專利名稱：地錦草提取物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酸合成酶抑制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸合酶原稱脂肪酸合成酶，(EC 2. 3. 1. 85, fatty acid synthase，縮寫為 FAS)，動(dòng)物體內(nèi)的脂肪酸合酶稱為I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合酶稱為II型 FAS。國內(nèi)外基礎(chǔ)研究表明，脂肪酸合酶是可以用于治療目的的潛在靶位。美國霍普金斯大學(xué)Loftus等對(duì)小鼠脂肪酸合成酶的研究結(jié)果證明，抑制脂肪酸 合成酶可造成丙二酰輔酶A的積累，而后者抑制與進(jìn)食相關(guān)的下丘腦神經(jīng)肽Y的表達(dá)，在不 影響小鼠活動(dòng)能力的情況下使食欲下降，體重降低。T. Loftus等指出，脂肪酸合成酶可以作 為控制體重潛在的治療靶位(Loftus. Τ. M. et al. ,2000. Science, 288 (5475) :2379-2381)。 以上結(jié)果表明，抑制脂肪酸合成酶的活性，可抑制體內(nèi)脂肪的合成，而且還能抑制動(dòng)物的食 欲，限制攝入的脂肪量并消耗體內(nèi)脂肪。因此，研制和開發(fā)脂肪酸合成酶的抑制劑具有重大 的減肥降脂肪的潛力。目前為止，已報(bào)道的脂肪酸合酶抑制劑較少，只有合成的C75 (Kuhajda F. P.， PizerE. S.，Li J. N.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，97，3450-3454 (2000))，較早發(fā)現(xiàn) ^^^/^^ ^ (cerulenin) (Vance D. ,Goldberg I. ,Mitsuhashi 0. et al. Biochem BiophysRes Commun. 48，649-656 (1972))和綠茶中的酯型兒茶素 EGCG (Wang X.，Tian W. X. Biochem. Biophys. Res. Commun, 288 (5) :1200-1206 (2001))和 ECG(Wang X·，SongK. S. , Guo Q. X.，et al. Biochem Pharmacol, 66 :2039-2047 (2003)) 這些抑制劑所具有的共 同缺點(diǎn)是抑制活性不夠高，應(yīng)用價(jià)值受到局限，因此尋找到抑制活性高的脂肪酸合酶抑制 劑具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明描述了地錦草提取物對(duì)FAS的抑制作用。地錦草(Euphorbia humifusa Wild.)，異稱地錦、奶花草、奶草、鋪地紅、蜈蚣草、 紅絲草、地馬桑、紅沙草、涼帽草、仙桃草、花被單、地瓣草等，為大戟科植物地錦Euphorbia hum ifusa Wi Ild或斑地錦Euphorbia maculata的干燥全草，一年生草本，含白色乳汁，生 于田野、路旁，我國各地均有分布。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酸合成酶抑制劑及其制備方法。本發(fā)明所提供的脂肪酸合酶抑制劑，是以地錦草為原料，用丙酮-水、乙醇-水浸 取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶劑經(jīng)回流處理提取得到的。其中所述丙酮-水混合溶劑中丙酮的體積百分?jǐn)?shù)可為50-70% ；所述乙醇-水 混合溶劑中乙醇的體積百分?jǐn)?shù)可為50-70% ；所述混合溶劑與地錦草的重量份數(shù)比可為 8-30 1 ；所述酸水為無機(jī)酸，所述酸的濃度為lmol/L。所述浸取的方法可為在25_70°C下攪拌，或80_100°C下加熱回流；所述在25_70°C 下攪拌浸取的時(shí)間可為3- 小時(shí)；所述80-100°C下加熱回流的時(shí)間可為2-12小時(shí)。
為了提高所述提取物的純度，所述浸取后還進(jìn)行過濾和濃縮；所述濃縮的方法為 除去濾液中的丙酮或乙醇，然后用乙酸乙酯從水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所 述乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，得到地錦草提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述脂肪酸合成酶抑制劑的用途。本發(fā)明的所提供的脂肪酸合成酶抑制劑的用途是脂肪酸合成酶抑制劑在制備減 肥藥中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的所提供的脂肪酸合成酶抑制劑還可以作為食品添加劑、日用化學(xué)品添加 劑及保健品添加劑等得到廣泛應(yīng)用。以本發(fā)明所提供的脂肪酸合成酶抑制劑為活性成分制備減肥藥物以及預(yù)防和/ 或治療癌癥的藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載 體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面 活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑、和著色劑等。