專利名稱：包含顆粒佐劑和免疫增強劑組合的流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用佐劑配制疫苗來提供保護以抵御流感病毒感染的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
除了希龍疫苗公司(Chiron Vaccines)的FLUAD 產(chǎn)品利用MF59水包油乳液佐劑 外[1]，目前常規(guī)使用的流感疫苗不包含佐劑。參考文獻2的第17和18章詳細描述了這些疫苗。它們基于活病毒或滅活的病毒，滅活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解”病毒或純化的表面抗原(包括血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。血凝素(HA)是滅活流感疫苗的主要免疫原，參考HA水平標準化疫苗劑量，疫苗通常含有約15 μ gHA/毒株。流感爆發(fā)期需要大量流感疫苗，但難以增加疫苗供應從而滿足巨大的需求。因此，除了生產(chǎn)更多疫苗抗原，有人提出可以使用較低含量的抗原/毒株，同時使用佐劑來彌補減少的抗原劑量。還有人提出在流行間期采用相同的方案，從而例如能覆蓋更多人群而無需提聞生廣水平。有人提示可用不可溶的顆粒佐劑[3]，例如鋁鹽[4-7]或微粒[8]改進流感疫苗。雖然這些佐劑配制的疫苗是有用的，但仍有提高的空間。因此，本發(fā)明的目的是提供佐劑配制的其它改進流感疫苗(對于流行期和流行間期使用)和它們的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有不可溶顆粒佐劑的流感疫苗能引發(fā)IgG應答，主要是TH2應答(IgGl)。通過在組合物中加入免疫增強劑可將該應答改變?yōu)門Hl應答(IgG2a)。據(jù)報道，THl型應答[9]能提高針對流感病毒的異源亞型(heterosubtypic)免疫力。有利的是，還發(fā)現(xiàn)免疫增強劑能提高血凝素滴度和抗-血凝素ELISA滴度。因此，本發(fā)明提供包含⑴流感病毒抗原；(ii)不可溶的顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供制備免疫原性組合物的方法，其包括混合(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶的顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑的步驟。本發(fā)明提供裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含不可溶顆粒佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一和第二組分包含免疫增強劑，或(b)所述試劑盒裝有包含免疫增強劑的第三試劑盒組分。流感病毒抗原本發(fā)明組合物包含流感病毒抗原。通常可從流感病毒顆粒制備這些抗原，或者可在重組宿主(例如，利用桿狀病毒載體的昆蟲細胞)中表達諸如血凝素等抗原并以純化形式使用[10、11]。然而,抗原一般來自病毒顆粒。
抗原可采用活病毒，或者更優(yōu)選滅活病毒的形式。滅活病毒的化學方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理洗滌劑、甲醛、福爾馬林、β_丙內(nèi)酯或紫外光。滅活的其它化學方法包括用亞甲基藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它們?nèi)魏蔚慕M合處理。本領(lǐng)域知道滅活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙?；蚁﹣啺坊験射線。INFLEXAL 產(chǎn)品是完整的病毒顆粒滅活疫苗。如果使用滅活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原(包含血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶)?？赏ㄟ^各種方法 從含病毒的液體收集病毒顆粒。例如，純化方法可包括利用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有洗滌劑以使病毒顆粒破裂。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用洗滌劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、Tergitol NP9，等等)處理病毒顆粒，包括“吐溫-醚”裂解方法來產(chǎn)生亞病毒顆粒制品，從而獲得了裂解病毒。本領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻12-17等。通常利用破裂濃度(disrupting concentration)的裂解劑(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來進行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分溶解，從而改變了病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面活性劑，例如烷基糖苷、烷基硫苷、?；恰⒒腔鸩藟A、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N- 二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蘧基三甲基銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解發(fā)生在最初的病毒顆粒純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒顆粒的物質(zhì)澄清(以除去非病毒顆粒物質(zhì))，濃縮收集的病毒顆粒(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分離完整病毒顆粒與非病毒顆粒物質(zhì)，在密度梯度離心步驟中利用裂解劑裂解病毒顆粒(例如，利用含有裂解劑，如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度(溶液))，然后過濾(例如，超濾)以除去不需要的物質(zhì)?？