專利名稱：L－蘇糖酸鈣在治療骨折中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-蘇糖酸鈣的一種新用途，具體說是L-蘇糖酸鈣在預(yù)防和治療骨折中的用途。
背景技術(shù)：
骨折是指骨的結(jié)構(gòu)連續(xù)性的中斷，它是一種常見的外科疾病。骨折分為外傷性骨折和病理性骨折，外傷性骨折是由暴力作用造成的骨折，而病理性骨折是由于骨本身有病理變化如老年性骨質(zhì)疏松等再加上遭受一定程度的外力造成的骨折。
傳統(tǒng)上將骨折愈合分為四個階段(1)炎性階段；(2)軟骨痂階段；(3)硬骨痂階段；(4)再塑形階段。炎性階段是骨折后的立即反應(yīng)。骨端與鄰近組織出現(xiàn)血腫，迅速發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為血管擴張、血漿與白細胞滲出。軟骨痂階段是自腫痛消失到骨斷端纖維或軟骨組織連接的階段，此時血腫機化，破骨細胞清除殘留死骨，骨膜下骨開始形成。其特征是血管大量增加，骨痂內(nèi)有毛細血管長入，細胞極其豐富。硬骨痂階段是從骨端有軟骨痂粘著到新骨形成。這階段相當于臨床和X線表現(xiàn)的骨折愈合，一般需3—4個月，骨痂從纖維軟骨性組織變?yōu)槔w維骨，在骨端間出現(xiàn)膜性骨形成。再塑形階段是骨折端被新生骨連接后，逐漸適應(yīng)新的功能的過程。
骨折愈合是組織修復(fù)程序極為獨特的過程。它與其它組織的修復(fù)不同，其它組織修復(fù)的結(jié)局是瘢痕形成，而骨的修復(fù)不是瘢痕形成，是通過骨的再生來實現(xiàn)的。因此成骨細胞的增殖在骨折愈合中起著決定性的作用。
另外，Lane從生物化學角度進行骨折愈合的分類(1)間充質(zhì)階段，這階段合成I、II、III型膠原；(2)軟骨樣階段，以II型膠原為主；(3)軟骨類骨階段，以I、II型膠原為主；(4)成骨階段，以I型膠原為主。因此可見，膠原合成在骨折愈合中也起著非常重要的作用。
目前普遍認為，普通的鈣制劑對促進骨折的愈合沒有明顯的作用，而且也沒有發(fā)現(xiàn)明顯促進骨折愈合的其它藥物。治療骨折主要還是結(jié)合采取以下三種傳統(tǒng)手段1、骨折的整復(fù)；2、固定；3、功能鍛煉。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種L-蘇糖酸鈣的用途，具體說是在預(yù)防和治療骨折中的用途。
針對上述促進骨折愈合的因素，發(fā)明人研究了L-蘇糖酸鈣對成骨細胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用，以及L-蘇糖酸鈣對促進I型骨膠原合成的作用。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，L-蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，同時又能促進體外培養(yǎng)成骨細胞I型原膠原mRNA的表達，從而能夠促進骨折的愈合，起到治療骨折的作用，并由此完成了本發(fā)明。
同時通過上述作用，L-蘇糖酸鈣能夠增加骨的密度和力學性能，起到預(yù)防骨折，尤其病理性骨折，如由老年性骨質(zhì)疏松引起的骨折的作用。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣為白色顆粒，無味，能溶于水，不溶于醇、醚及氯仿，它的分子式為C8H14O10Ca，化學結(jié)構(gòu)式為 它的制備方法描述在中國專利96106507.9及美國專利No.6,077,872中，當然也可以用現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它方法來制備。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣可以采用口服的給藥方法。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣能以各種藥物制劑如片劑、膠囊和藥學可接受組合物的形式使用。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，可以含有一定量的L-蘇糖酸鈣作為活性成分，也可含有藥學可接受的載體，這些藥學可接受的載體可以是在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛用于藥物中的各種載體，如賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法如混合、制粒、壓片來制備。
