNF-α生物學(xué)活性的作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這種融合蛋白能預(yù)防和治療高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型。另一方面，由于與線肽庫(kù)相比噬菌體隨機(jī)環(huán)肽庫(kù)具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)由于環(huán)肽固定了兩個(gè)半胱氨酸殘基，附加二硫鍵的限制可以幫助維持肽的折疊結(jié)構(gòu)。因此，環(huán)肽庫(kù)比線性肽庫(kù)更可能篩選到高親和力、高特異性的肽。因?yàn)樗?jīng)歷了構(gòu)象的選擇，使之盡可能與靶分子表面和內(nèi)部結(jié)合。(2)環(huán)肽由于其構(gòu)象的復(fù)雜性，故其降解速度較線肽慢，使之半壽期明顯延長(zhǎng)。(3)由于受到轉(zhuǎn)化效率的影響，噬菌體肽庫(kù)不可能達(dá)到完全的隨機(jī)化，各種肽庫(kù)的多樣性就存在差異。因此，本發(fā)明又選擇噬菌體C7C環(huán)肽庫(kù)，分別以rhTNF-α和rhTNFRl 為誘餌，從該環(huán)肽庫(kù)中篩選TNF結(jié)合肽和TNFRl封閉肽。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種環(huán)肽能抑制TNF-α介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種環(huán)肽抑制三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明的目的在于提供一種TNFRl封閉肽(線12肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白。本發(fā)明的目的還在于提供編碼所述TNFRl封閉肽和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明目的還在于提供制備本發(fā)明融合蛋白的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與一條TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)。本發(fā)明的目 的還在于提供上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽) 的核酸分子。本發(fā)明的目的還在于將上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)和TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)應(yīng)用于治療潰瘍性結(jié)腸炎；將TNF- α受體1封閉肽用于治療關(guān)節(jié)炎；將TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白用于治療II型糖尿病。本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容如下一、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白1.借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫(kù)中篩選到可與 TNFRl結(jié)合的含12個(gè)氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)；2.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)人工合成的該封閉肽可以完全封閉大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(何亞萍等，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003，19 (6) 385-387)；3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該封閉肽可有效減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的局部關(guān)節(jié)腫脹及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，并可抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，顯示具有較好的治療作用(何亞萍等， 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38 (12) :889-892)。 4.構(gòu)建TNF封閉肽-IgFc融合蛋白(1)借助DNA合成技術(shù)，構(gòu)建該封閉肽的編碼DNA片段(并含內(nèi)切酶位點(diǎn))；(2)借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達(dá)載體中，構(gòu)建TNFRlI封閉肽-IgFc的重組體，其技術(shù)路線見(jiàn)圖36。(3)將此重組體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞使之成功表達(dá)TNFRl封閉肽-hFc融合蛋白；利用間接免疫熒光、流式細(xì)胞技術(shù)、胞毒抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)此融合蛋白可與細(xì)胞表面TNFRl結(jié)合， 從而抑制TNF- α的生物學(xué)活性；用RT-PCR及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)證實(shí)此融合蛋白可明顯抑制TNF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞NF-KB核轉(zhuǎn)位，從而抑制促炎細(xì)胞因子IL-I β mRNA和IL_8mRNA 的轉(zhuǎn)錄。