用地錦草提取物制備的減肥藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服 液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。本發(fā)明的脂肪酸合酶抑制劑將在以脂肪酸合酶為靶點(diǎn)的相關(guān)疾病的預(yù)防及輔助 治療方面，在制備控制體重、防治與肥胖相關(guān)的疾病等方面的藥物，特別是在制備防治癌癥 等方面的藥物中發(fā)揮巨大作用。同時(shí)，本發(fā)明的脂肪酸合酶抑制劑在保健品及化妝品德生 產(chǎn)中也會(huì)有較大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為地錦草最佳溶劑的選擇圖；圖1中圖IA是地錦草對(duì)脂肪酸合酶的抑制率比較 (乙醇體系)、圖IB為不同比例丙酮提取地錦草對(duì)FAS的抑制率；
圖2為地錦草提取物IC5tl的測(cè)定曲線圖；圖2A是70%丙酮提取地錦草IC5tl的測(cè)定； 圖2B為地錦草乙醇萃取物IC5tl的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中，所用的脂肪酸合酶均為用常規(guī)方法(W.X. Tian et al. , 1985. J. Biol. Chem. ,260(20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝 臟脂肪酸合成酶活性的關(guān)系.生物化學(xué)雜志，12(2) =234-236)自新鮮鴨肝中分離提純的， 并經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)為單一帶。脂肪酸合酶活性采用乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH為底物的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)活方法 測(cè)定(W. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem. , 260 (20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生 長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合成酶活性的關(guān)系.生物化學(xué)雜志，12 (2) =234-236) 0實(shí)施例1、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質(zhì)的制備
將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。 用乙醇-水混合溶劑(乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為50% )與上述粉碎的地錦草按重量份 數(shù)比8 1混合，室溫25°C下攪拌浸取12小時(shí)，用普通濾紙過濾；在同樣條件下再浸取12 小時(shí)，然后用普通濾紙過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，4(TC (減壓)低溫蒸發(fā)除去乙醇，得到含有效物質(zhì)的水相，用等體積的石油醚脫去其中的脂類物質(zhì)，再用等體積乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯層，如上減壓低溫蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到浸膏，將該浸膏(真空) 干燥(50°C)得到固態(tài)的地錦草提取物，將該固態(tài)地錦草提取物稱為地錦草提取物A。實(shí)施例2、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質(zhì)的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-水混合溶劑(丙酮的體積百分?jǐn)?shù)為70% )與上述粉碎的地錦草按重量 份數(shù)比為15 1混合，80°C加熱回流3小時(shí)，進(jìn)行普通濾紙的過濾；在同樣條件下再加熱回 流2小時(shí)，進(jìn)行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，35°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃 縮，除去其中的有機(jī)溶劑，得到有效物質(zhì)水相，對(duì)水相中的有效物進(jìn)一步濃縮，具體方法為 先用等體積的石油醚分3-4次進(jìn)行萃取，除去其中的脂類物質(zhì)，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將 乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去有機(jī)溶劑得到經(jīng)濃縮的有效 物浸膏，即地錦草提取物。將此浸膏進(jìn)一步在40-50°C (真空)干燥得到固態(tài)的地錦草提取 物，將該固態(tài)地錦草提取物稱為地錦草提取物B。