專利名稱：一種清火片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種清火片的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
清火片記載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0414-90,由大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g作為原料藥制成，能清熱瀉火，通便。用于咽喉腫痛，牙痛，頭目眩暈，口鼻生瘡，風(fēng)火目赤，大便不通。現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有清火片在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用?！?br>
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種清火片的制備方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種清火片在制備抑制大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的—種清火片的制備方法，由大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取大青葉、薄荷腦，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥· min，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。上述一種清火片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。上述一種清火片的制備方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。上述一種清火片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。上述清火片在制備抑制C6細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中，清火片每片O. 5g，每次6片，一日2次，采用本發(fā)明制備成的清火片每片O. 5g，每次僅需3片，一日服用2次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。試驗一、不同方法制備的清火片中大黃素含量的比較1、儀器及試藥本發(fā)明清火片按實施例3方法制備，使用550. 65g原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。原清火片，按部頒標(biāo)準(zhǔn)方法制備，使用550. 65g原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色譜儀；METTLERAE240電子分析天平；大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所)。2、方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數(shù)按大黃素峰計算，應(yīng)不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的大黃素對照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。供試品溶液的制備取本發(fā)明清火片和原清火片，研細(xì)，混勻，取lg，精密稱定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。 3、結(jié)果結(jié)果表明，本發(fā)明清火片中大黃素的含量為1. 34mg/片；而原清火片中大黃素的含量為O. 26mg/片，在服用量減少的情況下，大黃素含量有很大提高。上述研究表明，采用本發(fā)明制備的清火片，有效成分含量高于部頒標(biāo)準(zhǔn)法制備的清火片。
具體實施例方式以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1取大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g,將大青葉、薄荷腦，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C, CO2流量lml/g生藥· min，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為1. 48mg/片。實施例2取大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g,將大青葉、薄荷腦，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥· min，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為1. 33mg/片。
實施例3取大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g,將大青葉、薄荷腦，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥· min，萃取時間160min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為1. 34mg/片。實施例4 :清火片抑制C6細(xì)胞增殖的實驗研究資料I實驗材料 1.1實驗用細(xì)胞株大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)，南京正寬醫(yī)藥科技有限公司實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。1. 2實驗藥物研究藥物本發(fā)明清火片按實施例3方法制備。藥液儲液稱取IOOmg清火片，溶于5ml無水乙醇中，O. 2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時O. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。1. 3實驗試劑DMEM (GIBC0 公司 Cat. No. 12100_061Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419)；NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810_033Lot.No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號2010242);Str印tomycin SulfateCAMRESCO公司批號2010382);無水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號080310182);MTT(Biosharp批號0793) ; PBS (實驗室自配)；1. 4實驗器材萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號3111);超凈臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號DHG9123A);冰箱(西門子公司型號KG18V21TI);液氮罐(CBS型號2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。2實驗方法I) C6細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個/ml。2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入清火片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示 細(xì)胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。3統(tǒng)計處理采用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean+ S. D.表不。4實驗結(jié)果MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對C6細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0· 001)。表I清火片對C6細(xì)胞增殖抑制影響研究(X士S0)
權(quán)利要求
1.一種清火片的制備方法，由大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦O. 65g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取大青葉、薄荷腦，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上， 50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用； 將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000 片，每片重O. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種清火片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種清火片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率500W， 每次萃取6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種清火片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間 160min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種清火片在制備抑制大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種清火片的制備方法，由大青葉400g、大黃100g、石膏50g、薄荷腦0.65g作為原料藥，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得大黃素含量有很大提高，本發(fā)明還提供了清火片在制備抑制大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P11/04GK102988612SQ20121039007
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:李正梅