本發(fā)明的L-蘇糖酸鈣藥物組合物還可以包括各種藥學使用的任選組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。本發(fā)明優(yōu)選L-蘇糖酸鈣藥物組合物包括高達60wt％，優(yōu)選80wt％，更優(yōu)選90wt％的L-蘇糖酸鈣，其余為賦形劑和其它任選組分。
L-蘇糖酸鈣的用量可以根據(jù)病人的體重和年齡來變化。作為指導(dǎo)，L-蘇糖酸鈣的用量一般是在0.5—12克/天，優(yōu)選3—7克/天。對于兒童，可以按其體重比例相應(yīng)減少。
L-蘇糖酸鈣在動物體內(nèi)的藥代動力學試驗表明L-蘇糖酸鈣在大鼠體內(nèi)吸收代謝為一室模型，與其它鈣劑如葡萄糖酸鈣、醋酸鈣、碳酸鈣相比，吸收較為緩慢，血鈣達峰時間較晚，Tmax＝0.79h，但吸收較為完全，半衰期T1/2＝4.45h，在體內(nèi)能長時間維持在較高水平，曲線下面積AUC＝191.75μg/mL.hr。
一、L-蘇糖酸鈣對體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用為提供L-蘇糖酸鈣對成骨細胞增殖、增加骨量的細胞學基礎(chǔ)，本試驗應(yīng)用體外培養(yǎng)成骨細胞方法，觀察該藥對細胞骨形成功能的刺激作用。取新生SD大鼠頭蓋骨、分離培養(yǎng)成骨細胞1×104的密度接種于含10wt％NCS-MEM培養(yǎng)液，取第二繼代細胞進行藥效試驗。結(jié)果表明10-9—10-3mol/L的L-蘇糖酸鈣對成骨細胞有增殖作用，10-3mol/L對細胞活性、礦化結(jié)節(jié)形成能力均有明顯刺激作用，對ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成能力有一定提高作用。
材料和方法1、取材新生(24小時內(nèi))SD大鼠消毒后，在滅菌條件下取頭蓋骨，先經(jīng)0.25％胰蛋白酶預(yù)消化10—15分鐘，隨后以0.1％II型膠原酶，37℃振蕩消化60分鐘，以1000rpm離心收集細胞。
2、細胞培養(yǎng)將分離的細胞以1×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為10％NCS-MEM，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至半?yún)R合時傳代，取第二代繼代細胞(OB2)進行藥效試驗。
3、藥物各待試藥物均配制成0.1mol/L濃度，經(jīng)高壓滅菌備用。
L-蘇糖酸鈣1.55g，50ml去離子水，加熱溶解；葡萄糖酸鈣2.24g，50ml去離子水，常溫溶解；對照組為去離子水。
4、觀察指標(1)細胞增殖OB2以6×103/孔密度接種于24孔COSTOR培養(yǎng)板，24小時后換入含不同濃度藥物(10-9—10-3mol/L)的培養(yǎng)液，于加藥后72小時用MTT方法在Labsystems Multiskan MS(芬蘭)酶標儀上進行測試，以波長570nm處的OD值表示細胞增殖情況，結(jié)果與對照組比較。
(2)ALP活性測定OB2以2×104/孔密度接種24孔上述培養(yǎng)板，24小時后換入含藥培養(yǎng)液，以后每48小時換液一次，待匯合后用對硝基苯磷酸鹽法測細胞溶解液中的ALP活性，用考馬斯蘭法測定蛋白含量，以U/mg蛋白表示ALP活性，結(jié)果與對照組比較。
(3)礦化功能測定OB2以5×104/孔密度接種6孔上述培養(yǎng)板，24小時后換入含藥培養(yǎng)液，48小時換液一次，14天后固定，茜素紅染色，光鏡下礦化結(jié)節(jié)計數(shù)，結(jié)果與對照組比較。
結(jié)果表1—3給出的是藥物對增殖的實驗結(jié)果。表中的結(jié)果顯示，三批實驗中10-9—10-3mol/L L-蘇糖酸鈣組OB2增殖率均顯著高于對照組，并且以10-3mol/L的OD值為最高；多數(shù)濃度組OB2的OD值顯著高于葡萄糖酸鈣組和氯化鈣組。L-蘇糖酸鈣組中實驗一、二的OB2OD值顯著高于對照組，實驗三未見明顯改變，與葡萄糖酸鈣和氯化鈣組比較多數(shù)無明顯差別。
