專利名稱：具有adcc和cdc功能及改善的糖基化特征的抗-cd19抗體的制作方法
具有ADCC和CDC功能及改善的糖基化特征的抗-CD19抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗-CD19抗體，其具有賦予一種或幾中有用的效應(yīng)子功能的相對(duì)于野生型Fe區(qū)具有一些特定氨基酸修飾的變體Fe區(qū)。本發(fā)明尤其涉及包含該變體Fe區(qū)的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗體。其有利地涉及具有感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的抗體。本發(fā)明也涉及這些抗體在疾病或病癥，諸如癌，尤其B細(xì)胞惡性腫瘤，及自-免疫疾病的治療，防止或管理中的用途。
背景技術(shù)：
在自身免疫和/或炎性病癥中，免疫系統(tǒng)在無(wú)要抵御的外源物質(zhì)時(shí)引發(fā)炎性應(yīng)答，及身體的正常保護(hù) 性免疫系統(tǒng)通過(guò)錯(cuò)誤地攻擊本身來(lái)導(dǎo)致對(duì)其自身組織的損傷。有以不同方式影響身體的許多不同自身免疫病癥。例如，在患多發(fā)性硬化的個(gè)體中影響腦，在患克羅恩病的個(gè)體中影響腸，及在患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中影響各種關(guān)節(jié)的滑膜，骨和軟骨。B細(xì)胞惡性腫瘤構(gòu)成癌的重要組，其包括B細(xì)胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)和毛細(xì)胞白血病和B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)。目前,癌治療可涉及手術(shù),化學(xué)治療,激素治療和/或放射治療，以根除患者中的腫瘤形成細(xì)胞。最近，癌治療也可涉及生物學(xué)治療或免疫治療。有對(duì)于替代性的癌治療，特別對(duì)于已證明了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)癌治療，諸如手術(shù)，放射治療，化學(xué)治療和激素治療難治性的癌治療的顯著需求。有希望的替代性的是免疫治療，其中癌細(xì)胞特別由癌抗原-特異性抗體靶向。主要努力已指向利用免疫應(yīng)答的特異性，例如,雜交瘤技術(shù)致使腫瘤選擇性單克隆抗體的開發(fā)，且在過(guò)去幾年，食品和藥物管理局批準(zhǔn)了用于癌治療的第IMAb:用于非-霍奇金氏淋巴瘤的RiUlxan (抗-⑶20)和用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的赫賽汀[抗-(c-erb-2/HER-2)]。Rituxan (俗名是利妥昔單抗)是針對(duì)在外周血和淋巴樣組織中的大多數(shù)B細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的人CD20，35kDa，4跨膜-跨蛋白的嵌合小鼠-人單克隆抗體?？贵w治療(Rituxan ,，美國(guó)專利5，736，137)被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)
批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)的或難治性低度或?yàn)V泡，CD20-陽(yáng)性B細(xì)胞非-霍奇金氏淋巴瘤。此外，采用放射性標(biāo)記的抗-⑶20抗體的淋巴瘤治療已描述于美國(guó)專利5，595，721，5，843，398，6，015，542 和 6，090，365。
toon] 在腫瘤學(xué)中，Rituxan /MabTliera 也在us被作為單劑用于治療復(fù)發(fā)的
或難治性，低度或?yàn)V泡，⑶20-陽(yáng)性，B細(xì)胞NHL，用于治療NHL，用于之前未治療的濾泡，CD20-陽(yáng)性，B細(xì)胞NHL組合環(huán)磷酰胺，長(zhǎng)春新堿，潑尼松龍(CVP)化學(xué)治療，作為單劑用于治療非-進(jìn)展(包括穩(wěn)定的疾病)，低度，⑶20陽(yáng)性，B細(xì)胞NHL，在第1-線CVP化學(xué)治療之后，及用于之前未治療的擴(kuò)散大B細(xì)胞，⑶20-陽(yáng)性，NHL組合標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療(CHOP)或其他基于蒽環(huán)類抗生素的化學(xué)治療方案。在腫瘤學(xué)中，Rituxan >/MabThera .在EU被用于患之前未治療的或復(fù)發(fā)
的/難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的患者的治療組合化學(xué)治療，用于之前未治療的患階段II1-1V濾泡淋巴瘤的患者的治療組合化學(xué)治療，作為對(duì)于應(yīng)答誘導(dǎo)利用用或不用Rituxan /MabThera 的化學(xué)治療的治療的患復(fù)發(fā)的/難治性濾泡淋巴瘤的患者的維持治療，用于患⑶20-陽(yáng)性擴(kuò)散大B細(xì)胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的患者的治療組合CHOP (環(huán)磷酰胺，多柔比星，長(zhǎng)春新堿，潑尼松龍)化學(xué)治療，及作為用于是化療抗性或在它們的在化學(xué)治療之后的二次或隨后復(fù)發(fā)的患階段II1-1V濾泡淋巴瘤的患者的治療的單一治療。此外，在風(fēng)濕病學(xué)中，指示Rituxan /IV1abThera 組合甲氨喋呤用于已具
有對(duì)其他疾病-修飾抗-風(fēng)濕性藥物(DMARD)的不充足的應(yīng)答或不耐性的患嚴(yán)重的有活性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成年患者的治療，包括一種或更多腫瘤壞死因子(TNF)抑制物治療。MabThera已在美國(guó)，日本和加拿大被知為Rituxan。阿侖珠單抗是靶向⑶52的另一抗體，其已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)的慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，但相關(guān)于顯著毒性，因?yàn)樽钫Ｃ庖呒?xì)胞包括T-細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞上靶抗原的普遍存在的表達(dá)。但是，呈現(xiàn)了一些對(duì)利妥昔單抗治療的抗性或復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)可通過(guò)各種機(jī)理呈現(xiàn)，其中一些導(dǎo)致?lián)p失⑶20表達(dá)和對(duì)進(jìn)一步利妥昔單抗治療的抗性。抗性可呈現(xiàn)，其可導(dǎo)致⑶20表達(dá)的損失或調(diào)節(jié)，及特征在于重復(fù) 的利妥昔單抗治療的功效的缺乏，或在一些情況中，由初次利妥昔單抗治療的功效的缺乏。抗性也發(fā)生在組成性缺少CD20表達(dá)的淋巴瘤病例中，包括一些B-細(xì)胞淋巴瘤諸如成血漿細(xì)胞性淋巴瘤。而且，⑶20+患者可不應(yīng)答，或獲取對(duì)Rituxan 治療的抗性。而且，在高B細(xì)胞負(fù)荷的病情下，身體的效應(yīng)子機(jī)理，例如，NK-細(xì)胞-介導(dǎo)的殺傷的耗竭，可導(dǎo)致此MAb的免疫治療功效的實(shí)質(zhì)性減小。而且，具有慢性淋巴細(xì)胞白血病和高水平的循環(huán)B細(xì)胞的患者的利妥昔單抗治療可導(dǎo)致CD20自細(xì)胞移出，由此允許它們持續(xù)及抵抗清除?；诶孜魡慰购桶鲋閱慰沟某晒拖拗?，尤其是用利妥昔單抗治療的抗性和復(fù)發(fā)現(xiàn)象，需要靶向B細(xì)胞上的替代性的抗原的替代性的抗體的鑒定。⑶19是免疫球蛋白(Ig)超家族的95kDa糖蛋白成員。⑶19在來(lái)自它們的早期前-B細(xì)胞階段的濾泡樹突細(xì)胞和全部B細(xì)胞上表達(dá)，直到漿細(xì)胞分化的時(shí)間。CD19表面表達(dá)在B-細(xì)胞發(fā)育期間緊密調(diào)控，更高水平見于更成熟細(xì)胞和⑶5+ (B-1) B細(xì)胞。⑶19通過(guò)B細(xì)胞分化的成血漿細(xì)胞階段而晚于⑶20表達(dá)。因而，⑶19表達(dá)在⑶20差地表達(dá)的許多前-B和未成熟的B-成淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞惡性腫瘤中相對(duì)高。CD19+成血漿細(xì)胞也可在自身免疫疾病的永存中起到作用。⑶19作為與⑶21，⑶81和⑶225的多分子復(fù)合物在B細(xì)胞的表面上表達(dá)。與此復(fù)合物一起，CD19涉及與B細(xì)胞受體的共信號(hào)傳導(dǎo)，及在B-淋巴樣細(xì)胞的分化，活化和增殖的控制中起到作用(Sato等人，1997)。