蓪⒘呀獾牟《绢w粒有用地重懸在磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和 FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗(split vaccine)。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領(lǐng)域熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是亞單位疫苗。流感抗原還可以病毒體形式存在[18]。流感病毒可以是減毒的。流感病毒可以對溫度敏感。流感病毒可以是冷適應的。這三種可能性特別適用于活病毒。用于疫苗中的流感病毒毒 株每季不同。在目前的流行間期，疫苗通常包含兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價疫苗。本發(fā)明還可利用流行毒株(即，對疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亞型毒株(特別是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是單價疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三價疫苗為基礎(chǔ)。然而，取決于季節(jié)和疫苗所含抗原的性質(zhì)，本發(fā)明可起保護作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒血凝素亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本發(fā)明可起保護作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒NA 亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9?？捎杏玫匕诮M合物中的其它毒株是耐受抗病毒治療的毒株(例如，耐受奧塞米韋[19]和/或扎那米韋)的毒株，包括耐藥性流行毒株[20]。本發(fā)明的佐劑配制的組合物特別可用于免疫接種以抵御流行毒株。能導致流行病爆發(fā)的流感毒株的特征在于(a)與目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出現(xiàn)超過10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中見到的毒株(例如，通常只在鳥群中發(fā)現(xiàn)的H5、H6或H9)，從而使得人群對該毒株的血凝素而言在免疫學上是原初的；(b)其能在人群中水平轉(zhuǎn)移；和(c)其對人具有致病性。對于免疫接種抵御流行性流感，優(yōu)選具有H5血凝素類型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、 H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出現(xiàn)的流行毒株。在H5亞型內(nèi)，病毒可能屬于HA進化枝I、HA進化枝I’、HA進化枝2或HA進化枝3 [21]，其中進化枝I和3特別相關(guān)。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(例如，1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多種流感毒株，通常分別培養(yǎng)不同的毒株，收集病毒后混合來制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合多種流感毒株的抗原的步驟。流感病毒可以是重配毒株，可通過反向遺傳學技術(shù)獲得。反向遺傳學技術(shù)[例如，22-26]能利用質(zhì)粒在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)通常涉及表達(a)例如能從poll啟動子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能從polll啟動子編碼病毒蛋白質(zhì)的DNA分子，從而使得在細胞中表達兩種類型的DNA能裝配完整的感染性病毒顆粒。DNA優(yōu)選能提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，但也可能利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質(zhì)中的一些。優(yōu)選質(zhì)粒方法，從而能用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA [27-29]，這些方法還包括利用質(zhì)粒來表達所有病毒蛋白質(zhì)或其中一些(例如，PB1、PB2、PA和NP蛋白質(zhì))，一些方法利用了 12種質(zhì)粒。為減少所需的質(zhì)粒數(shù)，最近的方法[30]在同一質(zhì)粒上組合了多個RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(對于病毒RNA合成)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質(zhì)粒上組合了含RNA聚合酶II啟動子的多個蛋白質(zhì)編碼區(qū)(例如，編碼I、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻30所述方法的優(yōu)選方面包括(a) —個質(zhì)粒上的PBl、PB2和PA mRNA編碼區(qū)；和(b) 一個質(zhì)粒上的所有8個vRNA編碼區(qū)段。包含一個質(zhì)粒上的NA和HA區(qū)段和另一質(zhì)粒上的6個其它區(qū)段也是有利的。