專利名稱：一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，具體涉及一種用于治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
致盲的原因有多種，由于各種原因?qū)е卵劬Φ难茉錾侵饕闹旅ぴ蛑弧?引起眼睛的血管增生的常見病因有1、各種慢性進(jìn)行性高血壓或動脈硬化以及視網(wǎng)膜靜脈炎等疾病并發(fā)的視網(wǎng)膜中央靜脈總干或分支阻塞和糖尿病視網(wǎng)膜病變等引起的視網(wǎng)膜大面積慢性毛細(xì)血管缺血、缺氧、產(chǎn)生血管生成因子，從而導(dǎo)致新生血管形成。2、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，多見于過量吸氧。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜尚未發(fā)育完善，以周邊部最不成熟，處于高氧環(huán)境下，視網(wǎng)膜血管收縮、阻塞，使局部缺血、缺氧，誘發(fā)視網(wǎng)膜血管異常增生。3、滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性、病理性近視等眼底退行性變性。大多位于后極部，是典型的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管一玻璃膜一視網(wǎng)膜色素上皮復(fù)合體病變。玻璃膜連同色素上皮皸裂，脈絡(luò)膜血管增生并由皸裂處向視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下生長。4、各種原因所致的角膜損傷、潰瘍或炎癥引起的角膜或結(jié)膜血管增生。目前對于上述原因所致的眼睛的血管增生主要是采取中醫(yī)療法或激光等物理療法，但是療效不理想，尚沒有特效的抑制眼睛的血管增生的藥物。致使血管增生導(dǎo)致的盲癥還沒能得到有效的控制，而是隨著老齡人口的增加等原因，血管增生所致的盲癥呈增多之趨勢。當(dāng)前，亟待于開發(fā)新的抑制眼睛血管增生的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA序列重組于畢赤酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物活性分析證明，所合成基因編碼的蛋白具有抑制血管新生和治療眼睛血管新生的功能。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施實現(xiàn)I. DNA序列的合成設(shè)計如下DNA序列，并用套疊PCR方法進(jìn)行其序列合成。將其序列命名為sin。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2. DNA序列編碼蛋白功能的證明(I) DNA序列重組于酵母中表達(dá)通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PGAP9K的多克隆位點，將其表達(dá)載體命名為pGAP9K-sin(附圖I)。用電轉(zhuǎn)法將 pGAP9K-sin 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GSl 15，獲得工程菌 GSl 15 (pGAP9K_sin)。用 BMGY-BMMY 發(fā)酵 GS115 (pGAP9K-sin)誘導(dǎo)表達(dá) Sin 蛋白。(2)表達(dá)產(chǎn)物活性分析發(fā)酵液上清過Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱進(jìn)行純化(附圖2)，收獲的含目標(biāo)蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，進(jìn)行抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗，制成眼藥水進(jìn)行治療大鼠視網(wǎng)膜血管增生模型和治療猴子血管新生模型。結(jié)果是Sin蛋白抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強于Angiostatin (附圖3)， 顯著地抑制大鼠視網(wǎng)膜血管新生(附圖4)，能治愈猴子眼睛血管增生模型，具有治療眼睛血管新生的作用。利用上述蛋白質(zhì)制備藥物，可用于治療人眼睛血管增生，是一種治療眼睛血管增生的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明人工合成sin基因，將sin基因重組于畢赤酵母基因組進(jìn)行表達(dá)獲得的Sin 蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物純化后獲得的Sin蛋白能有效地抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生，具有治療眼睛血管增生的功能。血管生成抑制因子在治療血管增生性疾病中有著重要的用途。雖然已發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子有多種，但是本發(fā)明的血管生成抑制因子基因序列小， 分子量小的藥物有利于在機體內(nèi)的傳輸，并且Sin蛋白抑制血管生成的作用較強。為生產(chǎn)特效的治療眼睛血管增生的藥物的研究和開發(fā)創(chuàng)造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。


附圖I.構(gòu)建含sin基因的畢赤酵母表達(dá)載體附圖2 發(fā)酵 GS115(pGAP9K-sin)表達(dá) Sin 蛋白M.蛋白 Marker ；0. GS115 (pGAP9K)(負(fù)對照)；1. GS115 (pGAP9K_sin) ；2.純化的 Sin蛋白。附圖3. Sin蛋白抑制雞胚絨毛尿囊膜新血管生成試驗a. PBS ;B. Sin 蛋白(20 μ g) ；C. Angiostatin (20 μ g)附圖4. Sin蛋白抑制糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管增生a.右眼(滴PBS) ；b.左眼(滴Sin蛋白)
具體實施例方式I. DNA序列的合成(I)設(shè)計如下DNA序列。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(2)合成如下引物PI · 5，ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAG3，ρ2· 5’ TGTATCCACTCCAGAGTTTGTTCATGCCCACCGGGCACATGGGCTCCTGGTCCGTTTG3’
ρ3·5， TCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGAC3，ρ4· 5，GCATGGTGCTGAACCGCGCCAGGCAGGAGCCCGCCAGCCCCAGGTCCTGGTTGTGCGC3’ρ5·5， GGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGC3，ρ6·5，GGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCAGTAGGACTTGTCGTTCCGGCTGGCATAGTAGCA6，ρ7·5， CACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACC3，ρ8·TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA3，(3)用如下套疊PCR法進(jìn)行以上序列的合成，其步驟是①應(yīng)用Pl和ρ2引物進(jìn)行PCR，獲得產(chǎn)物I。②用Ρ3和ρ4引物進(jìn)行PCR擴增，獲得產(chǎn)物2。 ③用Ρ5和ρ6引物進(jìn)行PCR擴增，獲得產(chǎn)物3。④用Ρ7和ρ8引物進(jìn)行PCR擴增，獲得產(chǎn)物4。⑤以上獲得的底物1、2、3、4的混合物為底物，用引物Pl和ρ8進(jìn)行擴增，獲得產(chǎn)物 5.