專利名稱：鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種不明病因的臨床綜合征，以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)，目前認(rèn)為屬于系統(tǒng)性自身免疫性疾病。主要特征為慢性、全身性、侵蝕性外周關(guān)節(jié)滑膜炎，主要侵犯滑膜組織，繼而引起關(guān)節(jié)軟骨、周圍韌帶及骨質(zhì)的破壞。本病呈全球性分布，我國的患病率為0. 32% 0. 36%，低于歐美國家白人的1%，是造成我國人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要病因之一。目前RA的治療主要是①控制關(guān)節(jié)及其他組織炎癥，緩解癥狀；②保持關(guān)節(jié)功能和防止畸形；③修復(fù)受損關(guān)節(jié)以減輕疼痛和恢復(fù)功能， 尚缺乏根治RA的方案以及預(yù)防RA的措施。到目前為止尚無特異性治療藥物，臨床上常采用的是控制炎癥和抑制機(jī)體免疫應(yīng)答的藥物，如潑尼松、氨甲喋呤等，但是，它們?cè)谝种茩C(jī)體免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)和組織損傷的同時(shí)，也抑制了免疫系統(tǒng)的抗感染能力，將由此而產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)。RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜及關(guān)節(jié)軟骨損害為特征的全身性免疫性疾病，主要表現(xiàn)為對(duì)稱性、慢性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎。一旦發(fā)病，往往終身罹患，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎至今尚無特效療法，抗炎和免疫療法是治療RA的主要手段，但主要是激素和抗代謝等不良反應(yīng)較多的藥物。因此尋找有效的具有免疫調(diào)節(jié)作用且副作用小的藥物，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療具有重要的意義。在此背景下，人們的目光轉(zhuǎn)向了中醫(yī)中藥。中醫(yī)藥防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐積累給抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，特別是前人對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(中醫(yī)痹癥范疇)治療的理論總結(jié)和處方用藥經(jīng)驗(yàn)，為當(dāng)今中藥抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究提供了線索和捷徑。尋找價(jià)格便宜和療效好的中藥及其有效成分治療RA，日漸成為研究的熱點(diǎn)。迄今報(bào)道對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中藥有效成分有多糖類、黃酮類、苷類、生物堿類、內(nèi)酯類、揮發(fā)油類及其他。具有療效確切、安全、副作用少、價(jià)格便宜等特點(diǎn)?！吨兴幋筠o典》載鬼針草有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀消腫之功效。我們從鬼針草中提取了活性成分TFB，研究其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用和作用機(jī)制。鬼針草(Bidens bipinnata L.)系菊科鬼針草屬一年生草本植物,在我國大多數(shù)省區(qū)均有分布。鬼針草藥用歷史悠久，味苦、性平而無毒，具有清熱解毒，散瘀消腫等功效。其主要成分有黃酮苷、皂苷、生物堿、揮發(fā)油等，民間用于治療痢疾、腹瀉、肝炎、胃痛、關(guān)節(jié)痛等，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鬼針草富含黃酮類化合物，為將其開發(fā)成對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療作用的有效藥物提供非常珍貴的依據(jù)。我們提取其有效部位，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其有顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。經(jīng)檢索，尚未見關(guān)于鬼針草總黃酮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鬼針草總黃酮(total flavones of Bidens pilosa L,TFB)的提取方法及其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，鬼針草總黃酮的提取方法，其提取工藝步驟為取鬼針草，用1(T14倍鬼針草重量的、質(zhì)量濃度為709^90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPDlO吸附提取液；提取液上樣濃度為f I. 5mg mL'以f 3BV 的吸附速率進(jìn)行吸附，上樣量以溶質(zhì)總黃酮計(jì)為3飛mg mL—1大孔吸附樹脂；吸附后先以3飛BV的水水洗去雜質(zhì)，再用3飛BV質(zhì)量濃度為70% 90%的乙醇以3飛BV .h—1的速率進(jìn)行洗脫；在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復(fù)使用3飛次；經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，質(zhì)量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述總黃酮百分含量為60% 80%，得率為3% 6%。
