專利名稱：小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備抗腫瘤藥物，尤其涉及具有抗腫瘤作用的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物及其制備方法。
背景技術(shù)：
利用抗體對腫瘤特異抗原的選擇性，對抗腫瘤藥物進行主動靶向設(shè)計，可提高抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性，降低其對正常器官的毒性。目前，抗體藥物的研究主要有兩個方向一個是抗體藥物的小型化。由于抗體及其偶聯(lián)物均為大分子物質(zhì)。IgG型抗體的分子質(zhì)量約為150kD，龐大的抗體或偶聯(lián)物分子難以通過毛細(xì)管內(nèi)皮層和細(xì)胞外間隙到達實體瘤深部的腫瘤細(xì)胞。因此，研制小型化抗體藥物對提高療效有重要意義。通過酶切方法獲得的Fab片段，其分子質(zhì)量約相當(dāng)于完整抗體的1/3。研究表明，抗體片段較易穿透細(xì)胞外間隙到達深部的腫瘤細(xì)胞。與完整抗體相比，抗體片段的免疫原性較弱。使用抗體片段， 可降低人體的抗體反應(yīng)。另一個研究方向就是抗體藥物的高效化?？贵w連接上對腫瘤細(xì)胞有強烈殺傷作用的“彈頭”，可降低藥物的用量及對其他器官的毒性，還可以減少治療費用。早在本世紀(jì)70年代初，美國哈佛大學(xué)Judah Folkman博士就正式提出腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移都與腫瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)密切相關(guān)，因此靶向腫瘤血管生成的治療策略就顯得尤為重要。研究表明，Endoglin高表達于各種腫瘤組織及腫瘤組織邊緣血管起源的內(nèi)皮細(xì)胞，但很少出現(xiàn)在正常組織的內(nèi)皮細(xì)胞，是腫瘤血管生成的標(biāo)志性分子之一，可作為腫瘤抗血管治療和靶向治療的重要靶點。阿霉素(AdriamyCin，ADM)是一種抗腫瘤抗生素，可嚴(yán)重干擾DNA的合成、DNA依賴性RNA合成和蛋白質(zhì)合成，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。本文將初步探討小型化的Endoglin抗體片段與阿霉素偶聯(lián)物的抗腫瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物，其中，偶聯(lián)物Fab-ADM是由N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯 (MBS)作為交聯(lián)劑，MBS首先與一含有-NH2的分子即阿霉素(ADM)反應(yīng)并穩(wěn)定結(jié)合為活性的中間產(chǎn)物，然后再與一含有-S-的分子即為經(jīng)胃蛋白酶消化、二硫蘇糖醇(DTT)還原的抗體片段Fab反應(yīng)得到終產(chǎn)物，即偶聯(lián)物Fab-ADM ；Fab與ADM的分子比為1 2。本發(fā)明還提供小型化Endoglin抗體與阿霉素偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟(1)、選用MBS作為交聯(lián)劑備用；(2)、阿霉素的MBS修飾阿霉素的MBS修飾調(diào)整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1調(diào)整反映體系，于室溫反應(yīng)30min后，立即與巰基化的單抗混合。
(3)、Endoglin抗體片段Fab的巰基化 經(jīng)飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S-200HR (Sephacryl S-200HR)純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應(yīng)時的分子比約為20 1，37°C，反應(yīng)3-6小時，反應(yīng)體系pH值為 4. 5 ；反應(yīng)結(jié)束后，加入2M的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0終止反應(yīng)；調(diào)整經(jīng)^^?。〖∏晒?S-200HR凝膠柱純化所得的F(ab' )2濃度為10mg/ml，加入二硫蘇糖醇(DTT)還原，其終濃度為50mM，室溫反應(yīng)30min，脫鹽后立即與步驟O)中的MBS修飾的阿霉素偶聯(lián)。0)、偶聯(lián)物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應(yīng)18h;偶聯(lián)物過 Sephacryl S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。