⑶19存在于不同類型的人B細(xì)胞惡性腫瘤(包括促-及前-B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，兒童和年輕成年的常見的ALL (cALL)，NHL, B-CLL和多毛-細(xì)胞白血病(HCL))的胚細(xì)胞。其未自惡性腫瘤細(xì)胞脫落，及在一些抗體結(jié)合之后內(nèi)化(Press等人，1989)?？乖芏龋诮】低庵蹷細(xì)胞上，為10000 30000個(gè)分子/細(xì)胞，及在來(lái)自各種淋巴樣癌的惡性腫瘤細(xì)胞上，為7000 30000個(gè)分子/細(xì)胞(Olejniczak等人，1983)。相比⑶20，⑶19在B-細(xì)胞發(fā)育中更廣泛地和更早表達(dá)，其由銷售的抗癌MAbRituxan 靶向，且如此可用于更寬范圍的癌包括非-霍奇金氏淋巴瘤和急性成淋巴細(xì)胞白血病以及CLL。⑶19已20年為免疫治療開發(fā)的焦點(diǎn)，但用針對(duì)⑶19的單克隆抗體的初始臨床試驗(yàn)未導(dǎo)致耐久效應(yīng)，盡管在一些患者中作為單劑或組合其他治療劑展示應(yīng)答(Hekman等人，1991; Vlasved 等人,1995)。已在小鼠模型，及在臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)幾種⑶19-特異性抗體用于體外治療B-系惡性腫瘤。這些包括了靶向⑶19和⑶3或⑶16的未修飾的抗-⑶19抗體，抗體-藥物綴合物和雙特異性抗體，以著手細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞效應(yīng)子功能。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指稱自一群基本上均質(zhì)抗體獲得的抗體，即，包含群的個(gè)體抗體是同一的，除非可以少數(shù)量存在的可能的天然存在的突變或替代性的翻譯后修飾，無(wú)論自雜交瘤或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生?？贵w是蛋白，其呈現(xiàn)對(duì)特異性抗原的結(jié)合特異性。天然抗體通常是約150，OOODa的異源四聚體糖蛋白，由2個(gè)同一輕(L)鏈和2個(gè)同一重(H)鏈組成。各輕鏈由一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接到重鏈，而二硫鍵數(shù)在不同 免疫球蛋白同種型的重鏈之間變化。各重和輕鏈也具有規(guī)則鏈內(nèi)二硫鍵橋。各重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)之后是許多恒定區(qū)。各輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(')和在其另一端具有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第I恒定區(qū)對(duì)齊，及輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。術(shù)語(yǔ)‘變體’指稱可變結(jié)構(gòu)域的特定部分在抗體間在序列上廣泛地不同，且負(fù)責(zé)對(duì)其特定抗原的各特定抗體的結(jié)合特異性。但是，變異性通過(guò)抗體的可變結(jié)構(gòu)域未均勻地分布。其在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域二者中被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的3段中濃縮?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含4個(gè)FR區(qū)，大地采用β-折疊片構(gòu)型，由3個(gè)CDR連接，其形成環(huán)連接，及在一些情況中，形成折疊片結(jié)構(gòu)的部分。在各鏈中的CDR由FR區(qū)緊密保持在一起，且自其他鏈的⑶R，貢獻(xiàn)于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(Kabat等人，1991)。恒定區(qū)未直接涉及抗體結(jié)合抗原，但呈現(xiàn)各種效應(yīng)子功能。依賴于它們的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白可分為不同類。有5種主要類的免疫球蛋白:IgA，IgG, IgD, IgE和IgM，及這些中的幾種可還分為亞類(同種型)，例如。IgGl, IgG2，IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α，δ，ε，Y和μ。在各種人免疫球蛋白類中，僅IgGl，IgG2，IgG3和IgM已知活化補(bǔ)體。已顯示貢獻(xiàn)于抗體-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的免疫效應(yīng)子功能包括抗體-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，抗體-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的吞噬(ADCP)，及補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
細(xì)胞毒性也可經(jīng)抗增殖效應(yīng)介導(dǎo)。尚不清楚腫瘤細(xì)胞增殖的抗體調(diào)節(jié)機(jī)理。但是，對(duì)抗體與免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fcg受體(FcgR)的相互作用的理解的發(fā)展允許了具有顯著地改善的效應(yīng)子功能的抗體的加工。MAb的作用機(jī)理是復(fù)雜的，且呈現(xiàn)對(duì)不同MAb而改變。有MAb導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡的多種機(jī)理。這些包括凋亡，⑶C，ADCC和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。研究最多的是ADCC，其由自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)。此涉及抗體的Fab部分與癌細(xì)胞上的特定表位的結(jié)合和抗體的Fe部分與NK細(xì)胞上的Fe受體的隨后結(jié)合。此引發(fā)穿孔素,及導(dǎo)致DNA降解的粒酶的釋放，誘導(dǎo)凋亡及導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在對(duì)MAb的Fe部分的不同受體之中，F(xiàn)cgRIIIa在ADCC中起到主要作用。之前研究顯示，F(xiàn)cgRIIIa基因的多態(tài)性在氨基酸158編碼苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。繳氨酸同種型的表達(dá)與增加的親和性關(guān)聯(lián)及結(jié)合MAb (Rowland等人，1993; Sapra等人，2002;Molhoj等人，2007)。一些臨床研究用對(duì)患非-霍奇金氏淋巴瘤的顯示V/V多態(tài)性的患者中利妥昔單抗的更大臨床應(yīng)答支持了此發(fā)現(xiàn)(Cartron等人，2002，Bruenke etal.2005, Hekmann 等人，1991，Bargou 等人，2008)。W01999051642描述了在第270或329位，或在第270，322，329和331位的2個(gè)或更多包含氨基酸取代的變體人IgG Fe區(qū)。這些修飾旨在增加⑶C和ADCC效應(yīng)子功能。W02002080987描述了治療受試者中的B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，包括施用抗-⑶19免疫毒素，更特別是人源化的或人，單克隆抗體。B細(xì)胞惡性腫瘤可為包含不表達(dá)CD20的B細(xì)胞的惡性腫瘤。W02007024249涉及人IgG Fe區(qū)的修飾，以便賦予由Fe Y R介導(dǎo)的增加效應(yīng)細(xì)胞功能，尤其ADCC。Fe區(qū)在各氨基酸位鉻包含特定修飾。