所述鬼針草總黃酮溶液在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。所述鬼針草總黃酮溶液制備成治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物，即片劑、膠囊劑、沖劑和顆粒。鬼針草總黃酮的臨床推薦劑量為IOOlOOmg/天，口服，一日三次。(8(Tl60mg/kg是大鼠的用藥劑量)將所制備得到的鬼針草總黃酮溶液進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下鬼針草總黃酮(TFB160mg/kg)于用藥后第4天開始明顯減輕AA大鼠的足腫脹度(與AA模型組比較，p〈0. 05)，用藥第12天(d21)開始TFB40，80mg/kg均可顯著減輕AA大鼠的足腫脹度(TFB40mg/kg組與AA模型組比較，p<0. 05 ；TFB80mg/kg組與模型組比較，p〈0.01);同時(shí)TFB (80、160mg/kg)在d21、d24顯著降低了 AA大鼠全身多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(表2);TFB160mg/kg能明顯降低AA大鼠血清IL-6水平(與模型組比較，P〈0. 05)，而TNF- a水平在TFB各劑量組中均明顯降低。病理組織學(xué)檢查結(jié)果提示TFB (40，80，160mg/kg)可明顯減少炎性細(xì)胞浸潤，明顯改善關(guān)節(jié)受損程度。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)掘了 TFB新的藥用前景，開拓了一個(gè)新的藥用領(lǐng)域；制備的鬼針草總黃酮采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長(zhǎng)期服藥無危害。鬼針草總黃酮的原藥資源非常豐富，具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效確切，為將鬼針草進(jìn)一步開發(fā)為新藥提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。


圖I大鼠AA關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)(A :正常組、B :模型組)圖2 AA大鼠膝關(guān)節(jié)肉眼形態(tài)。圖3 AA大鼠膝關(guān)節(jié)病理特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I鬼針草總黃酮的提取采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)鬼針草總黃酮乙醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定乙醇提取的生產(chǎn)工藝為用鬼針草12倍重量、質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液提取2次，每次I小時(shí)。并從總黃酮靜態(tài)吸附-解吸量、動(dòng)態(tài)吸附-解吸量、靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過程等方面，對(duì)國產(chǎn)七種大孔吸附樹脂進(jìn)行研究，選擇出了一種最適合于制備鬼針草總黃酮的大孔吸附樹脂HPD100。并對(duì)HPD100純化總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行考查，確定其工藝條件提取液上樣濃度為ri. 5mg mL'以2BV IT1的吸附速率進(jìn)行吸附，最大上樣量以總黃酮計(jì)為4. 99mg mL—1大孔吸附樹脂。吸附后先以4BV水洗去雜質(zhì)，再用4BV的質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶液以的速率進(jìn)行洗脫。在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，樹脂可重復(fù)使用5次。經(jīng)大孔樹脂吸附、乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮含量為72. 1%，得率為4. 7%0質(zhì)量控制是中藥研制工作的重點(diǎn)。利用化學(xué)鑒別法和薄層層析法對(duì)TFB進(jìn)行定性鑒別；采用NaNO2-Al (NO3)-NaOH顯色系統(tǒng)，用紫外分光光度法測(cè)定了鬼針草總黃酮提取物中黃酮的含量。TFB的含量為73. 3%，平均回收率為96. 51%，RSD為2. 61 %。該法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，可用于TFB的質(zhì)控方法。
實(shí)施例2提取步驟為取鬼針草，用10倍鬼針草重量的、質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPD100吸附；提取液上樣濃度為Img mL'以IBV h-1的吸附速率進(jìn)行吸附，上樣量以溶質(zhì)總黃酮計(jì)為3mg mL-1大孔吸附樹脂；吸附后先以3BV水洗去雜質(zhì)，再用3BV質(zhì)量濃度為70%乙醇以3BV 的速率進(jìn)行洗脫；在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復(fù)使用3次；經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，質(zhì)量濃度為70%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為75%，得率為3. 8%。實(shí)施例3提取步驟為取鬼針草，用14倍鬼針草重量的、質(zhì)量濃度為90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPD100吸附；提取液上樣濃度為I. Smg.mL-1,以3BV h-1的吸附速率進(jìn)行吸附，上樣量以溶質(zhì)總黃酮計(jì)為5mg mL-1大孔吸附樹脂；吸附后先以5BV水洗去雜質(zhì)，再用5BV質(zhì)量濃度為90%乙醇以5BV IT1的速率進(jìn)行洗脫；在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復(fù)使用5次；經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，質(zhì)量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為62. 8%，得率為6%。實(shí)施例4鬼針草總黃酮?jiǎng)游镄詫?shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是選取弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant, CFA)誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis, AA)大鼠模型。實(shí)驗(yàn)包括 I、AA大鼠模型的誘導(dǎo) Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌雄不限，體重160g±20g,由江蘇省血吸蟲病防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。除正常組外，所有大鼠左側(cè)后足跖皮內(nèi)注射CFA (即為卡介苗80°C、lh滅活后與高壓滅菌的液體石臘充分碾磨混勻配成IOmg ml/1的乳劑)0. ImL致炎，造成AA大鼠模型。2、動(dòng)物分組及給藥方案將AA大鼠隨機(jī)分為5組模型組；TFB (40、80、160mg kg—1)組和雷公藤多苷片(Glucoside Tripterygium Total, GTT) IOmg kg-1 對(duì)照組。