專利名稱：鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白對機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白對機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鐵元素是生命生長的必需元素。一直以來，人們認(rèn)識到，鐵代謝與免疫調(diào)控和感染以有千絲萬縷的聯(lián)系。近年來的研究顯示，與鐵代謝相關(guān)的重要基因也在感染以及免疫調(diào)控中起著極為重要的作用。在這些基因中，鐵調(diào)素(hepcidin)作為鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，其缺失導(dǎo)致IL-6和TNF-α的表達(dá)上調(diào)，在h印cidin敲除小鼠中，外源細(xì)菌模式分子的刺激下，小鼠機(jī)體發(fā)生免疫過激反應(yīng),產(chǎn)生膿毒血癥,導(dǎo)致h印cidin敲除小鼠的死亡。鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白(Hemojuvelin，HJV)作為BMPs (骨形態(tài)發(fā)生蛋白，)的共受體，協(xié)助增強(qiáng)BMPR(人骨成型蛋白受體，)對BMP的信號傳遞，促進(jìn)smadl/5/8的磷酸化水平，從而上調(diào)hepcidin的表達(dá)。目前鐵代謝研究中對HJV調(diào)控h印cidin的研究已經(jīng)有 很多重要發(fā)現(xiàn)。HJV是一種跨膜蛋白，HJV的突變導(dǎo)致Hepcidin的表達(dá)下降，其缺失的癥狀為:鐵在體內(nèi)大量蓄積，引發(fā)嚴(yán)重的遺傳疾病-青少年血色病，在青少年血色病病人尿液里，幾乎無法檢測出Hepcidin的含量；低水平的Hepcidin引起小腸對鐵的吸收增加以及巨曬細(xì)胞內(nèi)鐵釋放增力口，導(dǎo)致鐵離子在各個(gè)臟器中蓄積。由于脾臟中富含巨噬細(xì)胞，所以鐵含量比正常值低。另夕卜，HJV敲除小鼠模型的建立，確證了該基因的缺失會導(dǎo)致血色病。雖然鐵代謝和免疫系統(tǒng)一直以來都有著密不可分的聯(lián)系，但是HJV和免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系還很不清晰，未見報(bào)道。因此本領(lǐng)域迫切需要研究鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白對機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑的用途。本發(fā)明的另一目的是一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種篩選調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物的和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑的用途，用于制備免疫調(diào)節(jié)劑，或用于制備抗感染藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑(或所述的免疫調(diào)節(jié)劑，或所述的組合物)還用于:(B1)制備白介素IL-12的激動劑組合物；和/或(Id1)促進(jìn)干擾素IFN Y的產(chǎn)生和分泌；和/或(C1)上調(diào)一氧化氮合酶活性；和/或
(Cl1)促進(jìn)一氧化氮NO的產(chǎn)生；和/或(θι)促進(jìn)免疫細(xì)胞的殺菌功能。在另一優(yōu)選例中，所述的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白選自下組:(A)氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的多肽；(B)將SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白衍生物，或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白編碼序列選自下組:(Al)編碼如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列；(BI)如SEQ ID NO :2、4、6、8任一所示的多核苷酸序列；(Cl)與(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白來源于人或非人哺乳動物。在另一優(yōu)選例中，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白來源于小鼠，大鼠，或家鼠。在另一優(yōu)選例中，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白為s亞型(S-HJV)。在另一優(yōu)選例中，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白為人S-HJV或小鼠s-HJV。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑的用途，用于制備下調(diào)白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還用于:(a2)降低干擾素IFN Y的產(chǎn)生和分泌；和/或
(b2)下調(diào)一氧化氮合酶活性；和/或(c2)抑制一氧化氮NO的產(chǎn)生；和/或(d2)抑制免疫細(xì)胞的殺菌功能。本發(fā)明還提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑的用途，用于制備降低干擾素IFNY的產(chǎn)生和分泌的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還用于:(a3)下調(diào)白介素IL-12的活性；和/或(b3)下調(diào)一氧化氮合酶活性；和/或(C3)抑制一氧化氮NO的產(chǎn)生；和/或(d3)抑制免疫細(xì)胞的殺菌功能。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白、或其激動劑、或其拮抗劑的用途，用于:(I)調(diào)節(jié)白介素IL-12的活性；和/或(2)調(diào)節(jié)干擾素IFN Y的產(chǎn)生和分泌；和/或(3)調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性；和/或(4)調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生；和/或(5)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的殺菌功能。