專利名稱：聚肌胞復(fù)合物免疫佐劑及含有該佐劑的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新免疫佐劑及含有該佐劑的疫苗，特別是涉及一種聚肌胞復(fù)合物免疫佐劑及其應(yīng)用。
免疫佐劑是一種能提高抗原免疫反應(yīng)的因子。由于這種因子的作用是加強(qiáng)幾乎所有T細(xì)胞依賴性抗原的免疫反應(yīng)，所以免疫佐劑的作用是非特異性的。免疫佐劑又稱免疫增強(qiáng)劑，除了能提高抗原的免疫效果外，也用于非特異性地提高機(jī)體抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲感染和腫瘤的能力。
眾所周知，疫苗是人類防治病毒病最有力的武器。在現(xiàn)有技術(shù)中，由于各種遺傳工程疫苗，合成多肽，亞單位疫苗以及一些小顆粒的全病毒滅活疫苗的免疫效果不好，通常都須用佐劑。目前國(guó)際上批準(zhǔn)的人用佐劑只有鋁佐劑。鋁佐劑的缺點(diǎn)是不能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，也不能促進(jìn)某些抗原的體液免疫以及其它一些弊病，因而遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了實(shí)際需要(AnthonyD.Chinnah，et.alVaccine，Vol，10Issue8，1992.551)為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的佐劑以及含有該佐劑的疫苗。這種新型佐劑安全穩(wěn)定，能誘生干擾素，白細(xì)胞介素Ⅱ，并抑制病毒繁殖，提高疫苗的效價(jià)，顯著提高機(jī)體IgM，IgG和中和抗體的產(chǎn)生。
本發(fā)明涉及含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(Polyriboinosinic-polyribocytididylicacid(PIC)containingKamamycinandcalcium)做為免疫佐劑的應(yīng)用。本文中以下將所述的含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞簡(jiǎn)稱為PICKCa。
早在70年代國(guó)際上就已發(fā)現(xiàn)了PIC，雙鏈聚肌胞具有很好的誘生干擾素作用，在此之后又發(fā)現(xiàn)了其衍生物，即含多聚賴氨酸和羧甲基纖維素的聚肌胞(PICcontainingpolyL-LysinandCarboxymethycellulose，PICLC)。但是PIC不能用于靈長(zhǎng)類從上的動(dòng)物包括人體而PICLC的毒性太大也不能用于人體。于是人們繼續(xù)研究終于發(fā)現(xiàn)了PICKCa，這種藥品只是用于對(duì)某些病毒病的治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知感染和發(fā)病是完全不同兩個(gè)概念。PICKCa的發(fā)現(xiàn)是用于病毒感染后，并且確診患上病毒病時(shí)才使用。而且就PICKCa對(duì)病毒病的治療效果也不盡人意。特別應(yīng)當(dāng)指出的是至今為止沒(méi)有任何資料報(bào)道將該已知的藥品做為免疫佐劑來(lái)加以使用。
PICKCa的用量是公知，因此通常每支疫苗中，可加入1～2mgPICKCa，其它按不同疫苗的要求進(jìn)行免疫注射。因此，本發(fā)明對(duì)PICKCa的用量不加以進(jìn)一部的說(shuō)明。
本發(fā)明涉及的佐劑PICKCa具有如下有益的效果1、PICKCa同病毒抗原或滅活疫苗結(jié)合后能顯著地提高該抗原或疫苗的免疫效果，即具有顯著的免疫佐劑的作用。
2、由于PICKCa本身在人體上已經(jīng)使用，使得PICKCa很容易地被人們接受，并替帶目前使用的鋁佐劑而獨(dú)樹一幟，成為很有前途的新的佐劑。
3、單獨(dú)PICKCa用于病毒性疾病感染的潛伏期具有顯著的抗病毒效果。
4、PICKCa與病毒抗原或滅活疫苗結(jié)合后，用于病毒感染潛伏期的治療較單純應(yīng)用PICKCa又進(jìn)一步增加了治療效果。
由于免疫佐劑的非特異性，PICKCa將在病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染治和抗腫瘤中產(chǎn)生重要作用;特別是將對(duì)多種疫苗產(chǎn)生顯著的免疫佐劑作用。本文所涉及的疫苗包括人用狂犬病疫苗，流行性出血熱疫苗，但并不限制于此。
圖表說(shuō)明表1PICKCa誘生干擾素的測(cè)定。
表2PICKCa誘生白胞胞介素Ⅱ的測(cè)定。