除了用poll啟動子編碼病毒RNA區(qū)段，還可能用細菌噬菌體聚合酶啟動子[31]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。由于poll啟動子的種類特異性，細菌噬菌體聚合酶啟動子對于許多細胞類型(例如，MDCK)更方便，雖然還必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。其它技術(shù)可能采用雙重poll和polll啟動子來同時編碼一個模板的病毒RNA和可表達的mRNA [32、33]。因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一個或多個RNA區(qū)段(通常是A/PR/8/34的6個區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6:2重配株)，特別是用卵培養(yǎng)病毒時。還可包含用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一個或多個RNA區(qū)段。通常，本發(fā)明保護抵御能人向人傳播的毒株，因此毒株的基因組一般包含源自哺乳動物(例如人)流感病毒的至少一個RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。可用卵(通常是SPF卵)或細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)用作抗原來源的病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標準方法利用含胚的雞蛋以及從雞蛋內(nèi)含物(尿囊液)中純化病毒。然而，近年來用動物細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)病毒，出于速度和患者變態(tài)反應的原因，優(yōu)選該培養(yǎng)方法。如果采用雞蛋培養(yǎng)病毒，貝1J可將病毒與一種或多種氨基酸一起引入雞蛋的尿囊液中[15]。細胞物質(zhì)通常是哺乳動物細胞系。合適的哺乳動物細胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)和犬細胞?？衫酶鞣N細胞類型，例如腎細胞、成纖維細胞、視網(wǎng)膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的例子是名為BHK21或HKCC的細胞系。合適的猴細胞是，例如非洲綠猴細胞，例如VeiO細胞系中的腎細胞。合適的犬細胞是，例如MDCK細胞系中的腎細胞。因此，合適的細胞系包括但不限于MDCK ；CH0 ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ；WI-38 ;等等。用于培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)選哺乳動物細胞系包括源自馬-達二氏犬腎的MDCK細胞[34-37];源自非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)腎臟的Vero細胞[38-40];或源自人胚胎成視網(wǎng)膜細胞的PER. C6細胞[41]。這些細胞系可廣泛購自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC) [42]、寇里爾細胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [43]或歐洲細胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目錄號為CCL-81、CCL-81. 2、CRL_1586和CRL-1587的各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-34的MDCK細胞。PER. C6可以保藏號96022940購自ECACC0作為哺乳動物細胞系的次選替代，可用禽細胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻44-46]，包括源自鴨(例如，鴨視網(wǎng)膜)或母雞的細胞系，例如雞胚胎干細胞(CEF)，等等。離子包括禽胚胎干細胞[44、47]，包括源自雞胚胎干細胞的EBx細胞系、EB45、EB14和EB14-074 [48]。如果利用哺乳動物細胞系培養(yǎng)病毒，則組合物優(yōu)選不含卵蛋白質(zhì)(例如，卵白蛋白和卵類黏蛋白)和雞DNA，從而能降低變應原性。培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細胞系是MDCK細胞系。原始MDCK細胞系可以CCL-34購自ATCC，但也可使用該細胞系的衍生物。例如，參考文獻34披露了適應于在懸浮培養(yǎng)基中生長的MDCK細胞系(“MDCK 33016”，以DSMACC2219保藏)。類似地，參考文獻49披露了生長在無血清培養(yǎng)懸液中的MDCK衍生細胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。參考文獻 50 披露了非致瘤性 MDCK 細胞，包括“MDCK-S” (ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101” (ATCCPTA-6501)、“MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。參考文獻 51 披露了對感染高度敏感的MDCK細胞系，包括“MDCK. 5F1”細胞(ATCC CRL-12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細胞系。如果用細胞系培養(yǎng)病毒，則生長培養(yǎng)基以及用于啟動培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu)選不含(即，經(jīng)測試得到污染的陰性結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細小病毒[52]。特別優(yōu)選不含單純皰疹病毒。