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種方法，所述方法用于調(diào)節(jié)白介素IL-12活性、調(diào)節(jié)干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性、調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的殺菌功能，所述方法包括步驟:改變鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)或活性；或添加鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的激動劑；或添加鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的拮抗劑。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物的方法，包括步驟:(i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；(ii)比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟:(iii)測定在測試化合物存在情況下免疫細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷能力，從而對測試化合物的調(diào)節(jié)功能進(jìn)行確認(rèn)。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關(guān)相關(guān)蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，包括步驟:(a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；(b)比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高 于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟:(c)測定在測試化合物存在情況下免疫細(xì)胞中所述炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的水平或活性，從而對測試化合物的調(diào)節(jié)功能進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1為HJV敲除小鼠和正常小鼠對細(xì)菌的易感性測試結(jié)果，a)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的易感性結(jié)果山)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對大腸桿菌的易感性結(jié)果；c)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對金黃色葡萄球菌的易感性結(jié)果；d)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大腸桿菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果；e)為正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要臟器中大腸桿菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果；f)為了排除鐵代謝的影響，在低鐵處理的小鼠體內(nèi)進(jìn)行了細(xì)菌致死實(shí)驗(yàn)，當(dāng)?shù)丸F喂養(yǎng)的小鼠機(jī)體鐵水平和野生型一致時(shí)，在某些臟器中甚至更低時(shí)，HJV敲除小鼠依然呈現(xiàn)細(xì)菌易感性。圖2顯示細(xì)菌刺激后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的變化，IO8E.Co I i腹腔注射后，不同時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，ELISA 檢測細(xì)胞因子水平 a) TNFa (1.5h)、b) IL_6(2.5h)、c) IFNy (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)細(xì)菌感染6h后，流式檢測細(xì)胞內(nèi)IFN γ表達(dá)水平，以及f)體外熱滅活菌刺激后，western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)信號通路的改變結(jié)果。圖3為與對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后體內(nèi)細(xì)胞功能變化結(jié)果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血內(nèi)白細(xì)胞變化；b)體外細(xì)胞吞噬功能檢測；c)體外細(xì)胞殺菌功能檢測；d)熱滅活細(xì)菌體外刺激巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞因子IFN Y分泌；e)熱滅活細(xì)菌體外刺激巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞因子IL-6分泌；f) western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)IFN Y _stat4信號通路的改變；g)體外巨噬細(xì)胞NO分泌檢測；h) western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS和p38信號通路的改變。圖4顯示HJV在免疫細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控模式；a)正常小鼠各種免疫細(xì)胞通過表面標(biāo)記通過流式分離，分別檢測細(xì)胞內(nèi)HJV的表達(dá)水平；在熱滅活細(xì)菌刺激下，野生型小鼠肝臟中HJV表達(dá)b)，巨噬細(xì)胞內(nèi)HJV表達(dá)c)，肝臟中FPN表達(dá)d)，巨噬細(xì)胞內(nèi)FPN表達(dá)e)，f)&g)熱滅活細(xì)菌的刺激下，過表達(dá)HJV的Raw264.7細(xì)胞中iNOS的表達(dá)更多h)，也分泌更