(4)將重組體轉(zhuǎn)染CHO-Kl和BHK-21細(xì)胞并建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，對(duì)其分泌的肽-IgFc融合蛋白進(jìn)行純化并檢測(cè)其穩(wěn)定性和生物學(xué)效應(yīng)；5.融和蛋白的主要藥效研究，如體外對(duì)炎性細(xì)胞活化的影響以及體內(nèi)對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠引起的II型糖尿病的預(yù)防和治療作用。二、TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)1.采用噬菌體隨機(jī)環(huán)9肽庫(kù)展示技術(shù)分別以hrTNF-α和hrTNFRl為誘餌進(jìn)行親和篩選及生物學(xué)效應(yīng)鑒定得到分別能與TNF-α和TNFRl特異性結(jié)合的TNF結(jié)合肽 (環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)。(尹丙姣等，華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2005， 34(6)670-677)2.外實(shí)驗(yàn)證實(shí)人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細(xì)胞膜上TNFRl結(jié)合；非變性聚丙烯凝膠電泳證明TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽之間不互為配體和受體而相互結(jié)合；TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽對(duì)TNF- α的細(xì)胞毒效應(yīng)均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強(qiáng)，二者聯(lián)用的效果更好；TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽聯(lián)用能有效抑制TNF-α和IFN-Y誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度，抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-Ιβ、 IL-SmRNA轉(zhuǎn)錄。(尹丙姣等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜，2007,已校對(duì)，待發(fā)表)
3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽聯(lián)用可顯著減輕TNBS誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的病理?yè)p傷，改善癥狀，有效抑制大鼠血清和結(jié)腸組織中NO含量以及結(jié)腸組織中MPO活性的活性，抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Il- β、IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白的表達(dá)，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用。(尹丙姣等，免疫學(xué)雜志，2007，已投稿)通過(guò)以上所述并結(jié)合后文實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出本發(fā)明的特征和優(yōu)
點(diǎn)ο



一、圖1至圖22 TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白圖ITNFRl封閉肽(12線肽)對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的大鼠腹腔ΜΦ呼吸爆發(fā)的影響(抑制作用)圖2. TNFRl封閉肽對(duì)TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔ΜΦ IL-I β mRNA的影響圖3. TNFRl封閉肽對(duì)TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔ΜΦ TNF- α mRNA的影響圖4. TNFRl封閉肽對(duì)TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔MONF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位的影響圖5. TNFRl封閉肽對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理改變的影響(Χ200)圖6. TNFRl封閉肽對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔ΜΦ IL-I β mRNA的影響圖7. TNFR封閉肽對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔ΜΦTNF- α mRNA的影響圖8.重組表達(dá)載體pIG/3C-TNFRBP的酶切鑒定圖譜圖9.融合蛋白TNFRI-hlgGFc的表達(dá)濃度與轉(zhuǎn)染時(shí)間的關(guān)系圖 10.融合蛋白 TNFRI-IgGFc 的 Western-Blotting 鑒定圖11.間接免疫熒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白與TNFR的結(jié)合圖12.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNFR封閉肽-hlgGFc融合蛋白與TNFR的結(jié)合能力圖13.胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白對(duì)TNF-α胞毒效應(yīng)的拮抗作用圖14.