專利名稱：一種促肝細胞生長素，其制劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，還涉及其制劑和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促肝細胞生長素是從新鮮乳豬肝臟中提取的小分子量多肽類混合物，分子量在 10，000左右。其藥理作用主要為可刺激正常肝細胞DNA的合成，促進肝細胞再生，對損傷的肝細胞有保護作用，促進肝功能的恢復(fù)，還有調(diào)節(jié)機體的免疫功能和抗肝纖維化作用。臨床上用于治療重型肝炎、慢性活動性肝炎和肝硬化等。目前，針對促肝細胞生長素這一生物制劑類藥物，已經(jīng)有很多專利和文獻報道。在專利ZL03116052. 2中，公開了一種促肝細胞生長素注射液及制備方法，其中的肝細胞生長素為從乳豬中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，該專利稱該肝細胞生長素中的蛋白質(zhì)有15種氨基酸組成，占總蛋白含量的60%以上，分子量為2. 1萬道爾頓。專利ZL200610047371. 0公開了一種促肝細胞生長素水針劑制劑的制備方法，其中公開了一種促肝細胞生長素溶液的制備方法，包括以下步驟1)選材；幻組織處理；3) 勻漿低溫勻漿2分鐘；4)凍融反復(fù)凍融3次；5)熱變性去除大分子蛋白升溫至85°C，恒溫5分鐘；6)離心；7)分級超濾及病毒滅活一級超濾收集分子量30，OOODa以下的組分； 二級超濾收集分子量為10，OOODa以下的多肽組分，60°C保溫10小時，滅活病毒。但上述專利中并未對肝細胞生長素的成分進行進一步深入的研究和分析，發(fā)明人在專利ZL93120999. 4中已經(jīng)公開了一種促肝細胞生長素的組成成分，但經(jīng)過發(fā)明人的深入研究，得到了一種新的、含量更高、活性更強的促肝細胞生長素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供了一種促肝細胞生長素；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供了這種促肝細胞生長素的制劑；本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供了這種促肝細胞生長素的用途。為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為一種促肝細胞生長素，所述的促肝細胞生長素溶液采用高效液相色譜法分析，在分析條件為流動相甲醇水的體積比為10 90，色譜柱hypersil ODS 4. 6X300mm(5um)，波長256nm，流速0. 8ml/min，具有12個色譜組分峰，其保留時間和峰面
積為峰號保留時間min峰面積％12.131、-2.17241.47- 44.9922.436、-2.6230.917- 2.6532.582、-2.8231.02 '2.5643.099、-3.3531.02 '5.8253.349、-3.8514.10 9.9663.845、-4.1094.77 '10.5174.066、-4.2583.13-'3.6784.206、-5.3313.04 '13.0895.252、-5.8595.68 '12.79105.789、-6.1771.089- 9.68116.123、-10.8030.79 '3.291212.108-12.4775.10-'6.27。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為，優(yōu)選的保留時間和峰面積為
峰號保留時間min峰面積％12.131 々.17241.4796 44.988822.436 々.6230.9179--2.647732.582 々.8231.0205--2.554343.099 ,3.3531.0205--5.816453.349 3.8514.1021--9.954063.845-4.1094.7702--10.503974.066 ,4.2583.1365--3.668984.206 ,5.3313.0414--13.071195.252 5.8595.6871--12.7867105.789 ,6.1771.089 9.6784116.123--10.8030.7959-一 3.28171212.108 12.4775.1068-一6.2657。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685道爾頓， 重均分子量為11350道爾頓。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為=Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%,Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, Ile 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%,His 0. 7%,Try 2. 5%,Lys 1. 5%,Arg 9. 1 %，總量占 28. 8%。其中，氨基酸的檢測方法采用高效液相色譜檢測。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細胞生長素的微量元素包括狗7.3 7. 6ug/ml，SeO. 04 0. 05ug/ml，Mgl40. 5 140. 7ug/ml，Zn 14. 2 14. 4ug/ml，Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0. 3 0. 5ug/ml，Mn 0. 6 0. 7ug/ml, Co 200. 1 200. 3ug/ml。本發(fā)明中微量元素的檢測方法通過原子吸收光譜檢測。本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細胞生長素的濃度為15. 0 22. 5mg/ml，優(yōu)選15. 0 21. 7mg/ml，測定方法為福林酚法。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的 71 % 75%。其中，活性蛋白的測量方法為促肝細胞生長素通過凝膠色譜等方法分離，經(jīng) 7721細胞摻入培養(yǎng)，通過MTT法測定活性組份，并計算活性組份重量的占總質(zhì)量的比例。本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為，所述的促肝細胞生長素在體外促7721細胞的增殖試驗中，用MTT法測定的增殖倍數(shù)為4. 5 6. 0。本發(fā)明還涉及一種所述的促肝細胞生長素的制劑，所述的制劑包括凍干粉針。