W02008022152也與靶向⑶19的抗體相關(guān)，其中抗體包含對(duì)Fe受體的修飾及改變抗體介導(dǎo)一種或更多效應(yīng)子功能，包括ADCC，ADCP和⑶C的能力。例證了 ADCC測(cè)定。其他相關(guān)于抗-CD19抗體的專利申請(qǐng)包括W02009052431，W02009054863,W02008031056, W02007076950, W02007082715, W02004106381, W01996036360,W01991013974, US7, 462，352，US20070166306 和 W02005092925。US20090098124也涉及用含有IgG2，3或4的Fe區(qū)，具有一個(gè)或更多氨基酸修飾的變體重鏈加工抗體。建議了 Fe區(qū)之內(nèi)的許多突變和突變組。它們之一是在第243位用亮氨酸，在第292位用脯氨酸，在第300位用亮氨酸，在第305位用異亮氨酸，及在第396位用亮氨酸取代(MgFc88)。另外的突變可導(dǎo)入Fe區(qū)，以提供用于改變的Clq結(jié)合和/或⑶C功能。待修飾的氨基酸位鉻通常選自第270，322，326，327，329，331，333和334位。J.B.Stavenhagen等人(Cancer Res.2007, 67(18):8882-8890)公開了治療性抗體的Fe優(yōu)化。用突變體18獲得最高水平的ADCC(F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)。公開了具有此突變的Fe的抗-⑶20和抗-⑶32B單克隆抗體。盡管⑶19是在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞上表達(dá)的B細(xì)胞特異性抗原，至今⑶19未用治療性單克隆抗體有效靶向。作者描述了乂11^65574，具有設(shè)計(jì)為增強(qiáng)？(3￥1 1113的結(jié)合的修飾的Fe結(jié)構(gòu)域的新加工的抗-CD19單克隆抗體。它們展示，此抗體介導(dǎo)有力的ADCC,中等直接細(xì)胞毒性和ADCP，但無(wú)CDC (Awan等人，2010)。而且，糖蛋白介導(dǎo)人類中的許多必要的功能，包括催化，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞間交往和分子識(shí)別和關(guān)聯(lián)。已開發(fā)許多糖蛋白用于治療性目的。蛋白的寡糖組分可影響與治療性糖蛋白的功效關(guān)聯(lián)的性質(zhì)，包括物理穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶攻擊的抗性，與免疫系統(tǒng)的相互作用，藥代動(dòng)力學(xué)和特定生物學(xué)活性。該性質(zhì)不僅可依賴于寡糖的存在或缺失，而且依賴于寡糖的特定結(jié)構(gòu)。例如，特定寡糖結(jié)構(gòu)介導(dǎo)糖蛋白通過(guò)與特定碳水化合物結(jié)合蛋白相互作用而自血流快速清除，而其他可被抗體結(jié)合及引發(fā)不期望的免疫反應(yīng)(Jenkins等人，1996)。已許可及開發(fā)為醫(yī)療劑的多數(shù)既有的治療性抗體具有人IgGl同種型，其分子量是約150kDa。人IgGl是帶有結(jié)合到抗體恒定區(qū)(Fe)的2N-聯(lián)雙觸角復(fù)合物-型寡糖的糖蛋白，其中大多數(shù)寡糖是核心巖藻糖基化的，及其通過(guò)Fe與白細(xì)胞受體(Fe Y R)或補(bǔ)體的相互作用訓(xùn)練抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的效應(yīng)子功倉(cāng)泛。最近，治療性抗體已顯示改善總體存活以及各種人惡性腫瘤，諸如乳腺，結(jié)腸和血液癌中疾病進(jìn)展的時(shí)間，及癌患者的Fe Y R多態(tài)性的遺傳分析展示了 ADCC是負(fù)責(zé)臨床功效的主要抗-腫瘤機(jī)理。但是，既有許可的治療性抗體的ADCC已發(fā)現(xiàn)被血清強(qiáng)烈抑制，由于非特異性IgG競(jìng)爭(zhēng)治療劑與自然殺傷細(xì)胞上的Fe YRIIIa的結(jié)合，其導(dǎo)致顯著量的藥物需求和與該治療關(guān)聯(lián)的非常聞成本。通過(guò)改善的Fe Y RIIIa結(jié)合的非-巖藻糖基化的形式的治療性抗體的增強(qiáng)的ADCC顯示被巖藻糖基化的對(duì)應(yīng)物抑制。實(shí)際上，在該具有改善的Fe YRIIIa結(jié)合的抗體變體之中，非-巖藻糖基化的治療性抗體，不包括巖藻糖基化的形式，呈現(xiàn)最強(qiáng)和最可飽和的體外和離體ADCC，由于那些帶有天然存在的寡糖異質(zhì)性和人工氨基酸突變，甚至在血漿IgG的存在下。通過(guò)在衣霉素的存在下培養(yǎng)來(lái)抑制人IgGl的糖基化導(dǎo)致，例如，此抗體對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上存在的Fe YRI受體的親和性50倍減小(Leatherbarrow等人，1990)。與Fe Y RIII受體結(jié)合也受IgG上碳水化合物的損失影響，由于已描述非-糖基化的IgG3不能經(jīng)NK細(xì)胞的Fe Y RIII受體誘導(dǎo)ADCC類型的裂解(Lund等人，1995)。但是，除了含有聚糖的殘基的必需存在之外，其更精確地是它們的可導(dǎo)致起始效應(yīng)子功能的能力的差異的結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性。已進(jìn)行研究，以研究寡糖殘基對(duì)抗體生物學(xué)活性的功能。已顯示，IgG的唾液酸對(duì)ADCC無(wú)效應(yīng)(Boyd等人，1995)。幾個(gè)報(bào)道顯示，Gal殘基增強(qiáng)ADCC (Kumpel等人，1994)。兩斷GlcNac,其是轉(zhuǎn)移到核心β -甘露糖(Man)殘基的β，4_GlcNac殘基，已牽涉治療性抗體的生物學(xué)殘基(Lifely等人，1995，Shield等人，2002)揭示了巖藻糖基化的寡糖對(duì)抗體效應(yīng)子功能的效應(yīng)；Fuc-缺陷型IgGl顯示了 50倍增加的結(jié)合Fe Y RIII及增強(qiáng)的ADCC。今天，用于治療性應(yīng)用(即癌，炎性疾病…)的廣范圍的重組蛋白包括糖基化的單克隆抗體。為治療和經(jīng)濟(jì)的原因，在獲得更高特異性抗體活性上有大的興趣。一種獲得大的效力增加，而維持在細(xì)胞系中的簡(jiǎn)單產(chǎn)生過(guò)程和潛在地避免顯著，不期望的副作用的方式在于增強(qiáng)MAb的天然的，細(xì)胞-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。因而，加工IgG的寡糖可產(chǎn)生優(yōu)化的ADCC，其被認(rèn)為是一些治療性抗體的主要功能，盡管抗體具有多種治療功能(例如抗原結(jié)合，凋亡誘導(dǎo)，及⑶C)。一般而言，嵌合及人源化的抗體通過(guò)使用遺傳重組技術(shù)制備及通過(guò)使用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞產(chǎn)生。為了修飾抗體的糖鏈結(jié)構(gòu)，已嘗試各種方法，有針對(duì)與糖鏈修飾相關(guān)的酶的抑制物的應(yīng)用，突變體的選擇，或編碼與糖鏈修飾相關(guān)的酶的基因的導(dǎo)入。GLYCART BIOTECHNOLOGY AG (Zurich, CH)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系中表達(dá)了催化兩斷GlcNac殘基添加到N-聯(lián)寡糖的N-乙酰-葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII),并顯示產(chǎn)生的 IgGl 抗體的更大 ADCC (W099/54342;W003/011878;W02005/044859)。通過(guò)自抗體的Fe部分移出或代替巖藻糖，KYOffA HAKKO KOGYO (Tokyo,日本)增強(qiáng)了 Fe結(jié)合及改善了 ADCC，由此改善了 MAb的功效(US6，946，292)。近來(lái)，More recently, Laboratoire Fdu Fractionnement et des