圖1為偶聯(lián)物的制備原理圖；其中A :MBS反應(yīng)原理圖(引自Bioconjugate Techniques (2nd Edition), Greg Τ. Hermanson, P287) ；B :阿霉素；C :經(jīng)胃蛋白酶消化、DTT 還原所得的抗體片段Fab ；D 抗體經(jīng)胃蛋白酶消化示意圖(來自hternet :http://www. binglixue. com/zhikao/yaodian/jichu/my05. htm)；圖2為MTT法分析游離ADM與偶聯(lián)物Fab-ADM對肝癌細(xì)胞株BEL-7402的體外增值抑制率；圖3為荷瘤小鼠在不同監(jiān)測點的腫瘤體積；圖4為荷瘤小鼠在不同監(jiān)測點的存活率。
具體實施例方式1材料與方法1.1 材料1. 1. 1實驗動物及細(xì)胞株分泌抗Endoglin單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、肝癌細(xì)胞株BEL-7402由本實驗室保存，小鼠肝癌H22細(xì)胞株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；體重18-22g的清潔II級昆明種雄性小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。1. 1.2藥品與試劑鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星)為意大利Pfizer Italia S. r. 1.公司產(chǎn)品。 Sephacryl S-200HR凝膠購自GE公司；濃縮超濾管購自Millipore公司。異型雙功能偶聯(lián)齊[JMBS (m-Maleimidobenzoyl-N—hydroxysuccinimide ester)購自 Sigma公司。蛋白 Marker 購自！^ermentas公司。胃蛋白酶購自Amersco公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。DMEM干粉及FBS購自Gibco公司。其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。1. 2 方法1. 2. 1抗體偶聯(lián)物制備1. 2. 1. 1抗體偶聯(lián)物制備原理偶聯(lián)物的制備選用MBS作為交聯(lián)劑，MBS的作用機制見圖1A，MBS首先與一含有-NH2的分子R(在本實驗中為阿霉素(結(jié)構(gòu)式見圖IB))反應(yīng)并穩(wěn)定結(jié)合為活性的中間產(chǎn)物，然后再與一含有-S-的分子R'(本實驗中為經(jīng)胃蛋白酶消化、DTT還原的抗體片段 Fab(圖IC))反應(yīng)得到終產(chǎn)物，即偶聯(lián)物。胃蛋白酶作用于完整的抗體分子后，可將IgG重鏈間二硫鍵近C端切斷，得到一個具有兩價抗體活性的F(ab' )2段，還有Fc段的小部分 (此時Fc段的大部分都水解成較小分子的肽，不呈現(xiàn)任何生物學(xué)活性)(圖ID)。F(ab' )2 經(jīng)DTT還原后可暴露出二硫鍵與交聯(lián)劑結(jié)合(圖1C)。1. 2. 1. 2阿霉素的MBS修飾調(diào)整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1 調(diào)整反映體系，于室溫反應(yīng)30min后，立即與巰基化的單抗混合；1. 2. 1. 3Endoglin抗體片段Fab的巰基化經(jīng)飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S_200HR(S印hacryl S-200HR)純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應(yīng)時的分子比約為20 1，37°C，反應(yīng)3-6小時(最佳反應(yīng)為 3小時)，反應(yīng)體系pH值為4. 5。反應(yīng)結(jié)束后，加入2M的Tris，pH8.0終止反應(yīng)。調(diào)整經(jīng) Sephacryl S-200HR凝膠柱純化所得的F (ab ‘ ) 2濃度為10mg/ml，加入DTT還原(其終濃度為50mM)，室溫反應(yīng)30min，脫鹽后立即與MBS修飾的阿霉素偶聯(lián)。1.2. 1.4偶聯(lián)物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應(yīng)18h ；偶聯(lián)物過 Sephacryl S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。1. 2. 1. 5偶聯(lián)物中Fab與ADM的分子比計算根據(jù)吸光度的加和性，可以在同一試樣中不經(jīng)分離同時測定兩個以上的組分。AaSOrrSpab CFab+S^icADMA232.S=^illf Cpab+S^MCADMCadm /Cpab—(Spab 5 -Rspab)/R = A232. 