表1 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞的影響實驗一(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01表2 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞的影響實驗二(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01表3 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞增殖的影響實驗三(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01，$P＜0.0012、L-蘇糖酸鈣對OB2ALP活性的影響參照OB2增殖的結(jié)果，以10-3mol/L濃度進行藥物OB2ALP活性刺激作用實驗，結(jié)果見表4。
在相同濃度下，L-蘇糖酸鈣OB2ALP活性高于對照組，實驗一、二的增高有顯著意義(P＜0.05)。與葡萄糖酸鈣和氯化鈣組比較，L-蘇糖酸鈣OB2ALP活性均有增高，但無顯著性。
表4 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞ALP活性的影響

注n＝4與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，3、L-蘇糖酸鈣對OB2礦化功能的刺激作用由表5可見，成骨細胞2周形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)以L-蘇糖酸鈣組為高，L-蘇糖酸鈣組的增高有顯著意義(P＜0.05)。
表5 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞礦化功能的影響

n＝5與對照組比較*P＜0.05，與L-蘇糖酸鈣比較&P＜0.05成骨細胞是骨形成細胞，在骨重建中增殖、分化，合成、分泌與骨形成有關(guān)的膠原和非膠原蛋白質(zhì)，生成類骨質(zhì)和促進類骨質(zhì)礦化。形成的新骨質(zhì)修補破骨細胞骨吸收形成的骨陷窩。成骨細胞功能減退致新骨形成量減少，對骨吸收陷窩的修復(fù)能力減弱，造成骨小梁變細、薄弱、穿孔，皮質(zhì)骨呈多孔性改變。在骨形成促進藥物的成骨細胞藥效學評價中，常以增殖率、堿性磷酸酶的活性(ALP)和礦化結(jié)節(jié)為指標，這些指標分別代表成骨細胞的增殖、分化和礦化能力，可較全面地評價藥物對成骨細胞形成功能的刺激作用。
以上結(jié)果顯示1、L-蘇糖酸鈣對體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖率、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成有明顯的刺激作用。2、L-蘇糖酸鈣對體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖率、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成的刺激作用均高于葡萄糖酸鈣、氯化鈣。
二、L-蘇糖酸鈣對促進I型骨膠原合成的作用研究本項研究將深入討論L-蘇糖酸鈣對體外培養(yǎng)成骨細胞I型膠原(α-COLI)基因表達的影響。
材料與方法1、細胞培養(yǎng)原代成骨細胞的培養(yǎng)方法同前，第2代OB按1×104cell/cm接種。傳代第2天，按相同濃度(10-3mol/L)在不同培養(yǎng)瓶中分別加入L-蘇糖酸鈣、葡萄糖酸鈣，對照組加相同體積的去離子水。每48小時換培養(yǎng)液并加藥，一周后提取細胞總RNA。
2、RNA的提取將細胞用0.25％胰酶消化，1000rpm×5min離心收集細胞沉淀，用TRIzol試劑(Gibco公司)法提取細胞總RNA。經(jīng)瓊脂糖甲醛變性電泳見18s與28s條帶，用紫外分光光度計測RNA的濃度與純度(A260/A280值在1.7—2.0之間)。