表3用PICKCa來(lái)誘生小鼠體內(nèi)IgG和中和抗體的測(cè)定。
表4PICKCa降低感染狂犬病病毒小白鼠的死亡率。
表5PICKCa與狂犬病毒抗原結(jié)合后，免疫OF1小鼠，在不同時(shí)間分離血清檢測(cè)其IgM、IgG和中和抗體的結(jié)果。
表6，表7PICKCa促進(jìn)疫苗效價(jià)的結(jié)果。
表8說(shuō)明PICKCa與狂犬病素抗原結(jié)合后，進(jìn)一步降低感染狂犬病毒小白鼠的死亡率結(jié)果。表9對(duì)于PICKCa和疫苗結(jié)合后安全性的檢測(cè)。
表10所示PICKCa促進(jìn)流行性出血熱滅活疫苗抗體的產(chǎn)生情況。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，以下將結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。下述的實(shí)施例并非意在限定本發(fā)明，只是幫助人們理解本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1PICKCa誘生干擾素。取OF1小鼠20只肌注PICKCa，每只0.05～0.1mg。在不同時(shí)間分離小鼠血清，通過(guò)抑制VSV病毒在L929細(xì)胞產(chǎn)生的病變，然后通過(guò)顯色法測(cè)定血清干擾素的產(chǎn)生情況。測(cè)定方法見MossmanT.，RapidColormetricassayforcellulargrowthandSurvivalapplicationtoproliferationandcytotoxieiktyassays.J.Immun.Meth1983，65∶55-63。
該試驗(yàn)的結(jié)果見表1。
該試驗(yàn)結(jié)果表明PICKCa能誘生高滴度干擾素，并在注射2小時(shí)即可達(dá)到高峰。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)為PICKCa誘生白細(xì)胞介素Ⅱ(IL-2)及其測(cè)定。取C3H小鼠，用抗原，即滅活提純狂犬病毒(IPRV)和PICKCa免疫小鼠。每只腹腔注射0.1ml。取小鼠脾臟，用3H標(biāo)記CTLL細(xì)胞法測(cè)定IL-2。該方法見Joffret ML，et al.Appraisal of Rabies Vaccine Potency by Determination of In vitro，Specific Interleukin-2 Production.Biologicals，1991.19(2)113-123。
說(shuō)試驗(yàn)的結(jié)果見表2。表明PICKCa能夠非特異性地提高IL-2產(chǎn)量。
實(shí)驗(yàn)例3A/J小鼠用活的狂犬病毒野毒株RD9147感染后，用PICKCa治療，用ELISA法(PerrinP.TTechniguesforthepreparationofreabiesconjugatesinLaboratorytechniquesinrabies(4th，edittion)WHO或RFFIT方法(SmithJ.Arapidreproduciblefestfordeterminingrabiesneutralizingantibody。Bull。WldhithOrg.1973.48535-541)測(cè)定小鼠體內(nèi)狂犬病毒IgG和中和抗體的滴度。每只小鼠體內(nèi)狂犬病毒株0.1ml，然后在5小時(shí)，3天和7天各肌注PICKCa0.05ml/只，并于不同時(shí)間抽血檢測(cè)IgG和中和抗體的滴度，其結(jié)果見表3。
結(jié)果表明小鼠在受到RD9147感染后，用PICKCa治療其IgG和中和抗體的滴度大大降低。表明由于PICKCa顯著抑制了病毒的繁殖、而使之不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。
實(shí)驗(yàn)例4PICKCa降低感染狂犬病小白鼠的死亡率。
將40只OF1小鼠隨機(jī)分成4組，每組10人，用狂犬病野毒株RD4077感小鼠，每只0.1ml感染后的6小時(shí)，第3.7，14和18天用PICKCa治療，每只0.05ml，肌注，觀察小鼠的死亡率;其結(jié)果見表4。
該結(jié)果說(shuō)明PICKCa在狂犬病毒感染的潛伏期，能夠極其顯著地降低小白鼠的死亡率。
實(shí)驗(yàn)例5PICKCa同狂犬病毒疫苗結(jié)合后的安全性測(cè)定。選用2組狂犬病毒疫苗分別加入PICKCa，分別對(duì)小鼠進(jìn)行腦內(nèi)和腹腔注射，觀察其死亡情況。
結(jié)果(見表9)表明安全。本試驗(yàn)按“中國(guó)藥典”急性毒性試驗(yàn)測(cè)量方法進(jìn)行。