5/A280上述公式中，A表示吸光度，A= ebc，其中ε為吸光系數(shù)，單位L/(g · cm)，b為液層厚度(通常為比色皿的厚度)，單位cm，c為溶液濃度，單位g/L。1. 2. 1. 6 非還原 SDS-PAGE 檢測采用非還原SDS-PAGE檢測偶聯(lián)物的大小。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為 5%，電泳電壓為100V，時間為80min。1. 2. 2偶聯(lián)物的體外細(xì)胞增殖抑制試驗選用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為 3000個/100 μ L，每孔加IOOyL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h0加入以無血清DMEM倍比稀釋的ADM及偶聯(lián)物Fab-ADM各10 μ L/孔，每個濃度設(shè)3個平行孔，同時設(shè)空白對照孔，陰性對照孔加無血清DMEM培養(yǎng)液10 μ L。繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入10 μ L MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后，每孔加入100 μ L Formanzan溶解液，繼續(xù)孵育4h左右，于570nm處測定吸光度并計算腫瘤抑制率和IC50值。抑制率(％ ) = (1 一實驗組OD值/對照組OD值)X 100%。并根據(jù)IC50值計算偶聯(lián)物的體內(nèi)使用劑量偶聯(lián)物體內(nèi)實際用藥劑量=游離ADM劑量X (偶聯(lián)物的體外IC50/游離ADM體外IC50)。IC50 的計算方法為改良寇式法lgIC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
其中Xm: Ig最大劑量I Ig (最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm 最大陽性反應(yīng)率Pn 最小陽性反應(yīng)率1.2. 3偶聯(lián)物的體內(nèi)腫瘤抑制試驗昆明小鼠，雄性，體重18_22g，隨機分組，每組10只。小鼠肝癌細(xì)胞株H22經(jīng)小鼠腹腔傳代一次，收集腹水細(xì)胞，以生理鹽水按1 3稀釋后，接種于小鼠右腋皮下，0.2ml/只 (約2X106個細(xì)胞/只)。待腫瘤體積生長到約4X6mm大小時，開始用藥。給藥方式為尾靜脈注射，對照組給予生理鹽水0. aiil/只，ADM劑量為0. %ig/kg，偶聯(lián)物體內(nèi)用量表示為等細(xì)胞毒性劑量0. %ig/kg，F(xiàn)ab劑量亦為0. %ig/kg。每周給藥一次，連續(xù)3周給藥。實驗期間，每周測量2次腫瘤的長徑a和短徑b，以公式V = O. 52ab2計算瘤體積(V)，繪制腫瘤生長曲線，并計算抑瘤率。觀察動物生存情況，以Kap Ian-Meier法計算中位生存時間。統(tǒng)計學(xué)處理各組動物的腫瘤體積均用mean 士 SD表示，組間分析采用t檢驗。2 結(jié)果2. 1偶聯(lián)物中Fab與ADM的分子比計算制作標(biāo)準(zhǔn)曲線求出ε值，R = 0. 722/0. 298 ^ 2. 42, cADM/cFab 2，分子比 Fab ADM=I 2。偶聯(lián)物中Fab與ADM的分子比為1 2，說明一個Fab分子結(jié)合了兩個ADM，根據(jù)MBS的特性，偶聯(lián)物中也應(yīng)該含有兩個MBS分子，根據(jù)該假設(shè)，可估算出偶聯(lián)物的分子量為 MFab+2MADM+2MBS 51788Da。2. 2 非還原 SDS-PAGE 檢測偶聯(lián)物的分子量與估算的大致相符。2. 3偶聯(lián)物Fab-ADM的體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用以MTT法測定Fab-ADM偶聯(lián)物及ADM對體外培養(yǎng)的BEL-7402肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果見圖2。根據(jù)公式計算ADM和Fab-ADM偶聯(lián)物對肝癌BEL-7402細(xì)胞的增殖抑制的IC50分別為3. 15ug/ml和124ug/mL·若計算為等細(xì)胞毒性劑量，F(xiàn)ab-ADM的IC50值為 2. 78，該數(shù)值與游離ADM的IC50值差異不大，這可能與BEL-7402不是Endoglin的靶細(xì)胞有關(guān)。動物實驗中，游離ADM采用0. 4mg/kg的劑量，根據(jù)IC50值推算出偶聯(lián)物Fab-ADM 的實際使用劑量為15. 75mg/kg，但表示為0. 4mg/kg的等細(xì)胞毒性劑量。2. 4偶聯(lián)物的體內(nèi)腫瘤抑制試驗小鼠皮下接種肝癌H22后，待腫瘤體積生長到約4X6mm大小時，開始用藥治療。