實(shí)施例3、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質(zhì)的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-水混合溶劑(乙醇與水的體積份數(shù)比為70 30)與上述粉碎的地錦草按 重量份數(shù)比為20 1混合，100°C加熱回流3小時(shí)，然后進(jìn)行普通濾紙的過濾，在同樣條件下 再加熱回流2小時(shí)，然后進(jìn)行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0.09MPa，4(TC (減壓)低 溫蒸發(fā)濃縮，除去其中的有機(jī)溶劑，得到含有效物質(zhì)的水相，即地錦草提取物。對(duì)水相中的有 效物進(jìn)一步濃縮，具體方法為用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，4(TC (減 壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去有機(jī)溶劑得到經(jīng)濃縮的有效物浸膏，將此浸膏在40°C進(jìn)一步(真空) 干燥得到固態(tài)的地錦草提取物，將該固態(tài)地錦草提取物稱為地錦草提取物C。實(shí)施例4、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質(zhì)的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-酸水混合溶劑(丙酮的體積百分?jǐn)?shù)為70%，酸的濃度為lmol/L)與上 述粉碎的地錦草按重量份數(shù)比為15 1混合，100°C加熱回流3小時(shí)，進(jìn)行普通濾紙的過 濾；在同樣條件下再加熱回流2小時(shí)，進(jìn)行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。在0. 09MPa, 35°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去其中的有機(jī)溶劑，得到有效物質(zhì)水相，對(duì)水相中的有效物 進(jìn)一步濃縮，具體方法為先用等體積的石油醚分3-4次進(jìn)行萃取，除去其中的脂類物質(zhì)， 再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去 有機(jī)溶劑得到經(jīng)濃縮的有效物浸膏，即地錦草提取物。將此浸膏進(jìn)一步在40-50°C (真空) 干燥得到固態(tài)的地錦草提取物，將該固態(tài)地錦草提取物稱為地錦草提取物D。實(shí)施例5、脂肪酸合酶抑制劑地錦草有效物質(zhì)的制備將地錦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-酸水混合溶劑(乙醇與水的體積份數(shù)比為70 30，酸的濃度為lmol/L) 與上述粉碎的地錦草按重量份數(shù)比為20 1混合，100°C加熱回流3小時(shí)，然后進(jìn)行普通濾 紙的過濾，在同樣條件下再加熱回流2小時(shí)，然后進(jìn)行普通濾紙的過濾，將兩次濾液合并。 在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去其中的有機(jī)溶劑，得到含有效物質(zhì)的水相，即 地錦草提取物。對(duì)水相中的有效物進(jìn)一步濃縮，具體方法為用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (減壓)低溫蒸發(fā)濃縮，除去有機(jī)溶劑得到經(jīng)濃縮的有效物浸 膏，將此浸膏在40°C進(jìn)一步(真空)干燥得到固態(tài)的地錦草提取物，將該固態(tài)地錦草提取物 稱為地錦草提取物E。實(shí)施例6、對(duì)脂肪酸合酶抑制活性的檢測(cè)37°C下，在2毫升石英比色皿中加入該酶底物0. 2mM乙酰輔酶A溶液25微升， 0. 4mM,丙二酸單酰輔酶A溶液50微升和1. 3mM NADPH溶液50微升，再加入0. 1M，pH 7. 0 磷酸鹽緩沖液1. 85毫升及FAS溶液30微升混勻，啟動(dòng)酶促反應(yīng)。用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)單位 時(shí)間內(nèi)340nm波長處吸光值A(chǔ)的變化，以(ΔΑ/min)來表示FAS的活力。地錦草藥材粉碎， 過40目篩，加入溶劑(1 20)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，離心分離上清液，稀釋十倍后測(cè)定提取 液對(duì)FAS的抑制率。在一定濃度地錦草提取物存在下，F(xiàn)AS全酶反應(yīng)的活力下降，當(dāng)其活力 下降一半時(shí)所需槭葉提取物的濃度即IC5tl值，用該數(shù)值表示地錦草提取物對(duì)FAS的抑制能 力，上述測(cè)活體系中FAS的終濃度為7微克/毫升。測(cè)定結(jié)果表明在上述測(cè)活條件下，地錦草70%丙酮溶液提取液對(duì)FAS的抑制率 最高，達(dá)到59. 01%，測(cè)活體系中原藥濃度為37. 5(yg/ml)(見圖1A-B)。地錦草提取物的 IC50分別為11-23微克/毫升(見圖2A-B)。