實(shí)施例1OF1小鼠46只隨機(jī)分成4組。本試驗(yàn)是PICKCa與狂犬病毒抗原結(jié)合后，即制成疫苗，免疫OF1小鼠，以該抗原組和抗原加鋁佐劑組以及空白為對(duì)照，在不同的時(shí)間分離小鼠血清檢測(cè)IgM，IgG和中和抗體。其結(jié)果是表5。
本試驗(yàn)中IgG和中和抗體的測(cè)定方法同實(shí)驗(yàn)例3中所用的方法相同，IgM測(cè)定法是ELISA法測(cè)定。
該結(jié)果顯示抗原+PICKCa組能刺激機(jī)體提前和提高產(chǎn)生IgM，IgG，特別是中和抗體，而鋁佐劑卻使抗體產(chǎn)生置后，說(shuō)明以PICKCa為佐劑，其效果大大地高于Al2O3的佐劑效果。
實(shí)施例2.3PICKCa促進(jìn)疫苗的效價(jià)。
如表6所示，用NIH法WHOLaboratorytechniquesinrabies(3thedition)1973檢測(cè)，PICKCa可降低使用半數(shù)有效抗原量(ED50)5-10倍，而鋁佐劑僅降低1-2倍。
如表7表示，用NIH法測(cè)定PICKCa對(duì)人用狂犬病疫苗的佐劑效果。表明PICKCa可顯著提高人用狂犬疫苗的效力(國(guó)際單位)，使之均可從不合格而達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)以上(2.5國(guó)際單位)。
實(shí)施例4PICKCa與狂犬病毒抗原結(jié)合后，骯注小白鼠又進(jìn)一步降低感染狂犬毒小白鼠的死亡率。
本試驗(yàn)的目的是當(dāng)小鼠用野毒株感染后觀察PICKCa或Al2O3同滅活提純狂犬病毒結(jié)合后，對(duì)小鼠的保護(hù)作用。
如表8所示PICKCa與狂犬病疫苗結(jié)合后治療感染了狂犬病野毒株的小白鼠，較單純用PICKCa治療，又進(jìn)一步降低了小白鼠的死亡率，單純滅活疫苗治療效果微乎其微，而加入鋁佐劑則完全不起作用。
實(shí)施例5PICKCa促進(jìn)流行性出血熱滅活疫苗抗體的產(chǎn)生本試驗(yàn)采用Al(OH)做對(duì)照。PICKCa與出血熱滅活疫苗等量混合后，肌注實(shí)驗(yàn)家兔，1ml/只，隔周一次，在第14和21天抽血，用ELISA和RPHI檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況。
其結(jié)果見表10。表明PICKCa促進(jìn)流行性出血熱疫苗ELISA抗體效價(jià)4-8倍，RPHI抗體2倍，而鋁佐劑僅分別為0～4倍，對(duì)RPHI抗體反而降低。
表1PICACa誘生小鼠干擾素的測(cè)定時(shí)間(小時(shí)) 注射后干擾素滴度(國(guó)際單位×10-3)PICKCa0<51<52320324456<5
表2用PICKCa和滅活提純狂犬病毒(IPRV)免疫小鼠誘生白細(xì)胞介素-2的測(cè)定免疫PICKCa注射(μg)體外刺激IL-2的測(cè)定(cpm×10-8)培養(yǎng)液IPRVPICKCaPBS*01.11.10.9PBS750.50.60.91PRV00.613.92.71PRV753.715.72.0(0)**(12.0)**＊PBS磷酸鹽酸緩沖液＊＊與培養(yǎng)液IL-2的差值表3用ELISA或RFFIT法測(cè)定RD9147狂犬病野毒株感染后，并且PICKCa處理后A/J小鼠體內(nèi)狂犬病IgG和中和抗體的滴度不同日期感染后PICKCaELISA測(cè)RFFIT測(cè)中和感染鼠的血清治療時(shí)間IgG的滴度抗體的滴度(MIU/ml)(IU/ml)RD91473天//0.28RD91473天第7小時(shí)/<0.28RD91478天/25281.60RD91478天第5小時(shí),<224<0.25第3天和7天RD914715天/115203.38RD914715天第3小時(shí),第3120<0.283,7,1014天PBS15天/68<0.28表明PICKCa顯著抑制了狂犬病毒在小鼠體內(nèi)的繁殖。
表4PICKCa降低用RD4077狂犬病野毒株感染的OF1小鼠死亡率組RD4077死亡率潛伏期(天)稀釋度PICKCa純4/1017,18,20,2210-10/10對(duì)照組純10/1010,11,12,13,14,13,13,17,17,1710-110/10 11 13,14,14,17,17,17,19,
表5 用狂犬病毒抗原(V427)或同該抗原結(jié)合的PICKCa或者Al2O3免疫OF1小鼠，測(cè)定其狂犬病IgM，IgG和中和抗體的滴度免疫血清IgM滴度IgG滴度中和抗體滴度ELISA法ELISA法RFFIT法IU/mlAU/mlMIU/ml第4天Ag180870.25Ag+PICKCa4132641.01Ag+Al2O3231 97 <0.13第7天Ag61515221.01Ag+PICKCa>160041666.65Ag+Al2O3169 351 0.43第14天Ag47949002.54Ag+PICKa5222632017.24Ag+Al2O3408 12000 11.97
