專利名稱：一種治療前列腺炎的組合藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合藥物及其制備方法，尤其涉及一種治療前列腺炎的組合藥物 及其制備方法。
背景技術(shù)：
前列腺炎是青壯年男性最常見的疾病之一，發(fā)病年齡一般為15 55歲。一般統(tǒng) 計約占泌尿科門診疾病的25% 30%，它可全無癥狀，也可以癥狀明顯，遷延不愈，甚至可 以引起持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的泌尿生殖系感染。根據(jù)患者的發(fā)病過程和臨床表現(xiàn)，可將前列腺 炎分為急性前列腺炎與慢性前列腺炎；根據(jù)尿4杯試驗結(jié)果，將前列腺炎分為急性細(xì)菌性 前列腺炎、慢性細(xì)菌性前列腺炎、慢性非細(xì)菌性前列腺炎和前列腺痛4類。臨床上治療前列 腺炎的常用方法是抗生素治療。但是，抗生素只對急性細(xì)菌性前列腺炎和慢性細(xì)菌性前列 腺炎有效。另外，濫用抗生素有很多危害，主要表現(xiàn)為三個方面(1)大量使用抗生素會帶 來較強毒副作用，直接傷害身體，尤其是對兒童聽力；(2)抗生素用多了會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥 性，使抗生素藥物效果變差，甚至無效；(3)抗生素用得過多過濫，會大量殺滅體內(nèi)正常細(xì) 菌，讓致病細(xì)菌乘虛而入。前列腺炎的病因及發(fā)病機理十分復(fù)雜，治療也較為棘手，目前還 沒有一個很好的治療手段，故世界衛(wèi)生組織將該病稱為“21世紀(jì)病”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中抗生素只對急性細(xì)菌性前列腺 炎和慢性細(xì)菌性前列腺炎有效和濫用抗生素有很多危害的缺陷，提供一種治療前列腺炎的 組合藥物及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明首先提供一種治療前列腺炎的組合藥物，所述組合藥物的有效活性成分為 人生長激素和人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明提供的治療前列腺炎的組合藥物還可以通過以下優(yōu)選的技術(shù)方案進(jìn)一步 實現(xiàn)所述人生長激素由包含下述步驟的方法制得(1)保藏號CGMCC No. 2031的重組桿狀病毒(該重組桿狀病毒為重組桿狀病毒 BmBachGH由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址為北京市海淀區(qū)中 關(guān)村北一條13號，保藏日期為2007年4月28日，保藏編號為CGMCC No. 2031，生物材料的 分類命名家蠶核型多角體病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)感染家蠶幼蟲或蠶 蛹；(2)收集感染的家蠶幼蟲或蠶蛹，粉碎，去除病毒粒子。所述人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子由包含下述步驟的方法制得(1)重組桿狀病毒BmBachGM-CSF感染家蠶幼蟲或蠶蛹；(2)收集感染的家蠶幼蟲或蠶蛹，粉碎，去除病毒粒子。
上述重組桿狀病毒BmBachGM-CSF的制備方法還可以進(jìn)一步參考發(fā)明專 利 ZL97124614. 1 與非專利文獻(xiàn)"Can 29 kDa rhGM-CSF expressed by Silkworm pupae bioreactorbring into effect as active cytokine through oralIy administration，，[european journal ofpharmaceutical sciences 28 (2006)212-223] 及"Expression,purification and characterizationof human GM-CSF using silkworm pupae(B ombyx mori)as a bioreactor，，[Journal ofBiotechnology 123 (2006)236-247] 所公開的技術(shù)內(nèi)容。所述家蠶幼蟲或蠶蛹在感染前，進(jìn)行表面消毒。本發(fā)明還提供了制備上述組合藥物的方法人生長激素和人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集 落刺激因子混合均勻。本發(fā)明提供的治療前列腺炎的組合藥物也可以通過以下優(yōu)選的技術(shù)方案實現(xiàn)，所 述組合藥物還加有輔料，有效活性成分在所述組合藥物中的含量為26μ g/100mg以上；所 述輔料由下述方法制得家蠶幼蟲或蠶蛹經(jīng)70%的食用酒精浸泡3min后，于-20 0°C下 粉碎勻漿，過100目網(wǎng)，600rpm離心30 60min后過濾，取上清液于_50°C下冷凍干燥成 粉。