本發(fā)明還對提取得到的促肝細胞生長素進一步制備成了制劑，其中包括粉針劑；凍干粉針劑的配方為促肝細胞生長素10重量份，賦形劑甘露醇1 100重量份； 其中優(yōu)選促肝細胞生長素10重量份，賦形劑10 100重量份，更優(yōu)選促肝細胞生長素10 重量份，賦形劑40 100重量份。其中，賦形劑選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、右旋糖酐、木糖醇等，所述的凍干粉針中還可以包括穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑等，輔料的選擇可依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)選擇進行，也可以通過處方篩選實驗獲得。本發(fā)明的凍干粉針可采用已知的方法制備。本發(fā)明制備的凍干針劑，通過動物體內(nèi)實驗、體外實驗的檢測，其活性與所提取的促肝細胞生長素的活性相同。本發(fā)明還涉及所述的促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的解釋和說明本發(fā)明中促肝細胞生長素的制備方法的工藝步驟為(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，勻漿液冷凍至-20°C -35°C ；(4)將_20°C _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的 1/3 1/2，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C以下保存。
具體的要求及技術(shù)優(yōu)勢為(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個的完整乳豬肝不得超過140 克，實驗證實，乳豬的肝臟的促肝細胞生長素的活性組份含量更高，大大高于成年豬的含量；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，比例優(yōu)選為水豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液冷凍至-20 -35°c ；勻漿液以10 18°C / min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至_20 _35°C，優(yōu)選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -35°C/min。本發(fā)明此處采用了分步快速速凍的方式，發(fā)明人通過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)， 通過分步冷凍的勻漿液，促肝細胞生長素的得率會有所提高。這可能是由于通過對冷凍速度的控制，使勻漿液冷凍產(chǎn)生顆粒大小適宜的冰晶，從而在細胞內(nèi)更加徹底的破壞細胞膜， 釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)，使得提取液中有效成分含量大大增加?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用速凍的方式冷凍的，都是采用同一速度降溫的，但如果降溫速度一直保持很快，就會產(chǎn)生比較大的冰晶， 也對細胞膜的破壞不完全，從而使細胞內(nèi)的物質(zhì)的釋放不完全，造成提取率低下。而且如果速凍速度過快，對設(shè)備和工藝的要求很高，一般設(shè)備難以達到。(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，濾布或濾網(wǎng)的孔徑0. 1mm，濾布或濾網(wǎng)的面積為2 3平方米，速度200ml/min，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；本發(fā)明采用了達到83°C 85°C 后立刻撤掉加熱源，從而進一步保證了產(chǎn)品的活性。解凍和加熱的速度為1 10°C /min, 并優(yōu)選階段式升溫的方式，優(yōu)選以1 2V /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min 的速度加熱至83°C 85°C。階段式升溫的好處為先以較慢的速度升溫至零度左右，對于冷凍體，升溫速度過快，會造成冷凍體內(nèi)部和外部的溫差增大，緩慢升溫可以使冷凍體均勻緩慢的解凍。因為在操作過程中一般采用蒸汽加熱，避免了在蒸汽加熱過程中，外層解凍融化溫度增高，內(nèi)層還未融化，外層的溶液在高溫作用下活性降低的可能。當冷凍體溶解，本發(fā)明采用了較快速升溫的過程，這是因為，如果解凍后還采用較慢的速度，冷凍后的勻漿液中由于細胞分解破裂，釋放出大量的具有活性的蛋白分解酶，此類活性酶物質(zhì)在一個較長時間內(nèi)處于一種適于其酶解其他物質(zhì)的環(huán)境中，從而會引起其促肝細胞生長素活性物質(zhì)的降解。(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；此處的冷凍也采用了分步冷凍，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以2 6°C /min 的速度冷凍至-20 _30°C，優(yōu)選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以 3 5°C /min的速度冷凍至_20 _30°C /min ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg， 截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下
7保存。在現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用反復(fù)凍融的方式，對促肝細胞生長素進行提取，然而，反復(fù)凍融易產(chǎn)生降壓物質(zhì)，在對用藥的安全產(chǎn)生隱患。而采用化學(xué)提取、酶提取法，由于在提取過程中，PH變化過大或者酶的作用，最終提取得到的促肝細胞生長素的活性偏低，基本無臨床效果。本發(fā)明采用了兩次凍融、低溫長時間冷凍的方式，最終制備得到了一種活性多肽含量高、產(chǎn)品得率高的促肝細胞生長素，經(jīng)動物實驗和臨床試驗，得到了良好的治療效果。本發(fā)明采用的工藝流程為勻漿液分步冷凍、凍存至少7天-溶解、加熱至83 85°C、調(diào)pH值-分子量20，000中空纖維柱過濾、分子量10，000超濾膜過濾-分步冷凍、凍存至少7天-溶解、濃縮-分子量20，000中空纖維柱過濾-0. 22 μ m除菌過率；1.本發(fā)明的工藝流程中，先將勻漿液分步冷凍，并凍存至少7天后溶解加熱后，濾布易于過濾。凍存7天可使細胞充分破裂，從而使蛋白、多肽等物質(zhì)釋放，從而可使一次冷凍達到反復(fù)凍融的目的，避免了降壓物質(zhì)的產(chǎn)生。