第30天Ag10718003.01Ag+PICKCa1501360015.63Ag+Al2O3190 4000 6.86第60天Ag11750002.10Ag+PICKCa1501880015.96Ag+Al2O398 6000 7.64空白對(duì)照1640-
表6 用NIH試驗(yàn)測(cè)定注射PICKCa或Al2O3后的小鼠對(duì)滅活狂犬病毒的保護(hù)作用佐劑注射劑量(μg)注射日期半數(shù)有效量07無(wú)00221PICKCa1001002280080040Al2O33000 3000 9310001000132
表7用NIH試驗(yàn)測(cè)定PICKCa對(duì)人用狂犬病疫苗的激刺效價(jià)編號(hào)試驗(yàn)組ED50效價(jià)CVSLD50疫苗81163+PICKCa4℃下4周2.184.33IU/2ml5137℃下4周1.962.64IU/2ml5疫苗891634℃下4周1.801.82IU/2ml537℃下4周1.711.48IU/2ml5參照品84-52.534.9IU/安瓶5疫苗890842+PICKCa4℃下4周1.994.58IU/2ml5237℃下4周1.742.60IU/2ml5疫苗8908424℃下4周1.531.58IU/2ml5
參照品84-52.324.9IU/安瓶5參照品84-5+PICKCa2.4914.1IU/安瓶32參照品84-52.034.9IU/安瓶32
表8 PICKCa，Al2O3及其與狂犬病毒抗原結(jié)合后，對(duì)感染狂犬病毒小鼠的治療效果用IPRV治療后(注射量μg)的死亡率其它治療0140560無(wú)95(19/20)*95(19/20)20(7/10)PICKCa30(3/10)95(19/20)70(7/10)Al2O3100(10/10) 95(19/20) 70(7/10)＊.小鼠死亡數(shù)/感染狂犬病毒小鼠數(shù)表9狂犬病疫苗與PICKCa結(jié)合后對(duì)18克體重的小白鼠安全性測(cè)定實(shí)驗(yàn)組數(shù)組別0.03mli.c0.5mli.p1疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa2疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa
表10PICKCa或鋁佐劑在家兔體內(nèi)對(duì)流行性出血熱疫苗抗體測(cè)定兔號(hào)免疫組別14天血清21天血清ELISARPHIELISaRPHI1 疫苗+Al(OH)32048 / 2048 /+PICKCa2 疫苗+Al(OH)3+PICKCa2048/1024/3疫苗+PICKCa4096324096324疫苗+PICKCa4096324096325 疫苗Al(OH)31024 / 512 86 疫苗Al(OH)32048 / 1024 87疫苗51216512168疫苗5121651216
ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定RPHI反應(yīng)被動(dòng)血凝抑制試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫佐劑的應(yīng)用。
2.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)佐劑疫苗。
3.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2和3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是指含卡那霉素的鈣離子的聚肌胞(PICKCa)在哺乳動(dòng)物或人在病毒感染期的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述疫苗在哺乳動(dòng)物或人在病毒感染期的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫佐劑或增強(qiáng)劑的應(yīng)用特別是涉及含PICKCa的疫苗及將PICKCa應(yīng)用于哺乳動(dòng)物或人的病毒感染期。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1095951SQ9310586
公開日1994年12月7日 申請(qǐng)日期1993年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月31日
發(fā)明者林海祥 申請(qǐng)人:林海祥