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了制備上述組合藥物的方法人生長激素、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集 落刺激因子和輔料混合均勻，填裝膠囊、包裝。本發(fā)明達(dá)到的技術(shù)效果本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種治療前列腺炎的組合藥物及其制備方 法，為前列腺炎的治療提供了一種新的藥物及其制備方法。動物實驗證明本發(fā)明提供的組 合藥物安全有效，可治療前列腺炎。本發(fā)明提供的所述組合藥物的制備方法具有簡單、容易 掌握的特點。生物保藏說明生物材料的分類命名家蠶核型多角體病毒；拉丁文學(xué)名Bombyx mori nucleopolyhedro virus ；保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏編號CGMCCNo. 2031 ；
保藏日期2007年4月28日；
保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。
具體實施例方式以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明包括但不限于以下實 施方式。下面所列具體實施例僅用于理解本發(fā)明的實質(zhì)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或公知常識對本發(fā) 明所進(jìn)行的不脫離本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容的改變，如組合藥物中兩種有效活性成分比例的改變或 者其含量的改變，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所采用的技術(shù)手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可依據(jù)《分子克隆》或其他技術(shù)手冊 而獲知。實施例1基因的擴增1.人生長激素hGH基因的擴增設(shè)計一對引物，以從重組質(zhì)粒PWR-hGH(上海生化所吳祥甫老師惠贈)為模板，PCR 擴增人生長激素hGH基因。
上游引物5，GGGAATTCAGATGGCTACAGGCTCCC3，(含 EcoR I 酶切位點)下游引物5，TTGAGCTCCTAGAAGCCACAGCTGCC3，(含 Sac I 酶切位點)。PCR 反應(yīng)條件94 "C，5min, (94 "C，Imin ；57 °C, Imin ；72 °C, lmin) X 30cycles ； 72°C, IOmin0擴增得到目的hGH基因片段。2.人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子hGM-CSF基因的擴增。從人胚肺細(xì)胞中抽提總RNA作為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增得到hGM_CSF的 cDNA，引物設(shè)計如下上游引物為GTAGAATTCATGGGACCAGGACAGGCCGT (含 EcoRI 位點)下游引物為TCAGAGCTCTCAACACACCTCCCCAGGCT(含 Sac I 位點)PCR 反應(yīng)條件94 "C，5min, (94 "C，Imin ；65 "C，Imin ；72 °C, lmin) X 30cycles ； 720C，IOmin0擴增得到目的hGM-CSF基因片段。實施例2構(gòu)建載體(1) · pAcHLT-hGH 載體構(gòu)建經(jīng)EcoR I與Sac I雙酶切的hGH基因片段通過T4DNA酶(MBI)連接克隆至經(jīng)EcoR I與Sac I雙酶切的pAcHLT-B桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(購自BD Biosciences Pharmingen)中， 使hGH基因置于多角體蛋白(p0lyhedrin，ph)基因啟動子控制之下，構(gòu)建pAcHLT-hGH載體 經(jīng)酶切分析以及測序鑒定基因序列正確。在家蠶表達(dá)體系中重組蛋白hGH以融合蛋白的形 式表達(dá)。(2). pAcHLT-hGM-CSF 載體構(gòu)建經(jīng)EcoR I與Sac I雙酶切的hGM-CSF基因通過T4DNA酶(MBI)連接克隆至經(jīng)EcoRI 與Sac I雙酶切的pUC18中，獲得pUC-hGM-CSF載體。同理，再將hGM-CSF連接到pAcHLT-B 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，獲得pAcHLT-hGM-CSF載體。