Biotechnologies (LFB)(法國(guó))顯示，MAb寡糖中的比Fuc/Gal應(yīng)是等同或少于0.6,以獲得具有高ADCC的抗體(FR2861080)。P.M.Cardarelli 等人(Cancer Immunol.1mmunother.2010, 59:257-265)在編碼a I, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FUT8基因缺陷的M-704PF CHO細(xì)胞中產(chǎn)生抗-⑶19抗體。此文章中抗體的非-巖藻糖基化需要酶-缺陷型細(xì)胞系的加工。此文章考慮了氨基酸突變。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述了非糖基化的人嵌合IgG3保留了結(jié)合人Clq及引發(fā)通過(guò)豚鼠C介導(dǎo)的裂解的顯著能力。效應(yīng)子功能諸如⑶C和ADCC是可為對(duì)于MAb的臨床功效重要的效應(yīng)子功能。全部這些效應(yīng)子功能由抗體Fe區(qū)介導(dǎo)，及使作者嘗試氨基酸修飾，或多或少成功。糖基化，尤其是，F(xiàn)e區(qū)的巖藻糖基化對(duì)抗體功效具有顯著影響。此使作者修飾CHO細(xì)胞中的抗體產(chǎn)生條件，以便在此再次嘗試變化糖基化特征，以改善一些效應(yīng)子功能，再次或多或少成功。增強(qiáng)嵌合MAb抗-CD19MAb4G7的ADCC的方法公開于US2007/0166306。通過(guò)使用人哺乳動(dòng)物293T-細(xì) 胞系，在β (1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII)酶的存在下，在對(duì)于抗體產(chǎn)生有效的條件下產(chǎn)生MAb4G7，由含有(I)至少60%N-乙酰葡萄糖胺雙選擇寡糖和(2)僅10%的非巖藻糖基化的N-乙酰葡萄糖胺雙選擇寡糖的Asn297-連接的寡糖表征的Fe片段。H.M.Horton 等人(Cancer Res.2008, 68(19):8049-8057)描述具有 S239D和 I332E突變的Fe-加工的抗-CD19抗體。將此在本文被稱為Fcl4的Fe結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的被稱為chR005-Fc20 (F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L)的 Fe 結(jié)構(gòu)域比較。本發(fā)明的 Fe 結(jié)構(gòu)域在全血效應(yīng)細(xì)胞的存在下顯示ADCC，然而用Fcl4，在相同的條件下，在含有循環(huán)天然的免疫球蛋白的全血的存在下未檢測(cè)到顯著ADCC活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于產(chǎn)生治療性糖蛋白的優(yōu)選的宿主，由于它們以為人應(yīng)用最相容的形式糖基化蛋白的能力(Jenkis等人，1996)。細(xì)菌非常罕見糖基化蛋白，且如同其他類型的常見的宿主，諸如酵母，絲狀真菌，昆蟲和植物細(xì)胞產(chǎn)生與自血流快速清除關(guān)聯(lián)的糖基化模式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞之中，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞已在最近二十年期間最通常使用。除了給出適合的糖基化模式之外，這些細(xì)胞允許遺傳穩(wěn)定的，高產(chǎn)率克隆細(xì)胞系的一致的產(chǎn)生。它們可在簡(jiǎn)單生物反應(yīng)器中使用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)到高密度，及允許安全的和可再現(xiàn)的生物過(guò)程的開發(fā)。其他通常使用的動(dòng)物細(xì)胞包括幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞，NSO-及SP2/0-小鼠骨髓瘤細(xì)胞。也已測(cè)試自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生(Jenkins等人，1996)。由于糖鏈結(jié)構(gòu)在抗體的效應(yīng)子功能中起到顯著地重要作用，且在由宿主細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)中觀察到差異，可用于產(chǎn)生具有更高效應(yīng)子功能的抗體的宿主細(xì)胞的開發(fā)已經(jīng)是目的。為了修飾產(chǎn)生的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)，已嘗試各種方法，諸如(I)針對(duì)與糖鏈修飾相關(guān)的酶的抑制物的應(yīng)用，(2)細(xì)胞突變體的選擇，(3)編碼與糖鏈修飾相關(guān)的酶的基因的導(dǎo)入，等。特定例在以下描述。針對(duì)與糖鏈修飾相關(guān)的酶的抑制物的例包括:衣霉素，其選擇性地抑制GIcNAc-P-P-DoI的形成,這是N-糖苷-連接的糖鏈的前體的核心寡糖的形成的第I步驟；粟精胺和W-甲基-1-脫氧野尻霉素，其是糖苷酶I的抑制物；溴牛菜醇，其是糖苷酶II的抑制物；1_脫氧野尻霉素和1，4-二氧基-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇,其是甘露糖苷酶I的抑制物；苦馬豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物；苦馬豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物等。特異于糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制物的例包括:針對(duì)N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶V (GnTV)的底物的脫氧衍生物等。也知道，1-脫氧野尻霉素抑制復(fù)合物類型糖鏈的合成，和增加高甘露糖類型和混合型糖鏈的比(Glycobiology series2_Destiny of Sugar Chain in Cell,由Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori 和 Akira Kobata, 1993 編輯X主要選擇及獲得關(guān)于與糖鏈修飾相關(guān)的酶的活性的細(xì)胞突變體作為耐凝集素的細(xì)胞系。例如，已使用凝集素獲得具有各種糖鏈結(jié)構(gòu)的CHO細(xì)胞突變體作為耐凝集素的細(xì)胞系，所述凝集素諸如WGA (源于小麥(T.vulgaris)的小麥胚凝集素)，ConA (源于直立刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A), RIC (源于蓖麻(R.communis)的毒素)，L-PHA (源于菜豆(P.vulgaris)的白細(xì)胞凝集素),LCA (源于兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素),PSA(源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)等(Genet et al.1986)。作為通過(guò)將與糖鏈修飾相關(guān)的酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞獲得的產(chǎn)物的糖鏈結(jié)構(gòu)的修飾的一例，已報(bào)道，許多唾液酸加入糖鏈的非-還原端的蛋白可通過(guò)將大鼠β-半乳糖苷酶-a-5，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)入CHO細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。不同類型的糖蛋白-修飾糖基轉(zhuǎn)移酶也可在宿主系統(tǒng)中表達(dá)，諸如GnT III，或，替代性地，b(l，4)-N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶V (GnTV), β (1，4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)和甘露糖苷酶II (Man II)。