專利名稱：一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領(lǐng)域，特別是涉及一株血清4型副豬嗜血桿菌株。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)為巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中的一種革蘭氏陰性球桿菌，是豬的一種條件性病原菌，呈世界性分布，感染仔豬后引起以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的豬格拉澤氏(Glasser’s)病。主要危害2 8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為10% 15%，死亡率可達(dá)50%以上。副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求苛刻，生長嚴(yán)格需要V因子(NAD)，目前認(rèn)為胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基與胰蛋白胨大豆(TSB)培養(yǎng)基是培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的最適培養(yǎng)基。在添加NAD的TSA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h可見針尖大小灰白色菌落，呈隆起圓形，表面光滑、濕潤、邊緣整齊。HPs在巧克力瓊脂平板上生長困難，有報道顯示，巧克力平板上HPs不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不適用于體外傳代培養(yǎng)，但巧克力瓊脂平板可以用于分離該菌，初次分離培養(yǎng)時供給5% 10%的二氧化碳(CO2)可促進(jìn)生長。液體培養(yǎng)時需要在肉湯或TSB培養(yǎng)基中添加血清與V因子(NAD)，但添加V因子濃度不斷增加細(xì)菌濃度不會隨之升高。由于葡萄球菌生長過程中會將自身代謝產(chǎn)物V因子釋放到培養(yǎng)基中，所以HPs與金黃色葡萄球菌共同接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，HPs在金黃色葡萄球菌兩側(cè)生長良好，隨著與金黃色葡萄球菌距離增加，菌落逐漸變小，該現(xiàn)象被稱為衛(wèi)星現(xiàn)象。HPs對外界環(huán)境抵抗力極弱，體外培養(yǎng)極易死亡。HPs菌株間抗原性和毒力差異很大，血清學(xué)分型是區(qū)別不同菌株的重要方法之一。目前，由Kielstein等1992年提出的基于熱穩(wěn)定抗原免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的血清學(xué)分型方法(KRG)已在世界范圍內(nèi)被接受，該方法將HPs分成15個血清型，然而有15.2% 41%的分離株血清型不能確定。根據(jù)日本、德國、美國和西班牙等國的血清流行病學(xué)調(diào)查，以血清型4、5和13最為流行。HPs在我國普遍流行，目前,在河北、河南、湖北、湖南、安徽、上海、廣東、江西等12個省市均有副豬嗜血桿菌病發(fā)生和分離 出HPs的報道。由于獸醫(yī)臨床上常常大量甚至不合理使用抗菌藥，致使豬場細(xì)菌在藥物壓力下選擇出耐藥菌群。因此，用藥物防控副豬嗜血桿菌病的難度越來越大，而且隨著人們對食品安全問題的擔(dān)憂，抗生素在防控動物疾病方面的應(yīng)用會更少，而將發(fā)揮更大作用的是相應(yīng)的疫苗。HPs血清型較多，且不同血清型菌株的毒力與致病力差異較大，各個血清型之間免疫交叉保護(hù)力很低，所以，現(xiàn)有國內(nèi)外商品化的副豬嗜血桿菌病疫苗均不能對該病提供完全有效的保護(hù)。因此，分離篩選免疫原性強(qiáng)的通用型HPs菌株，并利用其制備高效疫苗是防控副豬嗜血桿菌病的重中之重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株(FS0307株)，該疫苗株具有較強(qiáng)的毒力和很高的免疫原性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis),菌株號為FS0307,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號:CCTCC N0:M2013094，保藏日期:2013年3月21日。該菌株是發(fā)明人于2003年4月于河北省衡水市自行采集篩選獲得一株具有較強(qiáng)的毒力和很高的免疫原性的菌株。上述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在制備治療豬副豬嗜血桿菌病藥物中的應(yīng)用。其中，所述的藥物為疫苗，優(yōu)選油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。其中，血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株與藥學(xué)上可接受的載體或輔料組合構(gòu)成藥物，如單價苗、多價苗或聯(lián)苗等等。其中，所述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在疫苗中含菌量為2X 109CFU/mL以上。有益效果:本發(fā)明的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，對仔豬有較強(qiáng)的致病性，且具有良好的免疫原性。應(yīng)用其制備的油佐劑滅活疫苗安全可靠，能夠產(chǎn)生較高水平的抗體，持續(xù)期長，并且對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護(hù)效果，免疫后豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果均達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，能夠有效預(yù)防副豬嗜血桿菌的流行。