多NO。圖5顯示s-HJV表達(dá)純化及下調(diào)Hepcidin表達(dá)的功能檢測結(jié)果,其中，圖5a顯示分子篩純化及蛋白膠檢測；圖5b顯示s-HJV作用于原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，下調(diào)H印cidin表達(dá)，具有劑量效應(yīng)；圖5c顯示s-HJV可以增強(qiáng)HJV-/-小鼠抗感染能力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，在感染狀態(tài)下，HJV在免疫細(xì)胞中表達(dá)增加，協(xié)助IL-12促進(jìn)IFNy的生成，從而激活免疫細(xì)胞，表達(dá)iNOS，分泌NO，充分行使殺菌功能，因此HJV可以作為一個(gè)免疫調(diào)控中的重要分子。具體地，本發(fā)明涉及一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑、或其拮抗劑的用途，鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑用于制備上調(diào)白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的激動劑組合物；鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑用于制備下調(diào)白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物，本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物的和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法。鐵調(diào)素鐵調(diào)素是一個(gè)近年新發(fā)現(xiàn)的小分子多肽，主要由肝臟合成。它是肝臟、小腸和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)之間鐵代謝調(diào)節(jié)信號的傳遞者，也是機(jī)體鐵平衡的中心調(diào)節(jié)者。當(dāng)任何原因引起循環(huán)鐵增加時(shí)，肝細(xì)胞增加合成和分泌鐵調(diào)素進(jìn)入血液，鐵調(diào)素經(jīng)血流運(yùn)輸?shù)借F的吸收部位十二指腸及鐵儲存的主要部位巨噬細(xì)胞，與細(xì)胞膜上的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I (Feiroportin I)結(jié)合，并降解膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，從而抑制鐵從腸腔進(jìn)入血液，同時(shí)減少巨噬細(xì)胞分泌鐵進(jìn)入血液，使血液鐵水平降低。當(dāng)循環(huán)鐵較低時(shí)，肝臟合成與分泌的鐵調(diào)素減少，腸吸收上皮相關(guān)蛋白降解減少，腸鐵吸收量增加，使鐵水平回復(fù)到正常。HJV基因及鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白HJV基因即L0C138738基因，人類HJV基因位于染色體lq21區(qū)，長約2.6kb，包含4個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄后可 形成5個(gè)mRNA異構(gòu)體。HJV基因的產(chǎn)物是鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白(hemojuvelin^HJV基因突變?nèi)菀滓鹉贻p型血素沉著癥，這是由于鐵調(diào)素表達(dá)嚴(yán)重下降，進(jìn)而增加鐵吸收，終致組織嚴(yán)重鐵過負(fù)荷及相關(guān)癥狀。因此HJV基因突變引起的鐵調(diào)素表達(dá)障礙是這類疾病的根本原因。鐵代謝的重要調(diào)控因子HJV作為BMPs的共同受體，可通過SMADs作用于鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵激素Hepcidin的啟動子，調(diào)控其表達(dá)。人體HJV突變或小鼠HJV基因敲除均可引發(fā)Hepcidin下調(diào)，并導(dǎo)致過量鐵離子在器官蓄積。盡管HJV和hepcidin的表達(dá)是正相關(guān)作用，但是它們受調(diào)控作用卻是截然不同的，鐵水平可以調(diào)控hepcidin的表達(dá)，但是對HJV的表達(dá)卻沒有作用，而炎癥狀態(tài)下肝臟中hepcidin的表達(dá)水平被上調(diào)，而肝臟中的HJV則被下調(diào)，提示了 HJV在炎癥免疫中存在特有的作用。 在本發(fā)明中，術(shù)語“鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白”、“鐵調(diào)素調(diào)節(jié)多肽”等可互換使用，指具SEQID NO:1或3所示序列的蛋白或多肽或其衍生物和活性片段。在未特別指出時(shí)，術(shù)語“鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白”包括野生型和突變型蛋白。鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白具有兩種亞型，定位于細(xì)胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s-HJV)。s-HJV和m_HJV在H印cidin的調(diào)控作用上相拮抗。s-HJV的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示，也包括其衍生物、活性片段，突變片段。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括所述蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物 ”和“類似物”是指基本上保持天然鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是:(i)有一個(gè)或幾個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽；(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白編碼序列選自下組:(Al)編碼如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列;(BI)如SEQ ID NO:2、4、6或8任一所不的多核苷酸序列；(Cl)與(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。