實(shí)施例7、腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)將肝癌BEL-7402、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3M、宮頸癌Hela、食道 癌CAES-17五種癌細(xì)胞株(均購自醫(yī)科院藥物研究所)培養(yǎng)于含10%小牛血清、青霉素 (100yg/ml)和鏈霉素(100yg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在適當(dāng)濕度，含5% CO2的培 養(yǎng)箱中37°C單層貼壁傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的五種腫瘤細(xì)胞，分別接種于96孔板中，2 X IO4個(gè)/孔，貼壁培養(yǎng) 24小時(shí)換成分別含有按照實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3方法獲得的地錦草提取物的培養(yǎng) 液，按不同地錦草提取物濃度分成7組(設(shè)0、5、10、20、40、60、80 μ g/ml共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每 個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值)。繼續(xù)培養(yǎng)M小時(shí)，換成不含提取物的培養(yǎng)液，同時(shí)加入20 μ 1 MTT (四甲基偶氮唑 藍(lán)，5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄上清液，每孔加入200 μ 1 二甲基亞砜(DMSO)(對(duì)照組加 入等量培養(yǎng)液和二甲基亞砜)，水平震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光 值(A)，波長570nm，并按下述公式計(jì)算提取物對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用，結(jié)果如表1、表2、 表3、表4、表5所示，細(xì)胞生長抑制率(％ ) = (1-實(shí)驗(yàn)組A57tl/對(duì)照組A57tl) X 100%表1不同濃度地錦草槭提取物(作用M小時(shí))對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制率(％ )
權(quán)利要求
1.地錦草提取物在制備脂肪酸合成酶抑制劑中的應(yīng)用，所述脂肪酸合成酶抑制劑是以 地錦草為原料，用丙酮-水、乙醇-水浸取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶劑經(jīng) 回流處理提取得到的；其中所述丙酮-水混合溶劑中丙酮的體積百分?jǐn)?shù)可為50-70% ；所述乙醇-水混合溶 劑中乙醇的體積百分?jǐn)?shù)可為50-70%;所述混合溶劑與地錦草的重量份數(shù)比可為8-30 1 ； 所述酸水為無機(jī)酸，所述酸的濃度為lmol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述浸取的方法可為在25-70°C下攪拌， 或80-100°C下加熱回流；所述在25-70°C下攪拌浸取的時(shí)間可為3- 小時(shí)；所述80-100°C 下加熱回流的時(shí)間可為2-12小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述濃縮的方法為除去濾液中的丙酮或 乙醇，然后用乙酸乙酯從水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所述乙酸乙酯提取液中 的乙酸乙酯，得到地錦草提取物。
4.權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在制備減肥藥中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在作為食品添加劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在作為保健品添加劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑在日用化學(xué)品添加劑中的應(yīng)用。
8.一種預(yù)防和/或治療癌癥的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑 制劑。
9.一種減肥藥，其活性成分為權(quán)利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明是一種地錦草提取物的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種脂肪酸合酶抑制劑及其制備方法與應(yīng)用，其目的是提供一種脂肪酸合酶抑制劑及其制備方法與其在以脂肪酸合酶為靶點(diǎn)的相關(guān)疾病的預(yù)防及輔助治療中的應(yīng)用。該脂肪酸合酶抑制劑，是以地錦草為原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶劑浸取得到的。本發(fā)明所提供的以地錦草為原料制備的脂肪酸合酶抑制劑，具有較高的脂肪酸合酶抑制活性，本發(fā)明將在以脂肪酸合酶為靶點(diǎn)的相關(guān)疾病的預(yù)防及輔助治療方面，特別是在制備防治癌癥等方面的藥物中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)A61K8/97GK102119953SQ20101054610
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者宋學(xué)英, 張英俠, 楊華, 田維熙, 趙文華, 陳月 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)