實施例3重組桿狀病毒BmBachGH (即保藏號CGMCC No. 2031的重組桿狀病毒)與含 hGM-CSF基因的家蠶重組桿狀病毒BmBachGM-CSF的獲得取5 μ 1重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcHLT-hGH DNA和6 μ 1經(jīng)線性化病毒BmBacPAK6DNA (購自 上海生化細(xì)胞所)，加入100 μ 1無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBC0BRL公司)混均。取6 μ 1 Dosper (寶靈曼公司)加入100 μ 1無血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將事先培養(yǎng)在35mm平 皿中的BmN細(xì)胞(購自上海生化細(xì)胞所)用無血清的TC-100培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入 pAcHLT-hGH轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Dosper混合物，27°C培養(yǎng)4_5天，收取上清進(jìn)行第一輪噬斑篩選。 取5 μ 1上清感染35mm平皿中的Bm N細(xì)胞，1小時后棄去上清加入等量混合的TC-100培養(yǎng) 基和低熔點瓊脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN細(xì)胞3-4天，保存上清，細(xì)胞用NaOH裂解 用于Southern blot斑點雜交，以hGH基因作模板用隨機引物探針標(biāo)記試劑盒(寶靈曼公 司)標(biāo)記探針，雜交方法按照《分子克隆》(科學(xué)出版社，1995)。取陽性克隆的上清進(jìn)行第 二輪噬斑篩選。取陽性克隆的上清感染家蠶細(xì)胞擴增。即可得到大量的含hGH基因的重組 桿狀病毒BmBachGH(該重組桿狀病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心保藏，保藏日期為2007年4月28日，保藏編號為CGMCC No. 2031)。該病毒能感染家蠶 細(xì)胞，在顯微鏡下細(xì)胞呈發(fā)病狀。家蠶重組桿狀病毒BmBachGM-CSF的制備方法同上，也可以進(jìn)一步參考發(fā)明專利 ZL97124614. 1 與非專利文獻(xiàn)“Can 29 kDa rhGM-CSF expressed by Silkworm pupae bioreactorbring into effect as active cytokine through oralIy administration，，[european journal ofpharmaceutical sciences 28 (2006)212-223] 及“Expression，purification and characterizationof human GM-CSF using silkworm pupae (B ombyx mori) as a bioreactor，，[Journal ofBiotechnology 123 (2006) 236-247] 所公開的技術(shù)內(nèi)容。實施例4重組hGH與hGM-CSF融合蛋白分別在家蠶5齡幼蟲和蛹中表達(dá)約106PFU重組病毒通過接種針感染每條五齡蠶，接種后約120h幼蟲或蛹幾乎全 部發(fā)病，采取蠶體液和蛹體，經(jīng)高速離心(12000rpm，30min)，取上清測血淋巴中hGH融合蛋 白的表達(dá)。蛋白樣品于15% SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離。結(jié)果在感染重組病毒的血淋巴樣 品在約27KDa處有一明顯條帶，大小與hGH融合蛋白的理論值相當(dāng)，而且在感染野生病毒的 蛋白樣品中并不存在這一條帶。為了驗證這一特異性蛋白是否可以與hGH抗血清發(fā)生特異 性免疫反應(yīng)，我們進(jìn)行了 Western blot印跡反應(yīng)。結(jié)果證明該蛋白條帶可以與hGH抗血清 發(fā)生特異性反應(yīng)，由此可以判斷該蛋白為重組hGH融合蛋白。同樣的方法，檢測到hGM-CSF的表達(dá)。實施例5重組hGH與hGM-CSF融合蛋白生物活性測定(l).hGH的活性測定。hGH標(biāo)準(zhǔn)品(購自浙江邵逸夫醫(yī)院)被配制成自2. 5 μ g/ml 至62ng/ml —系列濃度的溶液，參照《分子克隆》進(jìn)行ELISA檢測。4°C過夜的條件下蛋白 樣品被包被到96孔上，PBST (PBS中加入Tween 20)洗滌后用含BSA(胎牛血清蛋 白)的PBS溶液封閉，37°C lh;hGH抗血清1 3000稀釋，與包被蛋白37°C孵育2h ;PBST 溶液洗滌3次，每次5-lOmin ；加入1 2000稀釋的二抗(兔抗hGH抗血清，購自sigma公 司)37°C孵育Ih ；OPD檸檬酸鈉緩沖液顯色后測0D492，并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線表示蛋白濃 度與吸光度的關(guān)系。