如果用細胞系培養(yǎng)病毒，則每劑組合物優(yōu)選含有少于IOng (優(yōu)選少于lng，更優(yōu)選少于IOOpg)的殘留宿主細胞DNA，雖然可以存在痕量的宿主細胞DNA?？傊?，本發(fā)明組合物中的宿主細胞DNA不能長于IOObp?，F(xiàn)在，檢測殘留的宿主細胞DNA是生物制品的常規(guī)要求，屬于技術(shù)人員的普通能力。用于檢測DNA的試驗通常是確認試驗[53、54]?？衫脭?shù)學和可定量的術(shù)語描述確認試驗的性能特征，已鑒定了其可能的誤差來源。已總體上檢驗了該試驗的諸如準確度、精密度、特異性等特征。一旦校驗(例如，用已知標準量的宿主細胞DNA)及檢驗好某試驗，可常規(guī)進行定量DNA檢測?？刹捎萌N主要的DNA定量技術(shù)雜交方法,例如Sourthern印跡或槽印跡[55];免疫測定方法，例如Threshold 系統(tǒng)[56];和定量PCR[57]。技術(shù)人員熟知這些方法，雖然各方法的精確特征取決于所研究的宿主細胞，例如雜交探針的選擇，擴增用引物和/或探針的選擇，等等。分子裝置公司(Molecular Devices)的Threshold 系統(tǒng)是用于皮克水平總DNA的定量試驗，其已用于監(jiān)測生物藥品中的污染DNA水平[56]。典型的試驗包括在生物素化的ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗-ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應復合物。所有試驗組分均裝入購自生產(chǎn)商的完整的總DNA測定試劑盒(TotalDNA Assay Kit)中。各種商品化生產(chǎn)商提供檢測殘留宿主細胞DNA的定量PCR試驗，例如 AppTec 實驗室服務公司(AppTec Laboratory Services)、BioReliance 、亞瑟技術(shù)公司(Althea Technologies)，等等。檢測人病毒疫苗中宿主細胞DNA污染的化學發(fā)光雜交試驗和總DNA Threshold 系統(tǒng)的比較見參考文獻58?？刹捎脴藴始兓椒?，例如層析等在疫苗制備期間除去污染性DNA。通過核酸酶處理，例如用DNA酶可促進除去殘留的宿主細胞DNA。參考文獻59和60披露了減少宿主細胞DNA污染的便利方法，其涉及兩步處理，首先可在病毒培養(yǎng)期間使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒顆粒破裂期間使用陽離子洗滌劑(例如，CTAB)。用烷化劑，例如β -丙內(nèi)酯處理也可用于除去宿主細胞DNA，該方法還可優(yōu)選用于滅活病毒顆粒[61]。
優(yōu)選在每15yg血凝素中含有<10ng (例如，<lng、〈100pg)宿主細胞DNA的疫苗，例如每O. 25ml體積含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細胞DNA的疫苗。更優(yōu)選在每50 μ g血凝素中含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細胞DNA的疫苗，例如每O. 5ml體積含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細胞DNA的疫苗。優(yōu)選任何殘留宿主細胞DNA的平均長度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于IOObp,等等。對于用細胞系，例如MDCK細胞培養(yǎng)，可用懸液培養(yǎng)[34、62、63]或貼壁培養(yǎng)的細胞來培養(yǎng)病毒。用于懸液培養(yǎng)的一種合適的MDCK細胞系是MDCK 33016(保藏號為DSM ACC2219)?；蛘?，可采用微載體培養(yǎng)。優(yōu)選用無血清的培養(yǎng)基和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)支持流感病毒復制的細胞系。本發(fā)明將其中不含人或動物來源的血清添加劑的培養(yǎng)基稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白質(zhì)應理解為表示發(fā)生細胞增殖的培養(yǎng)基中不含蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)，但可包含病毒生長所需的蛋白質(zhì)，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在這種培養(yǎng)基中生長的細胞自身可天然含有蛋白質(zhì)。支持流感病毒復制的細胞系優(yōu)選在37°C以下生長[64](例如，30-36 °C，或約30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )，例如在病毒復制期間。在培養(yǎng)的細胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步驟給培養(yǎng)的細胞接種待培養(yǎng)的毒株，將受感染的細胞培養(yǎng)病毒繁殖所需的時間，例如通過病毒滴度或抗原表達測定的(如，接種后24-168小時)，收集繁殖的病毒。以病毒和細胞之比為1:500-1:1，優(yōu)選1:100-1: 5，更優(yōu)選1:50-1:10 (通過PFU或TCID5tl檢測)接種培養(yǎng)的細胞?？蓪⒉《炯尤爰毎麘乙褐?，或施加于細胞單層，病毒于25-40°C，優(yōu)選28-37°C，在細胞上吸附至少60分鐘，但通常少于300分鐘，優(yōu)選在90-240分鐘之間?？赏ㄟ^凍融或酶促作用除去感染的細胞培養(yǎng)物(例如，單層)，從而增加了收集的培養(yǎng)上清液中的病毒含量。然后使收集的液體滅活或冷凍保存。以約O. 0001 - 10，優(yōu)選O. 002 - 5，更優(yōu)選O. 001-2的感染復數(shù)(“m. o. i. ”)感染培養(yǎng)的細胞。更優(yōu)選以約O. 01的m. ο. i.感染細胞。感染后30-60小時收集感染的細胞。優(yōu)選在感染后34-48小時收集細胞。更優(yōu)選在感染后38-40小時收集細胞。