NO內(nèi)源性NO是一種極不穩(wěn)定的化合物，其半衰期只有數(shù)秒(一般在5秒以下)，體內(nèi)多種組織和細(xì)胞均能合成內(nèi)源性NO (如巨噬細(xì)胞)。在合成NO的細(xì)胞中，以L-精氨酸(L-Arg)和分子氧為底物，在一氧化氮合酶(NOS)和還原型輔酶II (NADPH)存在的條件下，生產(chǎn)中間體對羥基L-Arg，后者與02發(fā)生反應(yīng)，生成等克分子量的NO和L-瓜氨酸，其中NOS是NO生成的最主要限速因子，NADPH、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是重要的輔助因子。NO是一種自由基氣體，其化學(xué)性質(zhì)非常活潑，能迅速與分子氧、超氧陰離子以及鐵、銅、鎂等發(fā)生反應(yīng)，氧化生成終末代謝物硝酸鹽(NO)和亞硝酸鹽(NO)而失活。免疫細(xì)胞(immunocyte)免疫細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。在腹腔中，各類血細(xì)胞組成成分分別為，巨噬細(xì)胞90%，淋巴細(xì)胞5-10%，多形核粒細(xì)胞5 %。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對于識別和清除外源微生物是至關(guān)重要的。在腹腔感染發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞通過吞噬和殺傷功能來清除微生物。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活，它們生成一氧化氮、氧自由基和抗菌肽等各種物質(zhì)行使殺傷功能。早在20世紀(jì)90年代，人們就已經(jīng)認(rèn)識到一氧化氮的抗菌作用。很多種細(xì)胞都可以產(chǎn)生一氧化氮，具有放松血管，神經(jīng)傳遞和抑制血小板聚集等作用。在天然免疫中，巨噬細(xì)胞合成和分泌的一氧化氮起到了重要的殺菌作用。作為一個(gè)非特異性的保護(hù)機(jī)制，一氧化氮可以通過結(jié)合巰基和金屬活性中心來阻斷微生物的呼吸和DNA復(fù)制過程，從而殺滅各種微生物，包括革蘭氏陰性菌和陽性菌。在巨噬細(xì)胞中，主要是誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)負(fù)責(zé)合成一氧化氮。和正常 小鼠相比，缺乏iNOS的小鼠對于感染更加敏感，不能有效控制細(xì)菌在體內(nèi)的繁殖。當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，作為天然免疫的重要組成部分的細(xì)胞因子分泌增加，包括TNF-a、IL-6和IFNy等。作為重要的原炎癥因子IFN Y可以通過全面激活巨噬細(xì)胞功能來抗菌，其中一個(gè)重要部分就是上調(diào)iNOS的表達(dá)，從而促進(jìn)一氧化氮的合成和分泌。誘導(dǎo)IFNy分泌的因子主要有兩個(gè)分別為IL-18和IL-12。它們分別通過p38和stat4的磷酸化通路來調(diào)控IFN Y的分泌。IFN Y ( Y 干擾素)IFN-Y具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞抑制活性，IFN-Y誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生，促進(jìn)NO的合成，IFN-Y還可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞星形細(xì)胞的iNOS產(chǎn)生，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些疾病的發(fā)生或保護(hù)作用有關(guān)。IFN在完全沒有內(nèi)毒素時(shí)不能刺激IL-1轉(zhuǎn)錄，反而在轉(zhuǎn)錄水平抑制IL-1自身誘導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生，但I(xiàn)FN-Y可增加LPS誘導(dǎo)的IL-1轉(zhuǎn)錄翻譯和分泌。應(yīng)用本發(fā)明提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑的用途，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑用于制備白介素IL-12的激動劑組合物，所述組合物還用于:促進(jìn)干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌；上調(diào)一氧化氮合酶活性；促進(jìn)一氧化氮NO的產(chǎn)生；促進(jìn)巨噬細(xì)胞的殺菌功能。本發(fā)明還提供了一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑的用途，所述拮抗劑用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物；降低干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌；下調(diào)一氧化氮合酶活性；抑制一氧化氮NO的產(chǎn)生；抑制巨噬細(xì)胞的殺菌功能。
本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞殺菌功能的化合物的方法，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，包括步驟:(i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；(ii)比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)巨噬細(xì)胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)巨噬細(xì)胞殺菌功能的化合物；(iii)測定在測試化合物存在情況下巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷能力，從而對測試化合物的調(diào)節(jié)功能進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關(guān)蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，包括步驟:(a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；(b)比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合物；(C)測定在測試化 合物存在情況下巨噬細(xì)胞中所述炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的水平或活性，從而對測試化合物的調(diào)節(jié)功能進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn):(I)提供鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑、或其拮抗劑的用途；(2)提供體外篩選調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞殺菌功能的化合物的和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。材料與方法1.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與處理取7-8 周的小鼠,腹腔注射 4% FTG (Fluid Thioglycollate medium),誘導(dǎo) 72h后，斷頸處死，75%酒精浸泡5min，剪開腹部皮膚至胸部，注射IOml預(yù)熱的PBS緩沖液，輕揉20次，用注射器將腹腔液吸出，吹散，300g條件下，室溫離心lOmin，用全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。培養(yǎng)基成分:RPMI1640 (Gibco)、10% FBS(Gibco)、2mM 谷氨酸、100 μ g/mL 鏈霉素、10Ouni ts/mT,青霉素(Gibco)。細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。I小時(shí)后，換液，將未貼壁的其余細(xì)胞洗去，剩余的細(xì)胞即可用于實(shí)驗(yàn)。