細(xì)胞表達(dá)蛋白樣品與蠶血淋巴在同樣的條件下進(jìn)行ELISA，分別測得 0D492值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算樣品中hGH融合蛋白的含量和效價。在蠶蛹感染120h后， 每個蛹體hGH融合蛋白的平均含量可達(dá)到0.5mg，活性大于lX107IU/ml。而常規(guī)的原核表 達(dá)，其表達(dá)量是0. 05-0. 3mg/ml菌液。(2). hGM-CSF活性測定。TF-1細(xì)胞是hGM-CSF依賴性細(xì)胞株，hGM-CSF對TF-I細(xì) 胞增殖曲線的影響與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，噻唑藍(lán)MTT比色法是一種定量檢測活細(xì) 胞的方法，用TF-I細(xì)胞結(jié)合MTT比色法可檢測樣品中hGM-CSF的生物活性。先將實驗所用溶液預(yù)熱至37°C。制備細(xì)胞懸液取足量TF-I細(xì)胞培養(yǎng)物，2000rpm/min離心5分鐘，收集細(xì)胞。 用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(1640培養(yǎng)液添加10%小牛血清FBS (ν/ν)，每升補加2ml巰基乙醇溶液、 IOml丙酮酸鈉溶液、IOml谷氨酰胺溶液)洗滌細(xì)胞三次，每次均以2000rpm/min離心5分 鐘，收集細(xì)胞。最后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置37°C條件下5分鐘，再用基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成 4.0X105/ml的細(xì)胞懸液，置37°C備用。制備標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液取1支標(biāo)準(zhǔn)品(購自Schering Plough公司)配成1000IU/ ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將標(biāo)準(zhǔn)品溶液在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上稀釋至40IU/ml，稱該
6溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。每100倍稀釋應(yīng)分解為5X5X4的步驟，100倍以內(nèi)的稀釋應(yīng)逐步進(jìn) 行2倍或4倍稀釋。稀釋過程使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，單倍體積為50 μ 1。制備樣本溶液精密稱取IOmg重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子凍干粉，加 無菌水20ml混勻，4°C冰箱放置lhr，4000rpm/min離心。取上清用0. 22 μ m的濾膜過濾，收 集濾液。根據(jù)估計生物活性，取濾液在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上稀釋至約40IU/ml，稀釋原則同標(biāo) 準(zhǔn)樣品溶液。該稀釋液稱為樣本溶液。制備樣本梯度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，B-G行除第一列各孔外，每孔中加入50μ 1 基礎(chǔ)培養(yǎng)液；A行每孔加入50 μ 1基礎(chǔ)培養(yǎng)液；H行每孔加入50 μ 1完全培養(yǎng)液。在Dl、El 各孔中每孔加入100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，在Bi、Cl ；FUHl各孔中每孔加入100 μ 1各待檢樣 本溶液，每個待檢樣品做2個復(fù)孔。自第一列至第12列作對倍稀釋，每孔留50 μ 1余液。加入細(xì)胞懸液并培養(yǎng)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一無菌的貯液槽中，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 的每個孔加入50 μ 1細(xì)胞懸液。注意經(jīng)?；靹蛸A液槽中細(xì)胞懸液，防止因細(xì)胞下沉引起分 布不勻。37°C、5% C02條件下培養(yǎng)40-48小時。加入MTT溶液并培養(yǎng)每孔加入20 μ 1 MTT溶液，37°C，5% C02條件下培養(yǎng)5小 時。加入裂解液并測定結(jié)果每孔加入100 μ 1裂解液，用8通道200 μ 1微量移液器吹 打混勻，使生色物質(zhì)充分溶解，注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。在酶標(biāo)儀上比色，測定波長570nm， 參比波長630nm，記錄測定結(jié)果。實驗結(jié)果用計算機程序或直線回歸計算法進(jìn)行處理。分別計算各實驗樣品的半效 稀釋倍數(shù)，即從樣本溶液至相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品50%最大效應(yīng)點的稀釋倍數(shù)，并按下式計算實驗 結(jié)果