通常在細胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以釋放病毒，可在培養(yǎng)期間的任何合適階段加入蛋白酶。血凝素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原,參考HA水平使疫苗劑量標準化,一般通過單向輻射狀免疫擴散(SRID)試驗檢測。疫苗通常含有約15 μ gHA/毒株，雖然在例如兒童，或流行情況下還可使用較低的劑量。與較高劑量(例如，3X或9X劑量[65、66]) 一樣，已使用了部分劑量，例如V2WPasyg HA/毒株hVdPVUej]。因此，疫苗可包含 O. 1-150 yg HA/ 流感毒株，優(yōu)選 O. 1-50 μ g,例如 O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g，等等。具體的劑量包括，例如約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約I. 9、約I. 5，等等。與本發(fā)明一樣，當疫苗中存在佐劑時，這些較低的劑量最有用。對于活疫苗，通過中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)而不是HA含量來檢測給藥，每種毒株的TCID50 一般在IO6-IO8之間(優(yōu)選IO6 5-IO7 5)。本發(fā)明所用的HA可以是病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可經(jīng)修飾。例如，已知可修飾HA以除去致使病毒在禽類中高度致病的決定簇(例如，圍繞HAl和HA2之間的切割位點的超堿性區(qū)域(hyper-basic region)),否則這些決定簇可阻止病毒在卵中生長。本發(fā)明試劑盒的抗原組分可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為“吐溫”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇_9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉，特別是對于裂解或表面抗原疫苗?？梢灾淮嬖诤哿康南礈靹?。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、α-生育酚半琥珀酸酯(a -tocopheryl hydrogen succinate)和聚山梨醇酯80各自低于lmg/ml。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。滅活但非全細胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或純化的表面抗原疫苗)可包含基質(zhì)蛋白，從而受益于位于該抗原內(nèi)的其它T細胞表位。因此，包含血凝素和神經(jīng)氨酸酶的非全細胞疫苗(特別是裂解疫苗)還可包含Ml和/或M2基質(zhì)蛋白。如果存在基質(zhì)蛋白，優(yōu)選包含可檢測水平的M2基質(zhì)蛋白。還可存在核蛋白。不可溶的顆粒佐劑本發(fā)明的組合物和試劑盒包含不可溶的顆粒佐劑。本發(fā)明所用的合適不可溶顆粒佐劑的離子包括但不限于鋁鹽、鈣鹽和微粒。不可溶的顆粒佐劑的功能通常是作為吸附劑，從而能在混合抗原和佐劑時將抗原(例如，血凝素)能吸附到佐劑上。然而對于微粒，作為將抗原吸附到顆粒表面的替代方法(或者除了將抗原吸附到顆粒表面)，還可能將抗原包裹在顆粒的內(nèi)部。
合適的鋁鹽包括稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是慣常的，但只是為方便而使用，并未精確描述所存在的實際化學構(gòu)成[例如，見參考文獻67的第9章]。本發(fā)明可用常規(guī)用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。稱為“氫氧化鋁”的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分結(jié)晶。羥基氧化鋁以分子式AlO(OH)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁Al(OH)J^區(qū)別在于紅外(IR)光譜，特別是在1070CI!!—1處存在吸收帶和在3090-3100( ^處存在強烈的肩峰[參考文獻67的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(tài)(例如，電子透射顯微照片所見的)。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理PH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報道，pH7. 4時，氫氧化鋁佐劑的吸附能力在每mg A1+++1. 8-2. 6mg蛋白質(zhì)之間。稱為“磷酸鋁”的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根(即，羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代該 鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常在O. 3-1. 2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴格的A1P04。例如，3164CHT1的IR光譜帶(例如，當加熱至200°C時)表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻67的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常在O. 3-1. 2之間，優(yōu)選在O. 8-1. 2之間，更優(yōu)選0.95±0. I。磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A13+摩爾比在O. 84-0. 92之間，含O. 6mg Al3+/ml的無定形羥基磷酸鋁。