2.熱致死細(xì)菌制備將E.coli置于37°C搖床，過夜培養(yǎng)，次日于3500rpm條件下，室溫離心5min，棄去上清，用PBS重懸，并于3500rpm條件下室溫離心5min，重復(fù)洗滌兩次，最終用PBS重懸。在95°C條件下，熱處理30min，置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.體外細(xì)胞因子和一氧化氮檢測體外分離的腹腔巨噬細(xì)胞，用熱滅活細(xì)菌處理24h后，取上清，用ELISA試劑盒(R&D)檢測細(xì)胞因子的濃度,Griess Reagent (碧云天公司)顯色反應(yīng)檢測細(xì)胞上清液中的NO濃度。4.體內(nèi)細(xì)胞因子檢測108E.coli腹腔注射小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，采集的血液于室溫放置2h;7000rpm條件下，4°C離心20分鐘，取上清，ELISA試劑盒R&D)檢測血清中細(xì)胞因子濃度。5.組織及細(xì)胞mRNA的抽提、反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR檢測基因表達(dá)用TRIZOL Reagent (Invitrogen)抽提細(xì)胞的總 RNA。DNase37°C處理提取的 RNA,30min,以除去殘余的DNA,加反應(yīng)停止液(stop solution) Invitrogen65°C處理IOmin,滅7舌 DNclSG ο

用oligo(dT)18 引物(Takara)和 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(promega)反轉(zhuǎn)成 cDNA。用Real-time System(Bio-Rad)定量檢測基因表達(dá)。用相對定量的方法，用iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)檢測基因的表達(dá)，并以beta-actin作為內(nèi)參。6.Western Blot檢測蛋白的表達(dá)用強(qiáng)RIPA裂解液來裂解細(xì)胞(碧云天公司)，裂解前加入蛋白酶抑制劑PMSF(Sigma)和Cocktail (Sigma)，所有的操作均在冰上進(jìn)行，蛋白保存于_80°C，并分裝蛋白，防止反復(fù)凍融。跑膠前加入上樣緩沖液，混勻，直接上樣，樣品不能加熱變性。10% SDSPAGE膠分
離蛋白。7.巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測分離的腹腔巨噬細(xì)胞，在不含抗生素的培養(yǎng)基中按照MOI = 10: I加入細(xì)菌(E.col1-GFP)，孵育45分鐘后，去上清，PBS洗滌3遍，將細(xì)胞從板上刮下，流式檢測綠色熒光。8.巨噬細(xì)胞殺菌功能檢測在重復(fù)的兩塊板上同時(shí)進(jìn)行，分離的腹腔巨噬細(xì)胞，在不含抗生素的培養(yǎng)基中按照MOI = 10: I加入細(xì)菌(E.col1-GFP)，孵育20分鐘后，去上清，PBS洗滌3遍。其中一塊板中的細(xì)胞被裂解，梯度稀釋，涂板37°C過夜，另一塊再孵育90分鐘，取上清后，裂解細(xì)胞，梯度稀釋，涂板37°C過夜。9.HJV敲除小鼠的構(gòu)建本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用通用和成熟的方法構(gòu)建HJV敲除小鼠，如文獻(xiàn)A mousemodel of juvenile hemochromatosis Franklin W.Huang, Jack L Pinkus，GeraldineS.PinkusiMark D.Fleming，Nancy C.Andrews J Clin Invest.2005 ；115(8):2187-2191所述。
實(shí)施例1HJV敲除小鼠對細(xì)菌易感性檢測為了探究HJV在免疫系統(tǒng)中的作用，本發(fā)明人用各種細(xì)菌(鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌)感染HJV敲除的小鼠。結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，HJV敲除的小鼠對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有易感性。與正常小鼠相比，從腹腔注射鼠傷寒沙門氏菌(108)、大腸桿菌(108)和金黃色葡萄球菌(I X IO8)都會導(dǎo)致HJV敲除小鼠的過早死亡。圖1a為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的易感性結(jié)果；圖1b為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對大腸桿菌的易感性結(jié)果；圖1c為正常小鼠和HJV敲除的小鼠對金黃色葡萄球菌的易感性結(jié)果。圖1a-圖1c的橫坐標(biāo)為注射時(shí)間，縱坐標(biāo)為小鼠的存活率(％ )。臟器蓄積結(jié)果表明。腹腔注射大腸桿菌，12h后，細(xì)菌在HJV敲除小鼠的腹腔及各主要臟器中蓄積增多(圖1d和圖1e)，圖1d為正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大腸桿菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖1e為正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要臟器中大腸桿菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果。該結(jié)果提示，HJV敲除的小鼠，其天然免疫實(shí)缺陷的，導(dǎo)致細(xì)菌在體內(nèi)過度增殖，最終使得HJV敲除的小鼠過早死亡。由于HJV敲除的小鼠機(jī)體內(nèi)鐵水平較高，有利于細(xì)菌生長，為了排除鐵代謝的影響，本發(fā)明人在低鐵處理的小鼠體內(nèi)進(jìn)行了細(xì)菌致死實(shí)驗(yàn)，當(dāng)?shù)丸F喂養(yǎng)的小鼠機(jī)體鐵水平和野生型一致(未列出)，在某些臟器中甚至更低時(shí)，HJV敲除小鼠依然易感(圖1f)。