W020070166306涉及禽胚胎來(lái)源的干細(xì)胞系，命名的EBx㊣，用于產(chǎn)生蛋白和更特別糖蛋白，諸如相比用通常的CHO細(xì)胞欠巖藻糖基化的抗體的用途。Ramesh Jassal等人用FA243突變或通過(guò)使用大鼠a2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細(xì)胞系產(chǎn)生抗NIP IgG3抗體的唾液酸化。FA243IgG3具有由補(bǔ)體的靶細(xì)胞裂解恢復(fù)的a2, 6和a2, 3唾液酸化。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述，非糖基化的人嵌合IgG3保留了結(jié)合人Clq及引發(fā)通過(guò)豚鼠C介導(dǎo)的裂解的顯著能力。本發(fā)明人評(píng)價(jià)了由未用糖基化抑制物修飾的及未處理的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO/DG44細(xì)胞(由ECACC購(gòu)買的)產(chǎn)生的針對(duì)⑶19抗原的人IgGl亞類的各種Fe嵌合變體抗體的糖基化特征。通過(guò)分析及比較產(chǎn)生的chR005-lFc0和優(yōu)化的chR005-lFc20變體抗體的糖鏈的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明提供，無(wú)任何加工的野生型CHO宿主細(xì)胞表達(dá)感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。發(fā)明概述本發(fā)明提供結(jié)合人B細(xì)胞標(biāo)記物的嵌合，人源化的及人抗-⑶19抗體，抗-⑶19抗體融合蛋白，及其片段。優(yōu)化治療性抗體功能性(例如.ADCC, CDC)的當(dāng)前方法聚焦在天然Fe區(qū)的氨基酸修飾或糖基化狀態(tài)的修飾。相反，本發(fā)明基于關(guān)乎氨基酸修飾和糖基化修飾的同時(shí)組合的方法。本發(fā)明涉及蛋白的糖基化加工領(lǐng)域。更特定，本發(fā)明針對(duì)通過(guò)使用野生型哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞系的蛋白的糖基化加工，以通過(guò)用具有改善的治療性性質(zhì)，諸如有效ADCC然而親本分子(鼠或野生型嵌合抗體)不可檢測(cè)地呈現(xiàn)此功能的氨基酸突變來(lái)提供變體蛋白。本發(fā)明的分子仍保留了由親本鼠抗體賦予的凋亡性效應(yīng)子功能。更具體而言，本創(chuàng)新涉及用來(lái)自IgGl同種型的Fe區(qū)修飾免疫球蛋白中的抗體官能性，以具有引發(fā)CDC效應(yīng)子功能的能力。更特別是，本發(fā)明的分子呈現(xiàn)ADCC的互補(bǔ)活化和有效誘導(dǎo)二者。本發(fā)明的分子對(duì)于B細(xì)胞病癥，諸如但不限于，B細(xì)胞惡性腫瘤的治療，對(duì)于自身免疫疾病的治療和預(yù)防，及對(duì)于人移植受者中的移植物-抗宿主疾病(GVHD)，體液拒絕和移植后淋巴組織增生性病癥的治療和預(yù)防，對(duì)于用出治療性抗體諸如但不限作為抗-CD20抗體治療的或?qū)τ谟贸鲋委熜钥贵w諸如但不限作為抗-CD20抗體的聯(lián)合治療難治性的患者特別有用。本工作旨在產(chǎn)生克服這些缺點(diǎn)的具有修飾的Fe區(qū)的抗-⑶19抗體。發(fā)明人展示，這些抗-CD19抗體的Fe區(qū)內(nèi)的氨基酸修飾可具有不僅對(duì)于效應(yīng)子功能，包括ADCC和/或CDC的結(jié)果，而且直接對(duì)于抗體的糖基化特征。它們尤其是展示，F(xiàn)e區(qū)內(nèi)的一些修飾可導(dǎo)致抗-CD19抗體具有感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其當(dāng)抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括野生型哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，尤其CHO細(xì)胞，諸如野生型dhfr+CHO細(xì)胞(由ATCC收集購(gòu)買的)產(chǎn)生 或表達(dá)時(shí)，低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本發(fā)明的第I目的旨在提供賦予感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其對(duì)抗-CD19抗體，包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞，優(yōu)選野生型細(xì)胞，諸如野生型CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的或表達(dá)的抗體的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修飾的Fe區(qū)。通過(guò)定義，野生型表示細(xì)胞未修飾或加工，以便修飾天然細(xì)胞的糖基化機(jī)理。本發(fā)明的第2目的旨在提供給含有此Fe區(qū)的抗-⑶19抗體賦予ADCC功能的修飾的Fe區(qū)。本發(fā)明的第3目的旨在提供給含有此Fe區(qū)的抗-⑶19抗體賦予⑶C功能的修飾的Fe區(qū)。本發(fā)明的第4目的旨在提供給含有此Fe區(qū)的抗-⑶19抗體賦予ADCC和⑶C功能的修飾的Fe區(qū)。本發(fā)明的第5目的旨在提供給含有此Fe區(qū)的抗-⑶19抗體賦予ADCC和/或⑶C功能，且此外，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞，包括野生型中產(chǎn)生的或表達(dá)時(shí)賦予感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修飾的Fe區(qū)。發(fā)明詳述
本發(fā)明的第I對(duì)象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人 IgGlFc 區(qū)的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代。Fe區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基根據(jù)Kabat 的編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)。本發(fā)明的重組抗-⑶19抗體在野生型細(xì)胞，尤其嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，諸如尤其是野生型CHO中產(chǎn)生之后具有感興趣的糖基化特征。尤其是，自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如野生型CH0，本發(fā)明允許表達(dá)大比例的重組抗體或其片段，攜帶包含具有半乳糖基化及非-巖藻糖基化的末端GlcNac的長(zhǎng)鏈的雙觸角-型的常見的N-聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)。一種或更多糖型存在于重組抗-⑶19抗體群。糖型是僅關(guān)于附接的聚糖的數(shù)或類型不同的蛋白的同種型。