脅烊口六“八疒》口六“八待檢樣品半效稀釋倍數(shù)待檢樣品預(yù)稀釋倍數(shù) 待檢樣品效價=標(biāo)準(zhǔn)品效價X H □x H 口 ^^.^Ll^rm,
標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)實施例6高效表達(dá)人生長激素的蠶蛹研制成口服藥物并進(jìn)行動物實驗蠶蛹在接種BmBachGH前經(jīng)70%食用酒精浸泡3min，進(jìn)行表面消毒。感染5_7 天，收集蠶蛹，-20°C凍存。取適量凍存蠶蛹樣品，用二級膠體磨粉碎并通過100目網(wǎng)離心 (600rpm, IOmin)過濾。取過濾后的勻漿液，12000rpm離心20_60min，取上清，再30000rpm離 心30-90min，去除病毒粒子，離心結(jié)束后，取上清，真空冷凍干燥機中冷凍干燥(_50 V )， 制成凍干粉。輔料制造正常9日齡蠶蛹，用70%食用酒精浸泡3分鐘進(jìn)行表面消毒。經(jīng)低溫 (O -20°C )粉碎勻漿，過100目網(wǎng)篩(600rpmX30min)，取上清液冷凍干燥(凍干條件與 hGH相同)。凍干粉留樣檢定，其余冷藏于4°C，檢定合格后作為輔料。根據(jù)hGH含量，按比例加入輔料使hGH含量在13 μ g/100mg以上。充分混勻后填 裝膠囊，包裝后為成品。以下動物實驗，劑量均是hGH的實際含量計算的。實驗動物獼猴(Macaca mulatta)由福建省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所非人靈長 類實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證(生產(chǎn)獼猴)閩實動質(zhì)準(zhǔn)第12號。獼猴16只，體 重3. 6 5. 8kg，雌雄各半，隨機分為4組，重組人的生長激素(hGH)低、中、高三個劑量組分別100-300 μ g、400-800 μ g、1100-1300 μ g/kg/d，另設(shè)蒸餾水作溶劑對照組，采用鼻飼灌
胃給藥，連續(xù)給藥52天，剖殺一半動物(雌雄各半)，其余動物停藥30天作恢復(fù)期觀察，分 別對給藥期和恢復(fù)期各劑量組獼猴體重、進(jìn)食量、呼吸、血壓、心電圖、血液學(xué)、尿液、血液生 化學(xué)、臟器系數(shù)等各項指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，各用藥組上述檢測指標(biāo)與用藥前比較均未 見明顯異常。對各組獼猴主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)有毒理意義的組織學(xué)改變。 獼猴灌胃給予重組人的生長激素(hGH)高劑量組，連續(xù)52天，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，多項檢 測均屬正常。長毒實驗結(jié)果顯示，SD大鼠灌胃給藥重組人的生長激素膠囊1250 μ g/kg/d，連續(xù) 60天，毒性反應(yīng)為血糖含量明顯增高，停藥30天恢復(fù)正常水平，毒性反應(yīng)系可逆性。大鼠灌 胃給藥重組人的生長激素膠囊無毒副反應(yīng)的安全劑量為250 μ g/kg/d以下。急毒結(jié)果顯示 重組hGH對NIH小鼠和SD大鼠經(jīng)灌胃給藥的最大耐受量均大于3300 μ g/kg。實施例7高效表達(dá)人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子的蠶蛹研制成口服藥物并進(jìn)行動物 實驗蠶蛹在接種BmBachGM-CSF前經(jīng)70%食用酒精浸泡3min，進(jìn)行表面消毒。感染5_7 天，收集蠶蛹，-20°C凍存。取適量凍存蠶蛹樣品，用二級膠體磨粉碎并通過100目網(wǎng)離心 (600rpm, IOmin)過濾。取過濾后的勻漿液，12000rpm離心20_60min，取上清，再30000rpm 離心30-90min，去除病毒粒子，離心結(jié)束后，取上清，真空冷凍干燥機中冷凍干燥(_50°C )， 制成凍干粉。輔料的制備方法同實施例6中輔料的制備方法。根據(jù)hGM-CSF含量，按比例加入輔料使hGM_CSF含量在13 μ g/IOOmg以上。充分 混勻后填裝膠囊，包裝后為成品。