融合蛋白對(duì)TNF- α誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IL-1 β mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖15.融合蛋白對(duì)TNF-α誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IL_8mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖16.融合蛋白對(duì)TNF- α誘導(dǎo)單核細(xì)胞NF- κ B核轉(zhuǎn)位的影響圖17.高脂高糖誘導(dǎo)大鼠肥胖和胰島素抵抗圖18.融合蛋白可抵抗高脂高糖誘導(dǎo)的大鼠肥胖圖19.融合蛋白對(duì)肥胖大鼠糖耐量的影響圖20.融合蛋白能提高胰島素的敏感性圖21.融合蛋白抑制TNF-α的產(chǎn)生圖22.融合蛋白促進(jìn)組織中胰島素刺激的IRS-I酪氨酸磷酸化二、圖23至35 =TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)圖23.不同噬菌體克隆對(duì)TNF- α誘導(dǎo)U937細(xì)胞毒效應(yīng)的抑制率作用圖24.噬菌體聯(lián)用對(duì)TNF- α誘導(dǎo)U937細(xì)胞毒效應(yīng)的抑制作用圖25.各噬菌體與靶蛋白結(jié)合的特異性圖26. TNFR封閉噬菌體對(duì)TNF- α誘導(dǎo)IL-1 β mRNA水平的抑制作用，圖中1.陰性對(duì)照； 2. TNF- α ； 3. TNF- α +pha. X2 ； 4. TNF- α +pha. X4 ；
5. pha. X2 ；6. pha. X4 ； Μ. Marker圖27. TBP和TRBP對(duì)GFP-TNF融合蛋白與L929細(xì)胞TNF受體結(jié)合的影響，圖中A GFP-TNF B =GFP-TNF+ 無(wú)關(guān)肽 C :GFP_TNF+p印· 38+X4圖28. TBP和TRBP的非變性聚丙烯凝膠電泳圖，圖中1 :p印.38 2 :p印.X4 3 pep.38+X4圖29. TBP和TRBP對(duì)TNF- α介導(dǎo)的U937細(xì)胞毒效應(yīng)抑制作用的劑量反應(yīng)關(guān)系圖30. TBP和TRBP對(duì)TNF- α和IFN- γ誘導(dǎo)單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響圖31. TBP和TRBP對(duì)TNF- α誘導(dǎo)Mo的IL-1 β、IL_8mRNA的抑制作用，圖中 1 正常對(duì)照2 =TNFa 對(duì)照 3 :TNF_a +ρ印· Χ4 ；4:TNF-a +pep. 38 5 :TNF-a +pep. 38+X4圖32.各種治療對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸病理改變的影響圖33.各實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸組織病理改變(IOX)，圖中A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.無(wú)關(guān)肽對(duì)照組D.聯(lián)合多肽治療組； E.抗體治療組 F. 5-氨基水楊酸治療組圖34.各種治療對(duì)結(jié)腸炎大鼠腹腔ΜΦ中IL-I β和IL_8mRNA水平的影響，圖中1.生理鹽水對(duì)照組 2.模型組3.多肽治療組4.無(wú)關(guān)肽對(duì)照組 5.抗體治療組 6. 5-氨基水楊酸治療組圖35.各種治療對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)的影響(40X)， 圖中A.正常對(duì)照組； B.模型組；C.無(wú)關(guān)肽對(duì)照組D.多肽治療組； D.抗體治療組 E. 5-氨基水楊酸治療組三、圖36.借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達(dá)載體中，構(gòu)建TNFRlI封閉肽-IgFc重組體的技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施例方式
一、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白實(shí)施例1 TNFRl封閉肽的篩選及其特異性鑒定借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫(kù)中篩選到可與 TNFRl結(jié)合的含12個(gè)氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)，其具體篩選過(guò)程同下述實(shí)施例7之 7. 1。實(shí)施例2 TNF受體封閉肽(12線肽)對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響以下TNFRl封閉肽(12線肽)粉劑均由由第三軍醫(yī)大學(xué)合成。2. ITNF受體封閉肽對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腹腔ΜΦ呼吸爆發(fā)的影響采用NBT 法檢測(cè)常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細(xì)，向3X105/ml大鼠腹腔巨噬細(xì)胞加入TNF-a (5ng/ ml) 100 μ 1禾口 /或TNFRl封閉肽(10 μ g/ml) 100 μ 1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；然后加入100 μ 1/孔 NBT(2mg/ml)，放37°C C02培養(yǎng)箱中45分鐘；再加入70%甲醇溶液100 μ 1/孔，固定5min ； 棄上清，用70%甲醇溶液洗3次；空氣干燥，最后加入120μ/孔2Μ的KOH溶液和140 μ 1/ 孔的DMS0，立即混勻，在波長(zhǎng)630nm下測(cè)其OD值。