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株的分離純化和鑒定。1.生產(chǎn)用培養(yǎng)基TSA固體培養(yǎng)基配制:準(zhǔn)確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50 60°C時，加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.0P/oNAD,混合均勻后倒板備用。TSB液體培養(yǎng)基配制:準(zhǔn)確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121°C高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.01%NAD即可。2.副豬嗜血桿菌分離純化及鑒定2.1分離純化2003年，我國河北地區(qū)的某規(guī)?；i場大量出現(xiàn)疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬，以持續(xù)發(fā)熱、胸膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎等為特征，選取病豬的肺、胸水、心包液、關(guān)節(jié)液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置 37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時，挑取半透明隆起的小菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進(jìn)行兩次TSA/NAD固體培養(yǎng)基亞克隆培養(yǎng)。同時接種鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基，結(jié)果TSA/NAD固體培養(yǎng)基上生長良好，鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基沒有菌落生成。
2.2生化鑒定取純培養(yǎng)菌液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時。觀察菌落形態(tài)，可見針尖大小，圓形，邊緣整齊，扁平，灰白色半透明隆起的小菌落。取單個菌落涂片革蘭氏染色，為革蘭氏染色陰性，呈多形性，為單個小球桿菌或細(xì)長的絲狀桿菌。將純培養(yǎng)菌液在脫纖綿羊鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基上與金黃色葡萄球菌作交叉劃線，置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時后，呈小而透明的菌落，越靠近葡萄球菌附近生長越好，呈現(xiàn)出典型的衛(wèi)星生長現(xiàn)象，并且鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。將純培養(yǎng)菌液接種于TSA/NAD固體培養(yǎng)基，再分別貼上浸潰有X、V、X+V因子的圓形濾紙片。置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時，結(jié)果只有在含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長，表明該菌株只依賴V因子，而不依賴X因子。將純培養(yǎng)菌液接種微量生化反應(yīng)管，分別補(bǔ)充終濃度0.01%的NAD，置37°C靜置培養(yǎng)，48h后判定生化特性結(jié)果。結(jié)果表明分離菌株對葡萄糖、蔗糖和果糖發(fā)酵，對麥芽糖、半乳糖、木糖和果糖不發(fā)酵，吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)呈陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)陽性,符合副豬嗜血桿菌的生化特性。根據(jù)該菌株的來源地將其命名為FS0307株。2.316S rRNA基因序列測定與分析2.3.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中副豬嗜血桿菌P5基因序列設(shè)計兩條引物，引物序列為:P1:5’ -gctccacaagctaacactttc-3J，P2:5’ -catagaaacttcttttgaacc-3>,由上海生工生物工程有限公司合成，該引物擴(kuò)增片段大小為1038bp。2.3.2菌體DNA模板的制備取FS0307株培養(yǎng)物1.5mL, 10000r/min離心5min，棄上清，沉淀用200 μ L雙蒸水 重懸，100°C水浴IOmin后，12000r/min離心5min收集上清，即為PCR模板，_20°C保存?zhèn)溆谩?.3.3PCR擴(kuò)增及測序用提取的菌體DNA作為PCR模板。PCR擴(kuò)增體系為:10XPCRBuffer5.0 μ L，MgCl2 (25mM)2.5 μ L, dNTP (2.5mM)4.0 μ L，弓丨物 Pl (50 μ Μ)0.5 μ L,引物 Ρ2 (50μΜ) 0.5μ L，模板 DNA3.Ομ L，Taq 酶(5U/μ L) 0.5 μ L 加雙蒸水至 50 μ L。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C終延伸lOmin。取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳鑒定，同時以標(biāo)準(zhǔn)株作為陽性對照，結(jié)果出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)株相同的1038bp大小的特異性條帶，說明分離到的FS0307株為副豬嗜血桿菌。經(jīng)過回收鑒定為陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司測序。