實(shí)施例2小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的變化體液免疫是天然免疫的重要組成部分之一，在機(jī)體發(fā)生感染后，細(xì)菌的入侵會誘發(fā)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞因子分泌增多，從而激活各種免疫細(xì)胞，清除入侵的細(xì)菌。將I X IO8的E.coli腹腔注射小鼠后，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼眶取血，室溫放置l-2h, 7000rpm條件下，4°C離心20min,取上清,用Elisa試劑盒檢測細(xì)胞因子濃度。結(jié)果表明(圖2)，與正常的感染細(xì)菌的小鼠相比，感染細(xì)菌后的HJV敲除小鼠體內(nèi)原炎癥因子TNFa和IL-6的血清濃度(圖2a&2b)比野生型小鼠高，IFNy的分泌減少(圖2c)，顯示IFNy的生成有缺陷，而它的兩個(gè)誘導(dǎo)因子IL-18和IL-12的分泌卻是正常的(圖 2d&2e)。為了控制定量的細(xì)菌數(shù)以及模擬體內(nèi)的刺激模式，在體外實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明人使用熱滅活細(xì)菌作為刺激源。結(jié)果表明，在熱滅活細(xì)菌的刺激下，巨噬細(xì)胞內(nèi)免疫調(diào)控通路的蛋白磷酸化水平發(fā)生了變化，IL-12誘導(dǎo)stat4的磷酸化水平降低，而IL-18誘導(dǎo)IFN Y的關(guān)鍵因子P38的磷酸化水平和正常組相似(圖2f)。圖2顯示細(xì)菌刺激后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的變化，IO8E.coli腹腔注射后，不同時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，ELISA 檢測細(xì)胞因子水平 a) TNF α (1.5h)、b) IL-6 (2.5h)、c) IFN y (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)細(xì)菌感染6h后，流式檢測細(xì)胞內(nèi)IFN γ表達(dá)水平，以及f)體外熱滅活菌刺激后，western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)信號通路的改變結(jié)果。實(shí)施例3IFNY分泌減少導(dǎo)致巨噬細(xì)胞殺傷功能減弱IFNy在免疫調(diào)控中的主要作用是激活巨噬細(xì)胞行使殺傷功能。將IO8的E.coli注射小鼠腹腔后，HJV敲除小 鼠的外周血內(nèi)細(xì)胞遷移增多，且比正常對照組高一倍(圖3a)。體外檢測巨噬細(xì)胞的吞噬功能，發(fā)現(xiàn)HJV敲除小鼠的巨噬細(xì)胞的吞噬功能也略有增強(qiáng)(圖3b)，而對外源細(xì)菌的殺傷功能變?nèi)?圖3c)。IFNy在早期主要由自然殺傷(NK)細(xì)胞分泌，作為IFNy響應(yīng)細(xì)胞的巨噬細(xì)胞也會自分泌，從而發(fā)生自激活。為了探究HJV敲除巨噬細(xì)胞殺傷功能減弱是不是由于IFNy的分泌減少，體外用熱滅活細(xì)菌刺激對照組和HJV敲除組的巨噬細(xì)胞，檢測結(jié)果顯示HJV敲除組的巨噬細(xì)胞自分泌IFNy的能力減弱(圖3d)，而其它原炎癥因子分泌正常(圖3e)。IFNy對于激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生抑菌因子具有非常重要的作用，和IFNy敲除小鼠相似，HJV敲除小鼠不能有效控制外源微生物在體內(nèi)過度增殖，和對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠死亡過早。熱滅活細(xì)菌刺激下，HJV敲除巨噬細(xì)胞內(nèi)IFN Y _stat4信號通路被削弱(圖3f)，其下游的重要的活性酶iNOS的表達(dá)減少，雖然通過p38的誘導(dǎo)通路沒有太多變化(圖3h)，但是也不能挽救抑菌因子NO分泌減少的狀況(圖3g)。這一結(jié)果解釋了巨噬細(xì)胞殺菌功能減弱的表型。圖3為與對照組小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后體內(nèi)細(xì)胞功能變化結(jié)果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血內(nèi)白細(xì)胞變化；b)體外細(xì)胞吞噬功能檢測；c)體外細(xì)胞殺菌功能檢測；d)熱滅活細(xì)菌體外刺激巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞因子IFN Y分泌；e)熱滅活細(xì)菌體外刺激巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞因子IL-6分泌；f ) western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)IFN Y _stat4信號通路的改變；g)體外巨噬細(xì)胞NO分泌檢測；h) western檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS和p38信號通路的改變。實(shí)施例4HJV在免疫調(diào)節(jié)對抗外源微生物的作用本發(fā)明人通過細(xì)胞膜表面分子標(biāo)記，免疫細(xì)胞流式分離檢測發(fā)現(xiàn)，HJV在免疫細(xì)胞中存在廣譜的較高水平表達(dá)(圖4a) ;HJV在肝細(xì)胞中的表達(dá)對于調(diào)控機(jī)體鐵代謝起到?jīng)Q定性作用，在炎癥刺激狀態(tài)下，肝臟中的HJV表達(dá)是下調(diào)的(圖4b);在炎癥條件下，HJV在巨曬細(xì)胞中的表達(dá)是上調(diào)的(圖4c);而鐵代謝中另一相關(guān)基因鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferroportin)在炎癥條件下，無論是肝臟還是巨噬細(xì)胞中均下調(diào)(圖4d&4e)。由于感染狀態(tài)下，HJV表達(dá)上調(diào)，本發(fā)明人在體外克隆HJV的質(zhì)粒，在Raw264.7細(xì)胞中過表達(dá)。結(jié)果顯示，在熱滅活細(xì)菌或細(xì)菌模式分子LPS的刺激下，過表達(dá)HJV的Raw264.7細(xì)胞比轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞表達(dá)更多的iNOS，分泌更多的N0(圖4f&4g)，由于Raw264.7含有內(nèi)源性的HJV表達(dá)，在熱滅活細(xì)菌的強(qiáng)刺激下，和轉(zhuǎn)染空載體的對照相比，過表達(dá)HJV的Raw264.7分泌NO的增加幅度不是很大，但也具有顯著性差異。