結(jié)果如圖1 外源性TNF2 α可明顯增強(qiáng) ΜΦ的呼吸爆發(fā)，約為對(duì)照組的3倍(P <0.05)，而TNF受體封閉肽則能完全阻斷TNF-a誘導(dǎo)的ΜΦ呼吸爆發(fā)，其值幾乎接近于其基礎(chǔ)值，提示該肽可競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α誘導(dǎo)的ΜΦ 呼吸爆發(fā)。2. 2TNFR1封閉肽對(duì)大鼠腹腔ΜΦ IL-I β、TNF- α mRNA的影響采用RT-PCR檢測(cè)IL-I β mRNA和TNF-α mRNA 常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細(xì)，用TRIzolRNA分離試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照Boerhinger Marmheim公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取 2μ 1上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，分別用IL-I β特異性引物(P1-GATAACCTGCTGGTGTGTGA ； P2-CTTGTGAGGTGCTGATGTAC)、TNF-α 特異性引物(P1-GCGGATCATGGTCAGATCATCTTCTCGAA ； P2-CCCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAGTA)、β-actin 特異性引(P1-AACGGCTCCGGCATGTGCAA ； P2-CTTCTGACCCATGCCCACCA)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，IL-1 的 PCR 循環(huán)為94 "C 30s, 62 "C lmin, 72°C lmin，26 個(gè)循環(huán)，74°C IOmin ；TNF-α 的 PCR 循環(huán)如下-MV 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 28個(gè)循環(huán)，74°C lOmin。取5μ 1 PCR產(chǎn)物加入Ιμ 6 X上樣緩沖液混合，在80伏恒壓下進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，在短波紫外燈下觀察結(jié)果并照相。結(jié)果如圖2所示對(duì)照組M Φ未見(jiàn)IL-I β PCR產(chǎn)物出現(xiàn)(泳道4)，TNF- α刺激3h后的M Φ可見(jiàn)明顯的IL-1 β cDNA 特異性條帶(泳道2)，而TNF受體封閉肽則可顯著抑制TNF- α誘導(dǎo)的IL-I β mRNA的表達(dá) (泳道3)，因?yàn)槠銹CR產(chǎn)物條帶明顯減弱，通過(guò)密度掃描進(jìn)行相對(duì)定量，證實(shí)TNFRl封閉肽的抑制率達(dá)50%以上，提示TNFRl封閉肽可有效抑制活化的M Φ表達(dá)IL-I β mRNA。同時(shí)， 結(jié)果還顯示(如圖3)，未受刺激的M Φ不表達(dá)TNF- α mRNA (泳道4)，TNF- α可誘導(dǎo)M Φ強(qiáng)表達(dá)TNF- α mRNA,因?yàn)閳D中可見(jiàn)一條強(qiáng)的特異性PCR產(chǎn)物條帶(泳道2)，而用TNFRl封閉肽則可使TNF-α的PCR產(chǎn)物條帶明顯減弱(泳道3)，其抑制率約為50%，提示TNFRl封閉肽可部分阻斷TNF-α的正反饋?zhàn)饔谩?. 3TNFR1封閉肽對(duì)TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔MONF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位的影響NF- κ Βρ65 核轉(zhuǎn)位的檢測(cè)取用TNFa (5ng/ml)和/或TNFRl封閉肽(10 μ g/ml)刺激Ih后的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(1 X 107)，用冷PBS洗滌，12000r/min, lmin離心，收集細(xì)胞；加入400 μ 1細(xì)胞膜裂解液重懸細(xì)胞；冰上腫脹IOmin加入0.5% ΝΡ240至終濃度為0. 1% 0. 125%;振蕩10s， 12000r/min, lmin離心；加入10 μ 1核膜裂解液重懸沉淀物；冰上放置30min，12000r/min, lmin離心，收集上清，按常規(guī)方法做Western blot。免疫染色的抗體為兔抗人IgGNF-κ B Ρ65多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。結(jié)果如圖4所示。未加任何刺激的對(duì)照組無(wú)條帶出現(xiàn)，提示在正常情況下腹腔巨噬細(xì)胞核內(nèi)無(wú) NF- κ Βρ65存在(泳道1)，單獨(dú)給予TNF- α刺激Ih后，大量NF- κ Βρ65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，因?yàn)槌霈F(xiàn)明顯的NF-k B特異性條帶(泳道3)；用TNFRl封閉肽后，則使TNF-α誘導(dǎo)的NF-κΒ 條帶明顯減弱(泳道2)，提示TNFRl封閉肽能部分抑制TNF- α誘導(dǎo)的NF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位。實(shí)施例3 TNFRl封閉肽對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響3. 1大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的建立Wistar大鼠， $，體重150 200g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。弗氏完全佐劑。