副豬嗜血桿菌FS0307株P(guān)5基因測序結(jié)果如SEQ ID N0.1所示，該序列與GenBank中公布的序列進(jìn)行BLAST比對，與國內(nèi)外已有的副豬嗜血桿菌相應(yīng)序列的同源性達(dá)95%以上。2.4副豬嗜血桿菌FS0307株血清學(xué)鑒定按Kleletein-Rapp-Gabriedson (KRG)瓊脂擴(kuò)散血清分型方法對副豬嗜血桿菌FS0307株的血清型作鑒定。將副豬嗜血桿菌FS0307株按5%的比例接種于TSB培養(yǎng)基，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)18 24小時后，將菌液濃縮至含菌量為I X 101(lCFU/mL，菌液5000r/min離心IOmin,取上清用于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的分型抗原。配制1%瓊脂平板,打孔(中間I個孔周邊6個),孔徑5.0mm,孔距3.0mm。。在周邊的6個孔內(nèi)加入6 μ I副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株兔抗高免血清(正上方孔標(biāo)記為I,加I型高免血清,其余各個血清型的血清依次按血清型遞增順序以順時針的方向加樣)，中間孔加待檢菌株的熱處理分型抗原6 μ 1，濕盒37°C孵育，分別在24h、48h、72h觀察并記錄結(jié)果，同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的對照。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)表明，副豬嗜血桿菌FS0307株的高壓提取抗原只與4型副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的陽性血清有沉淀線，與其它型標(biāo)準(zhǔn)株的血清型無沉淀線，說明副豬嗜血桿菌FS0307株為血清4型。2.5動物攻毒試驗(yàn)血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株經(jīng)TSB/NAD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計數(shù)，濃縮后，使感染滴度達(dá)到lX109CFU/ml，經(jīng)腹腔注射50 60日齡健康易感豬5頭，5ml/頭。另設(shè)I組對照組，5頭，腹腔注射TSB/NAD培養(yǎng)基，5ml/頭。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無抗生素。觀察14日，每日測體溫，觀察臨床癥狀。攻毒14日后剖檢，根據(jù)臨床癥狀與剖檢病變計算發(fā)病數(shù)。同時，取發(fā)病豬的組織病料做細(xì)菌分離和鑒定。攻毒結(jié)果顯示，連續(xù)觀察14日后，血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株攻毒組的5頭實(shí)驗(yàn)豬均先后發(fā)病；對照豬表現(xiàn)正常。臨床癥狀表現(xiàn)為，實(shí)驗(yàn)豬感染副豬嗜血桿菌分離株I日后體溫升高，隨后逐漸出現(xiàn)食欲降低，被毛粗亂，耳朵及全身皮膚發(fā)紅，鼻液增多，后期出現(xiàn)呼吸困難，關(guān)節(jié)腫脹，臥地不起。剖檢發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬和病死豬出現(xiàn)胸腔、腹腔積液，有不同程度的胸膜、腹膜粘連，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔粘液增多，肺臟出血，淋巴結(jié)腫脹等病變。結(jié)果見表I。 利用分離菌株攻毒的組織病料進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果從FS0307株攻毒組中的4頭發(fā)病豬中分離到菌落和菌體形態(tài)與副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相似的細(xì)菌。同時對所有分離到的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在1038bp處出現(xiàn)特異性條帶，證明分離病原為副豬嗜血桿菌。表I副豬嗜血桿菌FS0307株的毒力試驗(yàn)結(jié)果..
權(quán)利要求
1.一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)，菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號=CCTCCN0:M2013094，保藏日 期:2013年3月21日。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領(lǐng)域，公開了一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:M2013094，保藏日期2013年3月21日。本發(fā)明的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株對豬有較強(qiáng)的致病性，具有良好的免疫原性，應(yīng)用其制備的滅活疫苗安全可靠，對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護(hù)效果，免疫后豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少。無論是單苗還是聯(lián)苗，其免疫效果均達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，能夠有效預(yù)防副豬嗜血桿菌的流行。
文檔編號A61P31/04GK103194413SQ20131012619
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者邵國青, 劉茂軍, 周勇岐 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院