(4)將以上PCR產(chǎn)物5進(jìn)行DNA序列分析證明所獲的DNA序列與設(shè)計的一致ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2.序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PGAP9K的多克隆位點，將其表達(dá)載體命名為pGAP9K-sin(附圖I)。用電轉(zhuǎn)法將pGAP9K-sin轉(zhuǎn)化畢赤酵母63115，獲得工程菌63115( 64 91(-8丨11)。用YB)培養(yǎng)基發(fā)酵 GS115(pGAP9K-sin)表達(dá)Sin蛋白(附圖2)。將發(fā)酵液上清過Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，獲得符合標(biāo)準(zhǔn)分子量的目標(biāo)蛋白(附圖2)。(2) Sin蛋白活性分析將以上收獲的含目標(biāo)蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，抑制人臍帶靜脈細(xì)胞增殖試驗和抑制雞胚絨毛血管生成試驗(附圖3)。證明純化的Sin蛋白具有抑制新生血管生成的活性。(3) Sin蛋白治療眼睛血管增生I)制備滴眼液滴眼液I :取Sin蛋白O. 5mg溶解于5ml生理鹽水(O. 85 % NaCl)，用孔徑為O. I μ m的濾膜過濾除去細(xì)菌及病毒，然后加于995ml無菌的生理鹽水中制備成滴眼液。
滴眼液2 取Sin蛋白O. 3mg溶解于5ml PBS溶液(每升PBS溶液的制備NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 I. 44g，KH2PO4 0. 24g溶解于800ml蒸餾水中鹽酸調(diào)pH到7. 4然后加水補充到1000ml，15磅20分高壓滅菌冷卻至室溫)，用孔徑為O. I μ m的濾膜過濾除去細(xì)菌及病毒，然后加于995ml無菌的PBS溶液中制備成滴眼液。2)滴眼液療效檢測實驗一①大鼠視網(wǎng)膜血管增生模型的制作取20只180克SD品系雄性大鼠，注射70毫克/公斤體重的鏈脲佐菌素，制備大鼠糖尿病模型。當(dāng)大鼠的患糖尿病達(dá)3個月時，進(jìn)行用藥治療。②滴眼液治療視網(wǎng)膜血管增生方法將以上制備的視網(wǎng)膜血管增生模型鼠分成兩組(A，B)，每組10只。A組鼠的左眼 (AL)滴實例I制備的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(AR)滴生理鹽水，每只眼睛滴25μ I/次，用藥頻率同左眼；Β組鼠的左眼(BL)滴實例2制備的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(BR)滴生理鹽水溶液，每只眼睛滴25 μ I/次，用藥頻率同左眼。治療時間為10周。③滴眼液治療視網(wǎng)膜血管增生的療效分析將以上20只試驗鼠處死，眼球摘除后放入多聚甲醛溶液中。C固定24h，先鏡下觀察視網(wǎng)膜的血管增生情況(圖4)，從圖4可見，滴Sin蛋白的左眼的血管數(shù)量明顯少于滴生理鹽水的右眼的血管的數(shù)量。然后，組織切片計算視網(wǎng)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核的數(shù)量。每只眼睛觀察20個視野，然后計算平均每個視野的內(nèi)皮細(xì)胞核的數(shù)量(表I)。結(jié)果分析(表 2)表明與負(fù)對照組(AR和BR組)比較，試驗組的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量呈非常顯著性減少(P < O. 01)。表I.用Sin蛋白治療眼睛血管增生結(jié)果血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量(個)/平均每個
視野
權(quán)利要求
1.一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)，其特征在于編碼這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列是 atggtcagca tcggctacct cctggtgaag cacagccaaa cggaccagga gcccatgtgc 60 ccggtgggca tgaacaaact ctggagtgga tacagcctgc tgtacttcga gggccaggag 120 aaggcgcaca accaggacct ggggctggcg ggctcctgcc tggcgcggtt cagcaccatg 180 cccttcctgt actgcaaccc tggtgatgtc tgctactatg ccagccggaa cgacaagtcc 240 tactggctct ctaccactgc gccgctgccc cttaaggtcg acaagcttgc ggccgcactc 300 gagcaccacc accaccacca ctga324
2.一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)，其特征在于這種蛋白質(zhì)的氨基酸序列是Met Val Ser He Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp 151015Gln Glu Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly 202530Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln 354045Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met 505560Pro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser 657075Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro 808590Leu Lys Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His 95100105His His
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和權(quán)利要求2 所述的一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征在于利用所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)制備治療眼睛血管增生的藥物和醫(yī)藥制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療眼睛血管增生的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和氨基酸序列。是人工合成的DNA序列。具體核苷酸序列是序列表中1項下的序列，具體氨基酸序列是序列表中2項下的序列。將這一人工合成的DNA序列重組于畢赤酵母基因組，在畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白，經(jīng)過純化的這種蛋白質(zhì)能效地抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，能有效地治療眼睛血管增生。本發(fā)明為生產(chǎn)特效的治療眼睛血管增生的藥物的研究和開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)造了必要的條件，具有重要的理論和實際意義。
文檔編號A61K38/16GK102584954SQ20111031787
公開日2012年7月18日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者劉振旺, 張澤華, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 沈錦城, 羅進(jìn)賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南金寶正誠礦業(yè)有限公司