2.本發(fā)明熱變性步驟中，僅加熱至83 85°C并立即撤掉熱源，本發(fā)明通過反復(fù)試驗確定，采用這種方式即可以使大分子蛋白變性，而加熱至更高的溫度或者在85°C這一度下保溫，都會對降低本發(fā)明活性物質(zhì)的活性。3.本發(fā)明對勻漿液采用的是自然過濾的方式，避免了離心等操作對本發(fā)明活性物質(zhì)的活性的影響，節(jié)約能源。4.本發(fā)明采用了在對溶液進行過濾前就調(diào)節(jié)PH的做法。5.本發(fā)明采用了對溶液先采用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，再采用截留分子量10000的超濾膜過濾，并對中空纖維柱過濾的壓力和超濾膜的壓力進行了控制，可防止極少量的高分子物質(zhì)通過濾膜，也可防止膜的損壞。6.本發(fā)明對超濾液再進行一次冷凍、解凍、過濾，從而進一步去除最終產(chǎn)品中的高分子物質(zhì)，再經(jīng)除菌得到一種安全的產(chǎn)品。


圖1為實施例1制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖2為實施例2制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖3為實施例3制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖4為實施例4制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖5為實施例5制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖6為實施例6制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖7為實施例7制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖。本發(fā)明的具體實施方式
僅限于進一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實施例方式實施例1促肝細胞生長素的提取(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5min，比例為水豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以16°c /min內(nèi)從室溫冷凍至0°C，再以4°C /min的速度冷凍至-35 °C ；(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5，解凍和加熱的速度為1 2 0C /min ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C。其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖1所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 6ug/ml，Se 0. 04ug/ml，Mg 140. 5ug/ml，Zn 14. 2ug/ml, Na 33. 5ug/ml, Ca 0. 3ug/ml, Mn 0. 6ug/ml, Co 200.lug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 3mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例2(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，比例為水豬肝質(zhì)量比為1. 15 1;勻漿液以15°C/min的速度從室溫冷凍至-5°C，再以5°C/ min的速度冷凍至-35 °C。(4)將_35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；解凍和加熱的速度以2°C /min 的速度升溫至0°C，再以8°C /min的速度加熱至85°C ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以3°C / min的速度冷凍至_30°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為TC /min升溫至室溫；過濾， 上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖2所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 3ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 6ug/ml，Zn 14. 4ug/ml, Na 33. 7ug/ml, Ca 0. 5ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.2ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 5 ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例3(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以18°c /min的速度從室溫冷凍至_2°C，再以8°C /min的速度冷凍至；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以10°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖3所示；經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 8mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的72%。實施例4(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖4所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 2mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的73%。實施例5(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；