磷酸鋁通常是顆粒狀的(例如，電子透射顯微照片中所見的平板樣形態(tài))。這些顆粒在吸附任何抗原后的典型直徑是O. 5-20 μ m(例如，約5-10 μ m)。據(jù)報道，ρΗ7· 4時，磷酸鋁佐劑的吸附能力在每mgA1+++0. 7-1. 5mg蛋白質(zhì)之間。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸根取代羥基的程度成反比，而該取代程度依據(jù)沉淀制備該鹽所用的反應條件和反應物濃度而不同。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通過添加例如組氨酸緩沖液(使得PZC更具堿性)等緩沖液來改變PZC。本發(fā)明所用磷酸鋁的PZC通常在4. 0-7. O之間，更優(yōu)選在5. 0-6. 5之間，例如約5. 7。本發(fā)明所用的鋁鹽懸液可含有緩沖液(例如，磷酸或組氨酸或Tris緩沖液)，但不一定。這些懸液優(yōu)選無菌、無熱原。懸液可含有游離的水性磷酸根離子，例如濃度在1.0-20mM之間、優(yōu)選在5-15mM之間、更優(yōu)選約10mM。這些懸液也可含有氯化鈉。在本發(fā)明的一個實施方式中，佐劑包含氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[6]。在這種情況中，磷酸鋁可能多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2:1，例如彡5: I、彡6: I、彡7: I、彡8: I、^ 9:1，等等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選低于10mg/ml,例如< 5mg/ml、i^ 4mg/ml、 3mg/ml、i^ 2mg/ml、i^ lmg/ml,等等。優(yōu)選的范圍在 O. 3-lmg/ml 之間。優(yōu)選最大〈O. 85mg/劑。輕鹽在各種鈣鹽中，通常只用磷酸鈣作為佐劑。現(xiàn)已報道了磷酸鈣的各種佐劑形式，本發(fā)明可用任何這些形式。
水合磷酸鈣凝膠佐劑可購自丹麥瓦德貝克市的斯由普夫公司(Superfos，Vedbaek, Denmark)。1995年，參考文獻67的第8章總結(jié)了磷酸鈣佐劑?？赏ㄟ^在有抗原存在下原位沉淀該鹽，或通過吸附至預形成的鹽上而將抗原吸附到磷酸鈣上。述及了預形成的磷酸鈣凝膠的商品化來源。詳細給出了沉淀條件對佐劑的物理化學特征，包括吸附能力的影響。參考文獻68報道了各種磷酸鈣佐劑的結(jié)構(gòu)和吸附特性。據(jù)報道，這些佐劑是式Ca1Q_x (HPO4) x (PO4) 6_x (OH) 2_x所示的非化學計量羥基磷灰石，而不是嚴格的Ca3 (PO4) 2，其表面電荷取決于pH，零電荷點(PZC)為5. 5。佐劑可以形成尺寸約IOnmX 150nm的針狀顆粒以及直徑約20-30nm的不規(guī)則形狀的片。參考文獻69披露了含有反應活性空位(reactive vacant site)的反應活性無定形磷酸I丐，通過使碳酸化的無定形磷酸I丐的碳酸鹽預組分(pre-component)熱分解成氣態(tài) 或汽化副產(chǎn)物來除去所述預組分而獲得這些反應活性位點。參考文獻70和71披露了顆粒磷酸鈣佐劑(“CAP”)，其中所述顆粒的直徑為300-4000nm (納米顆粒)，形狀為球形，表面平滑。參考文獻72披露這些顆?？捎糜谡衬っ庖摺⒖嘉墨I還披露了了粘膜免疫，其中疫苗接種哺乳動物以產(chǎn)生IgA抗體應答的方法利用大小適于經(jīng)上皮轉(zhuǎn)運的顆粒羥基化磷酸鈣。參考文獻74披露了在體內(nèi)可溶的復合顆粒，其包含聚合物顆粒，所述顆粒表面包被有Ca/P之比約I. 0-2. O的磷酸鈣化合物。參考文獻75披露了用于吸附疫苗的可注射水性磷酸鈣凝膠，其中鈣離子和磷酸根離子的組合比例使得重量比Ca/P為I. 62-1. 85，從而在20°C當每升含O. 07個Ca原子時該凝膠的沉淀時間為10分鐘內(nèi)沉降I-20mm。磷酸鈣佐劑的Ca與P摩爾比可以不同，例如在I. 35-1. 83之間[見參考文獻67的第8章]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)佐劑的吸附特性依據(jù)沉淀期間所用的條件而有所不同，例如緩慢混合所得佐劑的吸附性能低于快速混合形成的佐劑。本發(fā)明疫苗中以Ca++檢測的磷酸鈣含量可以在O. lmg/ml和10mg/ml之間，例如在0. 5_5mg/ml 之間，優(yōu)選 0. 75_3mg/ml、0· 9-1. 5mg/ml 之間或約 lmg/ml。磷酸鈣佐劑能吸附抗原。對于某給定的抗原，以抗原的總重量計，吸附了至少80% (例如，彡 85%、彡 90%、彡 92. 5%、彡 95%、彡 97. 5%、彡 97. 5%、彡 98%、彡 99%、彡 99. 5%,等等)。由于磷酸鈣佐劑不可溶，采用以下方法可方便地檢測吸附程度，所述方法包括離心然后測定固體或可溶物質(zhì)之一(或二者)中的抗原含量。離心后，未吸附的抗原維持在溶液中。例如，參考文獻76采用該方法檢測了磷酸鈣佐劑的吸附能力。當(a)白喉類毒素水平升高到IOOLf以上和(b)破傷風類毒素水平升高到25Lf以上時，將白喉和破傷風類毒素吸附到Img Ca++上是不完全的。對于吸附，優(yōu)選利用加入了一種或多種流感抗原的水性懸液形式磷酸鈣佐劑?？上葘⑩}鹽稀釋至所需濃度再加入抗原。微粒將微粒用作佐劑已見描述，例如見參考文獻77和78。優(yōu)選的微粒由生物可降解和無毒聚合物制成。例如，可用選自下組的聚合物制成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。還可利用這些聚合物的共聚物，例如或者D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。優(yōu)選的聚合物是聚(α-羥酸)，更優(yōu)選選自下組的那些聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。最優(yōu)選的聚合物是稱為“PLG”的聚(D, L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物。