腫瘤生長曲線如圖3所示。與游離ADM相比，等細(xì)胞毒性劑量的偶聯(lián)物Fab-ADM能顯著抑制 H22的生長。根據(jù)腫瘤體積計算藥物的抑瘤率用藥第14天，ADM(O.^ig/kg)的抑制率為 25%，偶聯(lián)物(0. %ig/kg，等細(xì)胞毒性劑量)的抑制率達到91. 94%;而第21天時，ADM治療的荷瘤小鼠均死亡，偶聯(lián)物的抑制率仍為87. 00%，抑制作用較ADM顯著增強(P < 0. 05)。觀察動物的生存狀態(tài)及生存時間，結(jié)果顯示(圖4)偶聯(lián)物Fab-ADM治療組的中位生存時間約為32天，而ADM治療組的約為14天。這說明與游離ADM相比，偶聯(lián)物Fab-ADM 不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間(P < 0. 01)。
3 結(jié)論Endoglin抗體片段Fab經(jīng)MBS與阿霉素的偶聯(lián)產(chǎn)物Fab-ADM大小約51788Da，體內(nèi)實驗中，F(xiàn)ab-ADM能顯著抑制H22的生長。根據(jù)腫瘤體積計算藥物的抑瘤率用藥第14 天，ADM(0. 4mg/kg)的抑制率為25%，偶聯(lián)物(0. %ig/kg，等細(xì)胞毒性劑量)的抑制率達到 91. 94% ；而第21天時，ADM治療的荷瘤小鼠均死亡，偶聯(lián)物的抑制率仍為87. 00%，抑制作用較ADM顯著增強(P < 0. 05)。偶聯(lián)物Fab-ADM治療組的中位生存時間約為32天，而ADM 治療組的約為14天。這說明與游離ADM相比，偶聯(lián)物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果， 還可顯著延長荷瘤動物的生存時間(P < 0. 01)。以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。
權(quán)利要求
1.小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物Fab-ADM是由MBS作為交聯(lián)劑，MBS首先與一含有-NH2的分子即ADM反應(yīng)并穩(wěn)定結(jié)合為活性的中間產(chǎn)物，然后再與一含有-S-的分子即為經(jīng)胃蛋白酶消化、DTT還原的抗體片段Fab反應(yīng)得到終產(chǎn)物，即偶聯(lián)物；Fab與ADM的分子比為1:2。
2.如權(quán)利要求1的小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟(1)、選用MBS作為交聯(lián)劑備用； 0)、阿霉素的MBS修飾調(diào)整阿霉素濃度為10mg/ml，MBS濃度為ang/ml，以MBS與阿霉素摩爾比為10 1調(diào)整反映體系，于室溫反應(yīng)30min后，立即與巰基化的單抗混合； (3)、Endoglin抗體片段Fab的巰基化經(jīng)飽和硫酸銨沉淀及丙烯葡聚糖凝膠S-200HR純化得到的單抗分子，與胃蛋白酶反應(yīng)時的分子比約為20 1，37°C，反應(yīng)3-6小時，反應(yīng)體系pH值為4.5;反應(yīng)結(jié)束后，加入2皿的Tris，pH8.0終止反應(yīng)；調(diào)整經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠S-200HR凝膠柱純化所得的F(ab' )2濃度為10mg/ml，加入DTT還原，其終濃度為50mM，室溫反應(yīng)30min，脫鹽后立即與步驟⑵中的MBS修飾的阿霉素偶聯(lián)； G)、偶聯(lián)物的制備MBS修飾的阿霉素與巰基化單抗的摩爾比為約15 1，室溫反應(yīng)18h;偶聯(lián)物過丙烯葡聚糖凝膠S-200HR凝膠柱純化并超濾濃縮，于吸光度^Onm處測定蛋白濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供小型化Endoglin抗體與阿霉素的偶聯(lián)物及其制備方法，偶聯(lián)物為Fab-ADM；Fab與ADM的分子比為1∶2。制備方法包括(1)選用N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)作為交聯(lián)劑備用；(2)阿霉素以異型雙功能交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾(3)Endoglin抗體片段Fab的巰基化；(4)偶聯(lián)物的制備。該偶聯(lián)物Fab-ADM不但有更強的腫瘤抑制效果，還可顯著延長荷瘤動物的生存時間。
文檔編號A61K47/48GK102258789SQ201010624459
公開日2011年11月30日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者周松林, 林映瑩, 王 華, 譚光宏, 趙煥閣, 郭峻莉, 黃用豪, 黃風(fēng)迎 申請人:海南醫(yī)學(xué)院