在非常令人驚訝的和有價(jià)值的實(shí)施方式中，抗體具有低巖藻糖水平。此是指在這些細(xì)胞，例如野生型CHO中產(chǎn)生的重組抗-⑶19抗體群之中，在此實(shí)施方式中，非-巖藻糖基化的抗體的比例占抗體的大致至少40%，優(yōu)選大致至少60%，更優(yōu)選大致至少80%或更高，例如至少85%。更具體而言，非-巖藻糖基化關(guān)乎Fe。作為CHO 細(xì)胞，提及的可為 CHO dhfr-/-，CH0/DG44 和 CHOEasy C。本發(fā)明的特定對(duì)象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人 IgGlFc 區(qū)的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗體已在野生型嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選野生型CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。根據(jù)優(yōu)選的特征，此抗體具有低水平的巖藻糖。本發(fā)明的另一對(duì)象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人 IgGlFc 區(qū)的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，具有低巖藻糖水平。根據(jù)本發(fā)明，低水平的巖藻糖是指(I)在一抗體，尤其在其Fe中減少的量的巖藻糖或(2)尤其在它們的Fe中具有減少的量的巖藻糖和/或無(wú)巖藻糖的組中的大量的抗體。在本說(shuō)明書中，說(shuō)到本發(fā)明的Fe或2個(gè)Fe的抗體。即便不每次提及，有對(duì)于每實(shí)施方式優(yōu)選的情況，其中抗體具有2個(gè)Fe和各Fe之一具有類似結(jié)構(gòu)(相同的突變)和類似糖基化特征。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和不帶有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe和無(wú)(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,優(yōu)選及，無(wú)(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一實(shí)施方式中，抗體包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:
.(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2.(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5 (GlcNAc)2聚糖的Fe和無(wú)(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,優(yōu)選及，無(wú)(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2聚糖,及I個(gè)或2個(gè)以下聚糖的Fe:# (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2本發(fā)明的另一對(duì)象是抗-CD19抗體，抗-CD19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人IgGlFc區(qū)的各氨基酸第243，292，300，305，326，396或243，292，300, 305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗體具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe 和 / 或，優(yōu)選及，不帶有(Gal)工(GlcNAc) 2 (Fuc) J(Man)3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)e,優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中,抗體包含F(xiàn)e,優(yōu)選2個(gè)帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:# (Gal) j (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2在仍非常令人驚訝的和有價(jià)值的實(shí)施方式中，抗體具有高寡甘露糖水平。此是指在這些細(xì)胞,例如野生型CHO中產(chǎn)生的重組抗-⑶19抗體群之中，特征為更高水平的寡甘露糖的抗體的比例占抗體的大致至少20%，優(yōu)選大致至少30%，更優(yōu)選大致至少40%，仍更優(yōu)選大致至少50%或更高。 在仍非常令人驚訝的和有價(jià)值的實(shí)施方式中，在這些細(xì)胞，例如野生型CHO中產(chǎn)生的重組抗體群之中，特征為更高水平的唾液酸化的糖型的抗體的比例占抗體的大致至少1.5%，優(yōu)選大致至少2.5%，更優(yōu)選大致至少5%或更高。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體組合這些特征，尤其低巖藻糖水平和高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的3種。尤其是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如野生型CHO細(xì)胞允許表達(dá)大比例的抗體或其片段，攜帶包含具有半乳糖基化及非-巖藻糖基化的末端GlcNac的長(zhǎng)鏈及給抗體賦予強(qiáng)ADCC活性的雙觸角-型的常見的N-聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)。在一實(shí)施方式中，抗-CD19抗體具有本發(fā)明的特定糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型，所述抗體是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選野生型哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選嚙齒動(dòng)物來(lái)源，尤其CHO細(xì)胞中產(chǎn)生或表達(dá)的，或要產(chǎn)生的或表達(dá)的。本發(fā)明也具有作為根據(jù)本發(fā)明的對(duì)象抗體組(或抗體組合物)，其中其包含抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人IgGlFc區(qū)的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代。根據(jù)特征，抗體組已在野生型嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選野生型CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。根據(jù)另一特征，抗體組具有低水平的巖藻糖。根據(jù)再一特征，抗體組已在野生型嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選野生型CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。在第I實(shí)施方式中，此組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,優(yōu)選及,該抗體的少于或等于 20%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal): (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。糖型
百分率以數(shù)％表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，抗體組包含抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中，值是至少15%。在另一實(shí)施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優(yōu)選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在優(yōu)選的實(shí)施方式中抗體組包含全部這些特征。在一實(shí)施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一實(shí)施方式中，抗體組包含:籲抗體的少于1.5或1%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)^ (Man) 3 (GlcNAc)2 的 Fe (典型為 0.1 1.5%)，和 / 或優(yōu)選，籲抗體的少于2或1.5%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)i+(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe (典型為 0.1 2)。