圖4顯示HJV在免疫細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控模式；a)正常小鼠各種免疫細(xì)胞通過表面標(biāo)記通過流式分離，分別檢測細(xì)胞內(nèi)HJV的表達(dá)水平；在熱滅活細(xì)菌刺激下，野生型小鼠肝臟中HJV表達(dá)b)，巨噬細(xì)胞內(nèi)HJV表達(dá)c)，肝臟中FPN表達(dá)d)，巨噬細(xì)胞內(nèi)FPN表達(dá)e)，f&g)熱滅活細(xì)菌的刺激下，過表達(dá)HJV的Raw264.7細(xì)胞中iNOS的表達(dá)更多h)，也分泌更多NO。實(shí)施例5s-HJV蛋白增強(qiáng)HJV+小鼠抗感染能力HJV具有兩種亞型，定位于細(xì)胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s_HJV)。s_HJV和m-HJV在H印cidin的調(diào)控作用上相拮抗。將s-HJV克隆入pet28a載體中，在BL21(DE3)系統(tǒng)中表達(dá)，通過鎳柱、離子交換和分子篩分離純化。
圖5a顯示s-HJV的分子篩純化圖譜，總共分離得到7個(gè)主峰，分別收集檢測鑒定，其中5號峰得到分子量為32kD的s-HJV蛋白。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示重組表達(dá)的s-HJV具有下調(diào)h印cidin表達(dá)的生物學(xué)活性(圖5b)。將體外重組表達(dá)的可溶性HJV(s-HJV)預(yù)處理小鼠(腹腔注射生理鹽水或者s-HJV 7mg/kg) 2h后，腹腔注射鼠傷寒桿菌(3*106/只)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示s-HJV注射組存活時(shí)間延長(圖5c)。以上結(jié)果顯示s-HJV具有抗感染活性。討論鐵代謝和機(jī)體免疫一直以來息息相關(guān)，鐵代謝相關(guān)基因不僅通過調(diào)控機(jī)體鐵代謝和分布來參與機(jī)體免疫，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，它們本身對機(jī)體免疫也有調(diào)控作用。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，結(jié)果表明，HJV(HemojuveIin)敲除小鼠不能像正常小鼠一樣抵御外源微生物的感染，鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白作為一個(gè)重要的鐵代謝調(diào)控基因，其缺失不僅會導(dǎo)致鐵在機(jī)體內(nèi)的蓄積，而且導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷。為了排除機(jī)體鐵對于體內(nèi)細(xì)菌增殖的影響，本發(fā)明人用低鐵喂養(yǎng)HJV敲除小鼠，8周后，小鼠體內(nèi)鐵水平顯著低于正常小鼠機(jī)體鐵水平。進(jìn)行腹腔感染大腸桿菌的致死試驗(yàn)，結(jié)果顯示，機(jī)體內(nèi)過多的鐵增加了 HJV敲除小鼠對細(xì)菌的易感，但卻不是決定性因素。熱滅活細(xì)菌預(yù)處理小鼠得到的急性相血清抑菌試驗(yàn)顯示，和正常小鼠相比，HJV敲除小鼠的血清含有的抑菌因子的功能沒有缺陷，表明HJV敲除小鼠體內(nèi)較低水平的hepcidin，在感染后會有很高很快的回升，并不是直接導(dǎo)致HJV敲除小鼠易感的主要因素。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果都推向一個(gè)結(jié)論，HJV本身在機(jī)體免疫中行使重要的作用。腹腔注射活細(xì)菌，HJV敲除小鼠比正常小鼠死亡更多更快，而同等劑量熱滅活細(xì)菌卻不會導(dǎo)致這一表型，通過體內(nèi)增殖試驗(yàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在HJV敲除小鼠體內(nèi)增殖的更快，顯示HJV敲除小鼠存在免疫缺陷。通過感染后原炎癥因子的血清水平檢測發(fā)現(xiàn)，HJV敲除小鼠體內(nèi)的IL-6和TNF α的分泌不僅沒有減少，還略有增多，但是IFN Y的分泌是減少的，而它的兩個(gè)重要調(diào)控因子IL-18和IL-12的分泌卻是正常的，巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)分泌。體外檢測試驗(yàn)顯示HJV敲除的巨噬細(xì)胞完全不分泌IFN Y。通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)，IL-18誘導(dǎo)IFN Y的通路P38的磷酸化是正常的，而IL-12誘導(dǎo)stat4的磷酸化水平減弱。上述結(jié)果提示，HJV在IL-12誘導(dǎo)IFN Y分泌的途徑中起到重要作用。IFNy對于激活巨噬細(xì)胞起到非常重要的作用，而巨噬細(xì)胞在腹腔中大量存在，是腹腔感染的第一道防線，本發(fā)明人分別從遷移，吞噬和殺菌三個(gè)方面來檢驗(yàn)HJV敲除巨噬細(xì)胞的功能。感染后HJV敲除小鼠血液中的白細(xì)胞含量比正常小鼠要高一倍，體外實(shí)驗(yàn)顯示HJV敲除的巨噬細(xì)胞吞噬能力較正常巨噬細(xì)胞略高，但在殺菌功能上有缺陷。IFNy的分泌直接導(dǎo)致iNOS的合成及其產(chǎn)物NO的分泌，由于NO是巨噬細(xì)胞的重要抑菌因子之一，IFN Y誘導(dǎo)iNOS的信號通路關(guān)鍵因子statl的磷酸化水平也降低了，相應(yīng)的iNOS表達(dá)水平降低，NO分泌減少，巨噬細(xì)胞不能有效殺死細(xì)菌，從而導(dǎo)致細(xì)菌過度增殖。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱滅活細(xì)菌可以在體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)HJV表達(dá)水平的上調(diào)。而另一鐵代謝相關(guān)基因FPN的表達(dá)都是下調(diào)的，過表達(dá)HJV的Raw264.7細(xì)胞中會分泌更多的NO，由于熱滅活細(xì)菌的強(qiáng)刺激，Raw264.7細(xì)胞中本底的HJV表達(dá)也會上升，NO分泌已經(jīng)達(dá)到一個(gè)很高水平，過表達(dá)的細(xì)胞中只有小幅度的增加，但具有顯著性差異。因此本發(fā)明人的研究成果顯示，在感染狀態(tài)下，HJV在巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加，協(xié)助幾_12促進(jìn)正^^的生成，從而激活巨噬細(xì)胞，表達(dá)iNOS，分泌NO，充分行使殺菌功能。這樣HJV將鐵代謝和免疫調(diào)控緊密聯(lián)系在一起，作為一個(gè)免疫調(diào)控中的重要分子。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