3、RT-PCR反應(yīng)本次實驗采用Access RT-PCR System試劑盒(Promega)。按說明進行操作。反應(yīng)混合液在PCR儀(Bio-Rad公司)中48℃45min條件下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，94℃2分鐘滅活酶，然后進行30個循環(huán)的PCR反應(yīng)，94℃30min變性，54℃1min退火，72℃2min延長，末次循環(huán)后72℃延伸7min。取9μL PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂凝膠電泳，電泳條帶圖象分析系統(tǒng)(ImageMaster VDS)分析，光密度值經(jīng)內(nèi)參照-Actin校正，校正值進行統(tǒng)計分析。
表6引物序列

4、藥物各待試藥物均配成0.1mol/L濃度，經(jīng)高壓滅菌后備用。
L-蘇糖酸鈣由北京巨能亞太生命科學研究中心提供，1.55g＋50ml去離子水，加熱溶解。
葡萄糖酸鈣，上海黃海制藥廠，2.24g＋50ml，2.24g＋50ml去離子水配制。
結(jié)果應(yīng)用定量RT-PCR技術(shù)檢測成骨細胞中α-COLI的mRNA表達時發(fā)現(xiàn)，在相同給藥濃度(10-3mol/L)條件下，L-蘇糖酸鈣組的mRNA水平較對照組有顯著升高(P＜0.05)。說明L-蘇糖酸鈣可以促進成骨細胞α-COLI mRNA的表達。葡萄糖酸鈣組的α-COLI mRNA水平與對照組間無顯著差異。
表7

注X±SD，n＝3，與對照組比較*P＜0.05，成骨細胞在骨折時的增殖、分化、成熟的過程中，在胞漿內(nèi)合成大量的I型原膠原，并分泌到基質(zhì)中，構(gòu)成了骨質(zhì)的主要成分—膠原，從而促進骨折的愈合。同時骨質(zhì)的含量又是決定骨骼強度的重要因素，在臨床中常將I型膠原蛋白降解片段的測定作為反映成骨功能的指標之一。因此說明，L-蘇糖酸鈣在預(yù)防和治療骨折中具有非常重要的意義。本研究采用定量RT—PCR方法，檢測α-COLI mRNA水平，較蛋白分子的檢測更能反映OB內(nèi)基因的表達情況。
在過去的藥效學各試驗中發(fā)現(xiàn)L-蘇糖酸鈣明顯增加去勢大鼠的骨密度、骨鈣含量與生物力學參數(shù)。細胞藥效試驗表明該藥能促進OB增殖、分化與礦化功能。本項試驗研究觀察發(fā)現(xiàn)L-蘇糖酸鈣上調(diào)體外培養(yǎng)OB的α-COLImRNA水平。這與以往細胞藥效所反映其增強成骨細胞骨形成功能的作用是相關(guān)的，提示L-蘇糖酸鈣可能是通過增強OB內(nèi)某些基因的表達、從而提高OB的成骨功能。膠原蛋白水平的檢測可進一步證實。
上述試驗表明，L-蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，同時又促進體外培養(yǎng)成骨細胞I型原膠原mRNA的表達。通過這些作用，L-蘇糖酸鈣能夠起到促進骨折愈合的作用，并能夠增加骨的密度和力學性能，起到預(yù)防骨折，尤其病理性骨折(如老年性骨質(zhì)疏松癥)的作用。
權(quán)利要求
1.L-蘇糖酸鈣在預(yù)防骨折中的用途。
2.L-蘇糖酸鈣在治療骨折中的用途。
3.用于預(yù)防和/或治療骨折的藥物組合物，它含有有效量的L-蘇糖酸鈣。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種L－蘇糖酸鈣的新用途,具體說是用于預(yù)防和治療骨折的用途。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)L－蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能,同時又能促進體外培養(yǎng)成骨細胞Ⅰ型原膠原mRNA的表達,從而能夠促進骨折愈合,增加骨的密度和力學性能,起到預(yù)防和治療骨折的作用。
文檔編號A61K31/191GK1328820SQ01119870
公開日2002年1月2日 申請日期2001年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月3日
發(fā)明者于凱, 王志文, 戴向國 申請人:北京巨能亞太生命科學研究中心