以下動物實驗，劑量均是hGM-CSF的實際含量計算的。動物實驗選取獼猴16只，體重3. 6 5. 8kg，隨機分為4組，每組雌雄各半， 設(shè)重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊低、中、高三個劑量組分別600 μ g/kg/d、 1800 μ g/kg/d,3600 μ g/kg/d，另設(shè)蒸餾水作溶劑對照組，連續(xù)給藥60天，剖殺一半動物 (雌雄各半)，其余動物停藥30天作恢復(fù)期觀察，分別對給藥期和恢復(fù)期各劑量組獼猴體 重、進(jìn)食量、呼吸、血壓、心電圖、血液學(xué)、尿液、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)等各項指標(biāo)進(jìn)行檢測， 結(jié)果表明，各用藥組上述檢測指標(biāo)與用藥前比較均未見明顯異常。對各組獼猴主要臟器進(jìn) 行病理組織學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)有毒理意義的組織學(xué)改變。獼猴灌胃給予重組人粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞集落刺激因子膠囊高劑量3600 μ g/kg/d,連續(xù)60天，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，多項檢測 均屬正常，故可認(rèn)為重組人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊3600 μ g/kg/d為獼猴的基 本安全劑量。以NIH小鼠和SD大鼠為受試動物觀察重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠 囊的急性毒性反應(yīng)。測定兩種動物經(jīng)灌胃給重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊的 最大劑量均為大于3300 μ g/mg，腹腔注射給重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊對 NIH 小鼠的 LD50 及 95%可信限=2. 02(1. 80 2. 25) X 1000 μ g/kg，對 SD 大鼠的 LD50 及 95%可信限=3. 66(3. 20X4. 14) X 1000 μ g/kg。在對SD大鼠長期毒性試驗中，各給藥組SD大鼠的白細(xì)胞總數(shù)，紅細(xì)胞計數(shù)，血紅 蛋白含量、紅細(xì)胞比積、血小板計數(shù)及凝血時間等的測定值均在正常范圍波動，系統(tǒng)尸檢、臟器學(xué)數(shù)檢查及組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)雌雄大鼠的異常變化，停藥恢復(fù)期的各項檢查亦在 正常范圍。在生殖毒性試驗中，一般生殖毒性試驗未見重組人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因 子膠囊對母鼠受孕率和雄鼠授精功能的明顯影響，給藥組著床率、平均活胎數(shù)、呼吸胎率與 生理鹽水對照組相比無顯著差異。大鼠致畸敏感期毒性試驗表明，重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子膠囊對孕鼠沒有毒性和致畸潛力，孕鼠給藥后精神狀況、食量、黃體數(shù)、胚 胎植入數(shù)、活胎數(shù)、活胎體重等與生理鹽水組相比均無明顯差異，胎仔外觀檢查未見畸形， 胚胎顱骨、軀干骨、四肢骨等的骨化與生理鹽水組比較亦無明顯差異。對小鼠圍產(chǎn)期毒性試 驗研究表明，重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊對母鼠和Fl代母鼠沒有圍產(chǎn)期毒 性，給藥組未見妊娠期母鼠的異常癥狀，仔鼠發(fā)育指標(biāo)和感覺運動協(xié)調(diào)功能均屬正常，雄仔 鼠的交配能力、雌仔鼠的妊娠率等生殖相關(guān)指標(biāo)亦正常。采用動物骨髓微核試驗、Ames實驗和CHL染色體畸變試驗研究了重組人粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊的遺傳毒性。動物骨髓微核試驗顯著性檢驗結(jié)果說明重組 人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子膠囊無致突變作用。Ames實驗采用平皿摻入法，使用四 種標(biāo)準(zhǔn)突變型菌株測定，結(jié)果為陰性。CHL染色體畸變試驗結(jié)果亦為陰性。實施例8 hGM-CSF和hGH組合藥物治療前列腺炎組合藥物hGM_CSF與hGH 1 1混勻后，按比例加入輔料，有效成分達(dá) 26μ g/100mg 以上。實驗動物前列腺炎模型大鼠24只，雄性，250 300g/只，按體重隨機均分成4 組，分別為模型對照組，hGM-CSF和hGH組合藥物高中低(5g/kg、3g/kg、0. 5g/kg)三個組。 每天定時給藥一次，連續(xù)給藥5天。末次給藥1小時后，稱重，并將大鼠置于密封的裝有干 冰的箱子中，幾分鐘后大鼠死亡，進(jìn)行無菌解剖，取前列腺液10μ 1，放入Iml白細(xì)胞稀釋液 中，混勻后取1 μ 1鏡檢白細(xì)胞數(shù)，鏡下隨機觀察15個視野取平均數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照 組相比，給藥組能在不同程度上減輕白細(xì)胞的浸潤，高劑量組作用最明顯(見表一)。表一組合藥物對大鼠前列腺液白細(xì)胞數(shù)的影響