權(quán)利要求
1.一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑的用途，其特征在于，用于制備免疫調(diào)節(jié)劑，或用于制備抗感染藥物組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑還用于: (B1)制備白介素IL-12的激動劑組合物；和/或 (bj促進(jìn)干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌；和/或 (C1)上調(diào)一氧化氮合酶活性；和/或 (Cl1)促進(jìn)一氧化氮NO的產(chǎn)生；和/或 G1)促進(jìn)免疫細(xì)胞的殺菌功能。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白選自下組: (A)氨基酸序列如SEQID NO:1、3、5、7任一所示的多肽； (B)將SEQID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白衍生物，或其活性片段。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白為s亞型(S-HJV)。
5.一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備下調(diào)白介素IL-12的活性的組合物，或用于制備白介素IL-12的拮抗劑組合物。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述組合物還用于: (a2)降低干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌；和/或 (b2)下調(diào)一氧化氮合酶活性；和/或 (C2)抑制一氧化氮NO的產(chǎn)生；和/或 (d2)抑制免疫細(xì)胞的殺菌功能。
7.一種鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白、或其激動劑、或其拮抗劑的用途，其特征在于，用于: (1)調(diào)節(jié)白介素IL-12的活性；和/或 (2)調(diào)節(jié)干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌；和/或 (3)調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性；和/或 (4)調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生；和/或 (5)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的殺菌功能。
8.一種方法，所述方法用于調(diào)節(jié)白介素IL-12活性、調(diào)節(jié)干擾素IFNy的產(chǎn)生和分泌、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性、調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的殺菌功能，其特征在于，所述方法包括步驟:改變鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)或活性；或添加鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的激動劑；或添加鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的拮抗劑。
9.一種篩選調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物的方法，其特征在于，包括步驟: (i)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性； ( )比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物。
10.一種篩選調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法，其中殺傷相關(guān)相關(guān)蛋白是干擾素IFNy或一氧化氮合酶，其特征在于，包括步驟: (a)在測試組中，在測試化合物存在情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性；并且在對照組中，在不存在測試化合物情況下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，并測定鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的水平或活性； (b)比較測試組和對照組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性，如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著高于對照組，則提示該物質(zhì)是上調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合物；如果測試組的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白水平或活性顯著低于對照組，則提示該物質(zhì)是下調(diào)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的化合 物。
全文摘要
本發(fā)明涉及鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白對機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用，具體地，鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或其激動劑可以用于制備免疫調(diào)節(jié)劑，或用于制備抗感染藥物或白介素IL-12的激動劑組合物；鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白拮抗劑用于制備下調(diào)白介素IL-12的活性的組合物或白介素IL-12的拮抗劑組合物，本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺菌功能的化合物的和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白水平或活性的化合物的方法。
文檔編號A61K45/00GK103169948SQ20111043604
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者王福俤, 沈媛媛, 陶云龍, 吳謙 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院