(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以6°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°c凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖5所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占重量的72%。實施例6(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 2 1 ；勻漿液以18°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至-32°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至84°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為3°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖6所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 7mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例7(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 15 1 ；勻漿液以17°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以7°C /min 的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖7所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為 Fe 7. 5ug/ml, Se 0. 05ug/ml, Mg 140. 7ug/ml, Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；
促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例8配方為實施例1提取得到的促肝細胞生長素10重量份，甘露醇90重量份，采用常規(guī)方法配液、除菌、灌裝，凍干。比較例1 不同的制備工藝處理對生物活性的影響工藝1 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)加熱至85°C并保持15分鐘；工藝2 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以2V /min的速度加熱至83°C 85°C ；工藝3 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以6°C /min的速度加熱至83°C 85°C ；檢測方法同實驗例3，實驗結(jié)果如表1所示表1:
實施例 130.3735.8
工藝 130.1393.5
工藝 230.1383.4
工藝 330.1383.4比較例2 不同的制備工藝處理對產(chǎn)率的影響工藝1 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以30°C /min的速度從室溫冷凍至-35 °C ；工藝2 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以10°C /min的速度從室溫冷凍至-35 °C ；工藝4 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以15°C /min的速度從室溫冷凍至-25 °C ；工藝5 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以5°C /min的速度從室溫冷凍至-25 °C /min ；工藝6 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存48小時；工藝7 其他工藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存72小時；實驗結(jié)果見表2:表2:單位產(chǎn)量(mg/g)實施例16.58工藝15.45工藝25.34工藝35.18工藝44.54工藝54.38工藝65.35工藝75.26實驗例1體內(nèi)實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗實驗例1體內(nèi)實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性Wistar大鼠，1；35 190g，在戊巴比妥鈉(％ig/100g體重)麻醉下進行32% 的肝部分切除，術(shù)后4 6小時經(jīng)腹腔注射生理鹽水細1、本發(fā)明實施例1 7制備的促肝細胞生長素20mg，于30小時固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin’ s液固定，包埋切片，6u H. Ε.染色，有絲分裂計數(shù)，如表3所示表3:
動物數(shù)有絲分裂百分率倍數(shù)P值對照組80.9440.166促肝細胞生長素實施例153.1150.5233.3<0.001促肝細胞生長素實施例253.4040.4943.7<0.001促肝細胞生長素實施例353.2570.4273.6<0.001促肝細胞生長素實施例453.3640.4993.6<0.001促肝細胞生長素實施例553.3710.5233.5<0.001促肝細胞生長素實施例653.4120.4873.7<0.001促肝細胞生長素實施例 53.4070.5043.6<0.001實驗例2體外實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性豚鼠200 300G，經(jīng)心臟采血致死，無菌取出心臟，沖洗后剪碎與100目尼龍網(wǎng)上輕研，過濾，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液制備肝細胞懸液，細胞計數(shù)為5 7 X IO5個 /ml,0. 2%臺盤藍染色活率為81%。當成活率高于70%時進行M孔板培養(yǎng)，每孔加Iml含血清1640培養(yǎng)液，37°C,5% CO2,培育4小時，吸取各孔上清液，正常對照組不加促肝細胞生長素，實驗組每孔加含有40 μ g促肝細胞生長素的無血清1640培養(yǎng)液，24小時每孔加2uci 的3H-dTR, 7°C,5%C02,培育2. 5小時，分別收集各孔的細胞，用0. OlMPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37°C干燥過夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計數(shù)器測各樣品的CPM值。表4本發(fā)明促肝細胞生長素對體外肝細胞DNA3H-ClTR參入量的影響