在再一實(shí)施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優(yōu)選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%,其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及還是籲抗體的少 于1.5或1%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優(yōu)選 抗體的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實(shí)施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。本發(fā)明的另一對(duì)象是根據(jù)本發(fā)明的抗體組(或抗體組合物)，其中其包含抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人IgGlFc區(qū)的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代，且其中組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,優(yōu)選及,該抗體的少于或等于20%,其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) I (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在另一實(shí)施方式中，抗體組包含至少20，30，40或50%的抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實(shí)施方式中，值是至少15%。在另一實(shí)施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優(yōu)選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實(shí)施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一實(shí)施方式中，抗體組包含:籲抗體的少于1.5或1%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優(yōu)選籲抗體的少于2或1.5%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 的 Fe。在再一實(shí)施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優(yōu)選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%,其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及還是籲抗體的少于1.5或1%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優(yōu)選

抗體的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，優(yōu)選 2 個(gè)帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實(shí)施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在一實(shí)施方式中，細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，尤其是CHO細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，細(xì)胞是野生型嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，尤其野生型CHO細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，抗-⑶19抗體能產(chǎn)生⑶C或⑶C+ADCC活性。在一實(shí)施方式中，此抗-⑶19抗體能產(chǎn)生⑶C或⑶C+ADCC活性及呈現(xiàn)本發(fā)明的特定糖基化特征，尤其本發(fā)明的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本發(fā)明的抗體可在Fe區(qū)中包含補(bǔ)充性突變。在一實(shí)施方式中，F(xiàn)e區(qū)還在氨基酸第333位包含氨基酸取代。人IgG Fe區(qū)可為IgG亞-類的區(qū)。其可為IgGl，IgG2，IgG3或IgG4的Fe區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，F(xiàn)e區(qū)是IgGlFc區(qū)。根據(jù)本發(fā)明取代的Fe區(qū)的氨基酸可被任何氨基酸取代，條件是取代的氨基酸的全體組能產(chǎn)生此⑶C或⑶C+ADCC活性和/或賦予本發(fā)明的特定糖基化特征，尤其本發(fā)明的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型?？赡艿娜〈睦o出如下。在一實(shí)施方式中，Phe243被Leu取代。在一實(shí)施方式中，Arg292被Pro取代。在一實(shí)施方式中，Tyr300被Leu取代。在一實(shí)施方式中，Val305被Leu取代。在一實(shí)施方式中，Lys326被Ala取代。在一實(shí)施方式中，Glu333被Ala取代。在一實(shí)施方式中，Pro396被Leu取代。在一實(shí)施方式中，抗-CD 19抗體包含F(xiàn)e區(qū)，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代。在一實(shí)施方式中，此Fe區(qū)具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列(Fc34)。編碼此Fe區(qū)的核酸示于SEQ ID NO:2。在另一實(shí)施方式中，抗-CD19抗體包含F(xiàn)e區(qū)其中，Phe243被Leu取代，Arg292被Pro 取代，Tyr300 被 Leu 取代，Val305 被 Leu 取代，Lys326 被 Ala 取代，Glu333 被 Ala 取代，及Pro396被Leu取代。在另一實(shí)施方式中，此Fe區(qū)具有示于SEQ ID NO: 3的氨基酸序列(Fc24)。編碼此Fe區(qū)的核酸示于SEQ ID N0:4?？稍诒景l(fā)明的多肽的結(jié)構(gòu)中制造修飾和變化，而仍獲得具有如特征的分子。例如，無(wú)可同意的活性損失地，序列中的特定氨基酸可用其他氨基酸代替。因?yàn)槠涫嵌嚯牡南嗷プ饔媚芰托再|(zhì)，定義多肽的生物學(xué)功能活性，可在多肽序列(或，當(dāng)然，其成為基礎(chǔ)的編碼序列的DNA)中制造特定氨基酸序列取代和然而獲得具有類似性質(zhì)的多肽。在制造該變化中，可考慮氨基酸的親水性指數(shù)。本領(lǐng)域通常明白給多肽賦予相互作用生物學(xué)功能的親水性氨基酸指數(shù)的重要性(Kyte et al.1982)。已知，特定氨基酸可用具有類似親水性指數(shù)或分值的其他氨基酸代替，而仍導(dǎo)致具有類似生物學(xué)活性的多肽。各氨基酸已基于其疏水性和荷電特征分配親水性指數(shù)。認(rèn)為，氨基酸的相對(duì)親水性表征確定得到的多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其進(jìn)而限定多肽與其他分子，例如，酶，底物，受體，抗體，抗原，等的相互作用。如為本領(lǐng)域所知，氨基酸可由具有類似親水性指數(shù)的另一氨基酸取代，和仍獲得以生物學(xué)方式功能性地相當(dāng)?shù)亩嚯?。在該變化中，?yōu)選其親水性指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的取代，特別優(yōu)選在±1之內(nèi)的那些，及甚至更特別優(yōu)選在±0.5之內(nèi)的那些。也可基于親水性制造類似氨基酸的取代，特別當(dāng)由此創(chuàng)建的生物學(xué)功能性地相當(dāng)?shù)碾幕蚨嚯闹荚诿庖邔W(xué)實(shí)施方式中使用。美國(guó)專利4，554，101，通過(guò)引用在本文合并，說(shuō)到多肽的最大局部平均親水性，如由其相鄰氨基酸的親水性管理的，與其免疫原性和抗原性，即與多肽的生物學(xué)性質(zhì)關(guān)聯(lián)。如在美國(guó)專利4，554，101中細(xì)節(jié)化，以下親水性值已分配給氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 + 1);谷氨酸(+3.0 + 1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(-0.5 + 1);蘇氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。需知，氨基酸可用具有類似親水性值的另一氨基酸代替，而仍獲得生物學(xué)相當(dāng)體，且尤其是，免疫學(xué)相當(dāng)體，多肽。在該變化中，優(yōu)選其親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸的取代，特別優(yōu)選在±1之內(nèi)的那些，及甚至更特別優(yōu)選在±0.5之內(nèi)的那些。如上所述，氨基酸取代通常因此基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，它們的疏水性，未水性，電荷，尺寸，等。