優(yōu)選的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物是丙交酯/乙交酯摩爾比為25:75-75:25，更優(yōu)選40:60-60:40，例如約50:50的那些。含有50%D, L-丙交酯和50%乙交酯的50:50PLG聚合物是快速吸附的聚合物，而因為丙交酯分量增加，75:25PLG降解較慢，85:15和90:10甚至降解更慢?？色@得各種分子量的這些聚合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難測定某給定抗原的合適分子量。對于聚交酯，例如合適的分子量是約2000-5000級別的。對于PLG，合適的分子量通常是約 10，000-約 200，000，優(yōu)選約 15，000-約 150，000，最優(yōu)選約 50，000-約 100，000。有用的范圍是30，000道爾頓-70，000道爾頓。 微粒的直徑為約IOOnm-約150nm,更優(yōu)選直徑約200nm_約30 μ m,最優(yōu)選直徑約500nm-約10 μ m。一般它們基本上是球形的?？刹捎酶鞣N方法制備微粒。例如，已知有雙乳液/溶劑蒸發(fā)技術(shù)，該技術(shù)包括形成由聚合物溶液液滴構(gòu)成的初級乳液，隨后與含有顆粒穩(wěn)定劑/表面化學表面活性劑的連續(xù)液相混合。更具體地說，如參考文獻79中所述，可利用水包油包水(w/o/w)溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)形成微粒。在該技術(shù)中，將特定的聚合物與有機溶劑，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、氯仿等混合。聚合物在有機溶劑中形成約2-15%，更優(yōu)選約4-10%，最優(yōu)選6%的溶液。利用，例如勻漿器乳化聚合物溶液。然后將乳液與乳液穩(wěn)定劑，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮的大體積水溶液混合。乳液穩(wěn)定劑通常形成約2-15%的溶液，更常見形成約4-10%的溶液。然后勻漿該混合物產(chǎn)生穩(wěn)定的w/o/w雙重乳液。隨后蒸發(fā)有機溶劑。可調(diào)節(jié)制劑參數(shù)以沉淀小的(<5ym)和大的(>30 μπι)微粒。例如，慢速攪拌可獲得大顆粒，因為增大了內(nèi)相體積。可通過常規(guī)方法測定顆粒大小。除了采用雙乳液技術(shù)，還可采用單乳液技術(shù)。還可采用噴霧干燥和凝聚，或通過空氣懸浮包衣技術(shù)，例如鍋包衣和Wurster包衣形成微粒。還可利用離子凝膠。 制備后，可按原樣保存微粒，或可凍干待用。將抗原懸浮到制備的微粒上的一種方法如下所示。利用可透析的洗滌劑將微粒再水合并分散成基本上單體的微粒懸液。有用的洗滌劑包括但不限于各種N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)(稱為MEGA)，例如庚酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-7)、辛?；?N甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10);膽酸；膽酸鈉；脫氧膽酸；脫氧膽酸鈉；牛磺酸；牛磺酸鈉；牛磺去氧膽酸(taurodeoxycholic acid);?；侨パ跄懰徕c；3[(3_膽酰胺(cholamido)丙基)二甲基銨基(dimethylammonio) ]-1_丙磺酸酯(CHAPS) ;3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]_2_輕基-I-丙磺酸酯(CHAPSO) ;N-十二烷基-N，N- 二甲基-3-銨基(ammoniol)-丙磺酸酯(ZWITTERGENT3-12) ；N, N-雙-(3-D-葡糖酰氨基丙基(gluconeamidopropyl))-脫氧膽酰胺(deoxycholamide) (DEOXY-BIGCHAP) ;N辛基葡糖苷；鹿糖單月桂酸酯(sucrosemonolaurate);甘氨膽酸/甘氨膽酸鈉；月桂肌氨酸(Iaurosarcosine)(鈉鹽)；葡糖脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid)/ 葡糖脫氧膽酸鈉(sodium glycodeoxycholate)。所用的洗滌劑與微粒之比(W:w) —般約為O. 0156:1，更優(yōu)選約O. 625:1，甚至更優(yōu)選約O. 25:1，最優(yōu)選約1:1-2: I。然后物理研磨微粒/洗滌劑混合物，例如使用陶瓷研缽和研棒，直至形成光滑的漿液。然后加入合適的水性緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水(PBS)或Tris緩沖鹽水，超聲處理或勻漿得到的混合物直至微粒完全懸浮。隨后向微粒懸液中加入感興趣的抗原，整個系統(tǒng)進行透析以除去洗滌劑。聚合 物微粒和洗滌劑系統(tǒng)的選擇最好使得感興趣的抗原能吸附到微粒表面同時仍能維持抗原的活性?？梢韵慈ズ斜砻嫖娇乖乃梦⒘５奈唇Y(jié)合抗原，將其作為合適緩沖制劑的懸液保存，或用合適的賦形劑凍干，如下文進一步描述的?？扇芜x處理微粒以獲得帶負電荷的表面(例如，用SDS)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB)。根據(jù)待吸附的抗原，表面特征變化可改變吸附特征。免疫增強劑本發(fā)明組合物包含免疫增強劑，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用免疫增強劑和不可溶的顆粒佐劑獲得了出乎意料有效的免疫原性組合物。優(yōu)選的免疫增強劑是Toll樣受體(TLR)激動劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一種或多種的激動劑。優(yōu)選的免疫增強劑是TLR7的激動劑(例如，咪唑并喹啉類)和/或更優(yōu)選TLR9的激動劑(例如，CpG寡核苷酸)。這些免疫增強劑可用于活化先天免疫途徑。典型的免疫增強劑是有機化合物，通常不是聚合物。