實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組注射生理鹽水0.1ml/ 只；模型組在大鼠右足墊部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(F5881，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)0. Iml/ 只；治療1組注射佐劑后，立即注射TNFRl封閉肽0. Iml/只，劑量分別為0. 5和1. Omg/kg 體重，qd，每個(gè)劑量4只，連續(xù)治療10d，治療2組方法與劑量同治療組1，連續(xù)治療20d后用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)并取關(guān)節(jié)組織按常規(guī)做組織切片，HE染色。注射佐劑后，大鼠煩躁不安，右腳不敢著地行走，18h后出現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，走路緩慢，進(jìn)食減少等臨床表現(xiàn)；d3右后肢踝關(guān)節(jié)腫脹減輕，但d8紅腫再度加重(表1)；在接種10 18d后，形成多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為未注射佐劑一側(cè)(左后肢)的踝關(guān)節(jié)輕度紅腫(結(jié)果未顯示)，與人類RA的發(fā)病過(guò)程極為相似。而注射TNF受體封閉肽后數(shù)天，大鼠情緒穩(wěn)定，行走基本自如，踝關(guān)節(jié)腫脹有所減輕等。病理切片顯示，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量的炎性細(xì)胞、漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，血管翳形成并伸向關(guān)節(jié)表面，關(guān)節(jié)腔腔隙縮小，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞(如圖5)。說(shuō)明大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型建立成功。3. 2TNF受體封閉肽對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹的影響用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)。結(jié)果(表1)顯示大鼠踝關(guān)節(jié)注射佐劑后18h明顯腫脹，但d3則有所減輕，dlO腫脹再度明顯，此后腫脹程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重；用TNF受體封閉肽(lmg/kg體重) 后，前3d無(wú)明顯療效，但I(xiàn)Od后，治療組踝關(guān)節(jié)腫脹基本消退，與未注射佐劑對(duì)照組相似。所用兩種藥物劑量組之間的療效無(wú)顯著性差異。3. 3TNF受體封閉肽對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎病理變化的影響按常規(guī)做組織切片，HE染色。 結(jié)果顯示經(jīng)每日l(shuí)mg/kg體重的TNF受體封閉肽持續(xù)治療20d后，與未用藥的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠相比，其踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞層增生程度減小，滑膜組織充血、水腫好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少以及關(guān)節(jié)軟骨破壞程度減輕等。但與正常大鼠的踝關(guān)節(jié)切片相比，治療組尚未完全恢復(fù)正常(如圖5)。表1. TNFRl封閉肽對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響
權(quán)利要求
1.一種 TNF 結(jié)合肽(環(huán) 9 肽)，其氨基酸序列為 Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-Iys-His-CyS。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡(jiǎn)并的核酸序列。
3.一種 TNFRl 封閉肽(環(huán) 9 肽)，其氨基酸序列為 Cys-Iys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys。
4.一種編碼權(quán)利要求3所述的TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡(jiǎn)并的核酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的TNF結(jié)合肽或/和權(quán)利要求3所述的TNFRl封閉肽在制備用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一條TNF結(jié)合環(huán)肽和一條TNFR1封閉環(huán)肽，其氨基酸序列分別為Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys；Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys，其在體內(nèi)外均能競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合，從而拮抗TNF-α的生物學(xué)功能，并在TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中取得較好的療效。
文檔編號(hào)A61P1/04GK102321155SQ201110218429
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者何亞萍, 尹丙姣, 李卓婭, 梁慧芳, 王晶, 黃麗霞 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)