組別白細(xì)胞數(shù)(XIO9/L)模型對照組0. 41 士 0. 07低劑量組0. 35 士 0. 08中劑量組0. 32 士 0. 09高劑量組0. 30 士 0. 06無菌操作取下前列腺，稱重，計算前列腺指數(shù)[=(前列腺重/體重)Χ100% ]， 見表二。前列腺10%甲醛固定后進(jìn)行病理學(xué)檢查，模型組切片腺體內(nèi)結(jié)構(gòu)明顯破壞，間 質(zhì)水腫及增生，有大量炎細(xì)胞；給藥組切片腺體存在破壞，較模型組輕，有炎癥反應(yīng)，以水 腫、增生為特征，各組破壞程度與劑量呈正相關(guān)。表二 組合藥物對大鼠前列腺炎體重及前列腺指數(shù)的影響
組別給藥前給藥后模型對照組273. 9 士 15. 6250. 6 士 41. 2
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權(quán)利要求
一種治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述組合藥物的有效活性成分為人生長激素和人粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述人生長激素由 包含下述步驟的方法制得(1)保藏號CGMCCNo. 2031的重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲或蠶蛹；(2)收集感染的家蠶幼蟲或蠶蛹，粉碎，去除病毒粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述家蠶幼蟲或蠶 蛹在感染前，進(jìn)行表面消毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述人粒細(xì)胞_巨 噬細(xì)胞集落刺激因子由包含下述步驟的方法制得(1)重組桿狀病毒BmBachGM-CSF感染家蠶幼蟲或蠶蛹；(2)收集感染的家蠶幼蟲或蠶蛹，粉碎，去除病毒粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述家蠶幼蟲或蠶 蛹在感染前，進(jìn)行表面消毒。
6.制備權(quán)利要求1 5所述的治療前列腺炎的組合藥物的方法，其特征在于所述人 生長激素和人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述組合藥物還加 有輔料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述組合藥物的有 效活性成分在所述組合藥物中的含量為26μ g/100mg以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療前列腺炎的組合藥物，其特征在于所述輔料由下述方 法制得家蠶幼蟲或蠶蛹經(jīng)70%的食用酒精浸泡3min后，于-20 0°C下粉碎勻漿，過100 目網(wǎng)，600rpm離心30 60min后過濾，取上清液于_50°C下冷凍干燥成粉即可。
10.制備權(quán)利要求7 9所述的組合藥物的方法，其特征在于人生長激素、人粒細(xì) 胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子和輔料混合均勻，填裝膠囊、包裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中抗生素只對急性細(xì)菌性前列腺炎和慢性細(xì)菌性前列腺炎有效和濫用抗生素有很多危害的缺陷，本發(fā)明公開了一種治療前列腺炎的組合藥物及其制備方法。所述組合藥物的有效活性成分為人生長激素和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，還可以再加入輔料。本發(fā)明還提供了所述組合藥物的制備方法。所述組合藥物經(jīng)動物試驗證明安全有效，可治療前列腺炎。
文檔編號A61P13/08GK101954068SQ20091011976
公開日2011年1月26日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者張耀洲 申請人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司