它們的分子量可低于2kDa，例如 <1800Da、<1600Da、<1400Da、<1200Da、〈lOOODa、<800Da、<600Da、<500Da、<400Da、<300Da或 <200Da。合適的免疫增強劑包括但不限于 免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或雙鏈RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸?！?3-0-脫酰基單磷酰脂質(zhì) A ( “3dMPL”，也稱為 “MPL ” ) [80-83]。 咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[84、85]、瑞喹莫德(“R-848”)[86]和它們的類似物；和它們的鹽(例如，鹽酸鹽)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它細節(jié)見參考文獻87-91。·縮氨基硫脲化合物，例如參考文獻92披露的那些。參考文獻92還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法?！ど吠衔铮鐓⒖嘉墨I93披露的那些。參考文獻93還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。 核苷類似物，例如(a)艾沙托拉濱(Isatorabine) (ANA-245 ;7_硫雜_8_氧代鳥
苷)及其前藥
jrVVo
wan入I
OO
(b) ANA975 ； (c) ANA-025-1 ； (d) ANA380 ； (e)參考文獻 94-96 所述的化合物；(f)下
式所示化合物
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原是滅活病毒。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原。
4.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原來自HI、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亞型。
5.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，從用細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。
6.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，從用卵培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物不含卵白蛋白、卵類黏蛋白和雞DNA。
8.如權(quán)利要求5或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含少于IOng細胞培養(yǎng)宿主的細胞DNA。
9.如權(quán)利要求5或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的100個核苷酸或更長的DNA少于10ng。
10.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含O.1-20 μ g血凝素/病毒毒株。
11.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑選自鋁鹽；鈣鹽；和微粒。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含氫氧化鋁。
13.如權(quán)利要求11或12所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含磷酸鋁。
14.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含磷酸鈣。
15.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含由聚(丙交酯-共-乙交酯)制成的微粒。
16.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述免疫增強劑是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9中的一種或多種的激動劑。
17.以上任一項權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述免疫增強劑是免疫刺激性寡核苷酸。
18.不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑。
19.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括混合以下組分的步驟(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑。
20.一種裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含不可溶顆粒佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一組分或所述第二組分包含免疫增強劑，或(b)所述試劑盒裝有包含免疫增強劑的第三試劑盒組分。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)含有不可溶顆粒佐劑的流感疫苗能引發(fā)主要是TH2應答(IgG1)的IgG應答。通過在組合物中加入免疫增強劑可使該應答向TH1應答(IgG2a)轉(zhuǎn)變。因此，本發(fā)明提供包含以下組分的免疫原性組合物(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強劑。
文檔編號A61K39/39GK102727885SQ20121022360
公開日2012年10月17日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者D·奧黑根, G·德爾古迪斯, R·拉普奧里 申請人:諾華疫苗和診斷有限公司