權(quán)利要求
1.抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGFe區(qū)，優(yōu)選IgGlFc區(qū)，其中此變體區(qū)在人IgG Fe區(qū)的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位和任選地第333氨基酸位包含氨基酸取代，其中Fe區(qū)中氨基酸殘基的編號(hào)是Kabat 的編號(hào)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體已在野生型嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選野生型CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
3.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。
1.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其具有Fe，優(yōu)選2個(gè)不帶有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)I+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。
2.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
3.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:#(Gal)j (GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2,#(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2。
4.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其是ADCC+和⑶C+。
5.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其中抗體識(shí)別CD19抗原上的非-內(nèi)化表位，優(yōu)選包含其VH和VL氨基酸序列以下表所示的抗體mR005-l或mR005_2的CDR的抗體，或更優(yōu)選，包含那些序列的抗體:
6.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其包含F(xiàn)e區(qū)，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
7.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體，人源化的抗體，全人抗體，雙特異性酸抗體，抗體藥物綴合物或抗體片段。
8.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，其引發(fā)程序性細(xì)胞死亡。
9.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，用于治療癌的方法。
10.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，用于治療難治性或復(fù)發(fā)抗-CD20抗體治療的患者的癌的方法。
11.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體組，其中其包含: 該抗體的少于或等于15%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，和/或 該抗體的少于或等于20%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。
12.權(quán)利要求15的抗體組，其中其包含抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
13.權(quán)利要求15或16的抗體組，其中其包含:抗體的少于1.5或1%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan) 3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或抗體的少于2或1.5%，其包含F(xiàn)e，優(yōu)選2個(gè)帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan)3(GlcNAc)2 的 Fe。
14.藥物組合物，其包含前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的抗體，及生理學(xué)可接受的媒質(zhì)或賦形齊U，且可能包含針對(duì)不同于CD19的腫瘤抗原的抗體，優(yōu)選針對(duì)CD20的抗體。
15.權(quán)利要求16的組合物，用于治療癌或自身免疫疾病的方法。
16.權(quán)利要求10的組合物，其用作抗-腫瘤藥物或用作用于治療難治性或復(fù)發(fā)抗-CD20抗體治療的患者的癌的抗-腫瘤治療。
17.權(quán)利要求14，15或16的組合物，其包含另一抗-癌劑。
18.核酸序列，其編碼變體Fe區(qū)，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
19.表達(dá)載體， 其包含編碼含有VH核酸序列如SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34所示的抗體mR005_l或mR005-2的VH⑶R的多肽的核酸序列，或更優(yōu)選， 核酸序列包含SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34，及在SEQ ID NO: 1，3所示的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位，及任選地第333氨基酸位包含氨基酸取代的人Fe區(qū)。
20.表達(dá)載體， 其包含編碼含有VL核酸序列如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36所示的抗體mR005_l或mR005-2的VL⑶R的多肽的核酸序列，或更優(yōu)選， 核酸序列包含SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:36，及人κ區(qū)。
21.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求13和/或14的載體，宿主細(xì)胞優(yōu)選是野生型CHO細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-CD19抗體，其具有賦予一種或幾種有用的效應(yīng)子功能的相對(duì)于野生型Fc區(qū)具有一些特定氨基酸修飾的變體Fc區(qū)。本發(fā)明尤其涉及包含該變體Fc區(qū)的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗體。其有利地涉及具有感興趣的和有價(jià)值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和低水平的唾液酸化的糖型的抗體。本發(fā)明也涉及這些抗體在疾病或病癥，諸如癌，尤其B細(xì)胞惡性腫瘤，及自-免疫疾病的治療，防止或管理中的用途。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103221068SQ201180044951
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者C·韋爾莫-德羅什, B·S·維耶爾莫 申請(qǐng)人:國(guó)際藥物發(fā)展生物技術(shù)公司