AA 大鼠于致炎后第 10 24 天分別灌胃給藥(ImL IOOg-1);正常組與模型組給予等容量的無菌注射用水。3、關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定分別于致炎前(d0)、致炎后第10天(dlO)、第13天(dl3)、第17天(dl7)、第21天(d21)、第24天(d24)測(cè)定右側(cè)(繼發(fā)側(cè))足容積，并計(jì)算其腫脹度(A mL=致炎后容積-致炎前容積)，以觀察AA大鼠繼發(fā)側(cè)炎癥的變化情況。4、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(polyarthritis indes,PI)評(píng)分 致炎后dlO、dl3、dl7、d21、d24觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，計(jì)算出PI :0=無紅腫；1 =趾關(guān)節(jié)紅腫；2=趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3=踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4=包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。根據(jù)未注射CFA的其余3個(gè)關(guān)節(jié)的病變程度累計(jì)積分，即為每只大鼠的PI。5、關(guān)節(jié)滑膜組織病理組織學(xué)檢查致炎后d24引頸處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)滑膜及其周圍組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，作病理組織學(xué)檢查。采用隨機(jī)雙盲法鏡下觀察各組大鼠關(guān)節(jié)組織中炎癥細(xì)胞浸潤、骨侵蝕以及新生血管生成情況并評(píng)分0=正常；1=輕度；2=中度；3=嚴(yán)重。病理學(xué)評(píng)分為3者之和。6、血清IL-6和TNF-a的測(cè)定股動(dòng)脈取血，室溫靜置過夜，使其充分凝固，然后置于4°C冰箱過夜。以1500rpm離心30min，吸取上部清亮的血清，分裝于小瓶中，-20°C冰箱保存待放免法檢測(cè)。檢測(cè)方法，嚴(yán)格按照E2、P放免試劑盒說明書提供的步驟進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下I、AA大鼠模型的成功制備大鼠左后足趾皮下注射CFA dlO后繼發(fā)側(cè)(右側(cè))關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)，以后逐漸表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的慢性、全身性炎癥反應(yīng)。大鼠足爪腫脹明顯(如圖1B)，實(shí)驗(yàn)中見大鼠倦怠、攝食減少、消瘦、多發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)觸痛，活動(dòng)障礙等與RA相似的癥狀。2、TFB對(duì)AA模型大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹度的影響大鼠致炎后第1(T24天繼發(fā)側(cè)足腫脹度與正常組相比明顯增加；與模型組相比，TFB (160mg/kg)于用藥后第4天明顯減輕AA大鼠的足腫脹度；TFB (40、80mg/kg)自d21開始可顯著減輕AA大鼠的足腫脹度；GTT (10mg/kg)自第17天起對(duì)AA大鼠的足腫脹度有顯著抑制作用(表I)。表I TFB對(duì)AA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度的影響(n=8, x±s )
權(quán)利要求
1.鬼針草總黃酮的提取方法，其特征是提取步驟為取鬼針草，用1(T14倍鬼針草重量的、質(zhì)量濃度為70% 90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPDlO吸附提取液；提取液上樣濃度為f I. 5mg mL—1，以f 3BV IT1的吸附速率進(jìn)行吸附，上樣量以溶質(zhì)總黃酮計(jì)為:T5 mg 大孔吸附樹脂；吸附后先以:T5 BV的水水洗去雜質(zhì)，再用3 5 BV質(zhì)量濃度為709^90%的乙醇以3 5 BV 的速率進(jìn)行洗脫；在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復(fù)使用3飛次；經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，質(zhì)量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。
2.如權(quán)利要求I所述鬼針草總黃酮的提取方法，其特征是所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為60% 80%，得率為3% 6%。
3.鬼針草總黃酮在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，其特征是所述鬼針草總黃酮溶液在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。鬼針草總黃酮的提取步驟為取鬼針草，用乙醇溶解提??；收集提取液，用大孔吸附樹脂吸附；吸附后先以水洗去雜質(zhì)，再用乙醇進(jìn)行洗脫；在此條件下進(jìn)行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復(fù)使用；經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，用乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測(cè)定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所述鬼針草總黃酮溶液用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)的用量為80~160mg/kg。本發(fā)明發(fā)掘了TFB新的藥用前景，鬼針草總黃酮對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效確切；制備的鬼針草總黃酮采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長(zhǎng)期服藥無危害。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102716166SQ20121023867
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者李成萬, 李霞, 袁鳳來, 賀春暉, 趙懿清 申請(qǐng)人:無錫市第三人民醫(yī)院