孔數(shù)CPM值倍數(shù)P值對照組36565. 3空白組31579.2促肝細胞生長素實施例1327423. 65.5<0.001促肝細胞生長素實施例2329417. 45.9<0.001促肝細胞生長素實施例3330414. 66.1<0.001促肝細胞生長素實施例4326924. 45.4<0.001促肝細胞生長素實施例5328420.25.7<0.001促肝細胞生長素實施例6327423. 05.5<0.001促肝細胞生長素實施例 3299166.0<0.001實驗例3體外實驗MTT法1.取實施例1 7制備的促肝細胞生長素，用RPMI-1640培養(yǎng)液制成每Iml中含多肽IOOyg的溶液。2.用10%的小牛血培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721細胞至對數(shù)增長期，用0. 25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二鈉消化液消化，加10%小牛血清培養(yǎng)液稀釋至每Iml中含2. 5X IO4 5 X IO4個細胞，將上述細胞懸液在96孔細胞板上鋪板，每孔100 μ 1，其中3孔加10%小牛血清培養(yǎng)液100 μ 1作為空白對照，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4小時使其貼壁。供試品組，每孔加供試品溶液100 μ 1，每批供試品均做3個孔，細胞對照組和空白對照組每孔分別加RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ 1，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，結(jié)束培養(yǎng)前4小時取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7. 3)洗一次，然后再每孔中加入上述磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 3)100μ 1和MTT溶液20μ 1，
繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，其吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 二甲基亞砜，搖勻，在酶標儀上以 550nm的波長處分別測定其吸收度A值；并計算刺激指數(shù)；其中刺激指數(shù)為(供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)與(對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)的比值。
刺激指數(shù)=供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值
表5
孔數(shù)吸光度對照組30.114空白組30.060促肝細胞生長素實施例130.373促肝細胞生長素實施例230.352促肝細胞生長素實施例330.357促肝細胞生長素實施例430.362促肝細胞生長素實施例530.368促肝細胞生長素實施例630.373促肝細胞生長素實施例 30.368
刺激指數(shù)
5.8
5. 4 5. 5 5. 6 5. 7 5. 8 56. 5
1權(quán)利要求
1. 一種促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素溶液采用高效液相色譜法分析，在分析條件為流動相甲醇水的體積比為10 90，色譜柱hypersil ODS 4. 6X300mm(5um)，波長256nm，流速0. 8ml/min，具有12個色譜組分峰，其保留時間和峰面積為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，其保留時間和峰面積為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685道爾頓，重均分子量為11350道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1.5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leu 1. 8%, Tyr 0. 4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素的微量元素包括:Fe 7. 3 ~ 7. 6ug/ml, Se 0. 04 0. 05ug/ml, Mgl40. 5 140. 7ug/ml, Zn 14. 2 14. 4ug/ml, Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0· 3 0. 5ug/ml, Mn 0· 6 0. 7ug/ml, Co 200.1 200. 3ug/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素的濃度為 15. 0 22. 5mg/ml，優(yōu)選 15. 0 21. 7mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素中活性蛋白質(zhì)的含量為71% 75%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素在體外促7721細胞的增殖試驗中，用MTT法測定的增殖倍數(shù)為4. 5 6. 0。
9.一種含有權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素的制劑，其特征在于，所述的制劑包括凍干粉針。
10.權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，采用高效液相色譜法分析，具有12個色譜組分峰，所述的促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685道爾頓，重均分子量為11350道爾頓數(shù)，并含有18種氨基酸和10種微量元素。本發(fā)明的促肝細胞生長素的濃度為15.0～22.5mg/ml，其中活性蛋白質(zhì)的含量為71％～75％。所述的促肝細胞生長素在體外促7721細胞的增殖試驗中，用MTT法測定的增殖倍數(shù)為4.5～6.0。本發(fā)明還涉及該促肝細胞生長素的制劑及應(yīng)用。本發(fā)明的促肝細胞生長素活性高，有效物質(zhì)的含量高，使用安全。
文檔編號A61K38/00GK102294013SQ20111026473
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者孔祥平, 張宜俊, 張海松, 楊富強, 陳光明, 陳陽述 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院