專利名稱：一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，人工魚類養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，生產(chǎn)集約化程度不斷提高。病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率30% 左右，每年直接損失高達(dá)百億元之巨。在眾多的細(xì)菌性病害中，弧菌病被公認(rèn)為是魚類養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一。主要的致病性弧菌包括副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖微生物病害的施虐，濫用抗生素的狀況也愈發(fā)嚴(yán)重?？股貧埩粢鸬氖称钒踩珕栴}事關(guān)人們的身體健康和民生大事，已引起各國(guó)政府高度重視的問題。高效廣譜弧菌疫苗的研發(fā)和應(yīng)用有利于減少抗生素的濫用，保證水產(chǎn)品的食品安全；同時(shí)可以防治致病微生物的感染，減少水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)病率。目前國(guó)外有近30多種商品化的魚用疫苗。我國(guó)魚用疫苗的研究起步較晚，獲得國(guó)家新獸藥證書的水產(chǎn)疫苗僅有3種，分別為草魚出血病細(xì)胞滅活疫苗、嗜水氣單胞菌病滅活疫苗以及牙鲆魚溶藻弧菌、鰻弧菌、遲緩愛德華菌病多聯(lián)抗獨(dú)特型抗體疫苗。目前并沒有一種有效地能夠防治多種致病性弧菌對(duì)魚類感染的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法，該疫苗疫苗具廣譜性，可用于防治多種致病性弧菌引起的魚類弧菌病。本發(fā)明首先提供了一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作為抗原成分。抗原成分為FlaA和OmpK 通過連接肽Gly4Ser相連成重組融合蛋白FlaA-OmpK ；重組融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ. NO. 1所示。其中OmpK是主要的抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK與其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高達(dá)95%以上。FlaA-OmpK亞單位疫苗具有良好的廣譜性，誘發(fā)產(chǎn)生的抗OmpK抗體對(duì)多種致病性弧菌(副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)具有良好的交叉反應(yīng)性，可用于防治多種致病性弧菌(付溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)對(duì)魚類的感染。鞭毛蛋白FlaA能夠激活魚腸道粘膜的TLR5受體，進(jìn)而激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)， 具有增強(qiáng)免疫效果的佐劑作用。融和蛋白FLaA-OmpK具有很強(qiáng)的免疫原性，誘發(fā)有效抗體的作用明顯強(qiáng)于蛋白混合物FLaA + OmpK以及蛋白OmpK。本發(fā)明的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗誘發(fā)的抗體對(duì)于副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌具有良好的交叉反應(yīng)性，可用于防治副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對(duì)魚類的感染。
所述疫苗的類型為腹腔注射疫苗或口服腸溶微球疫苗，免疫方式為腹腔注射免疫或口服免疫。腹腔注射免疫時(shí)，疫苗為重組融合蛋白FlaA-OmpK的生理鹽水溶液，免疫劑量為80-100 μ g/次，按IOOg體重計(jì)；口服免疫時(shí)，將口服腸溶微球疫苗摻合餌料中，自然攝食，免疫劑量為80-200 μ g/天，按IOOg體重計(jì)，連續(xù)2-4天口服免疫。所述口服腸溶微球疫苗，采用丙烯酸樹脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有腸溶功能，同時(shí)所制備的口服疫苗為微球狀，粒徑10 - 50nm。所述口服腸溶微球疫苗的制備方法，包括如下步驟
(1)融合蛋白FlaA-OmpKIOOmg溶于20mL TE_buffer中，10_30g丙烯酸樹脂II號(hào)溶于 250mL乙醇中，這兩種溶液在攪拌條件下混合均勻，作為內(nèi)油相；
(2)內(nèi)油相在lOOOOr/min攪拌條件下緩慢加入IOOOmL液體石蠟，所述液體石蠟含 0. 1-1. OmL卵磷脂和0. 1-0.6% Span80，乳化30min后，改為常規(guī)攪拌600r/min，持續(xù)攪拌至乙醇完全揮發(fā)，微球固化；
(3)離心收集微球顆粒，用乙醇洗滌數(shù)次，60°C干燥4h，即得口服腸溶微球疫苗。按照魚的個(gè)體重量和攝食習(xí)慣，將所需劑量的口服腸溶疫苗微球與粉狀魚飼料按一定的比例混合，擠壓成型，即可直接投料喂養(yǎng)，達(dá)到口服免疫效果。所述融合蛋白FlaA-OmpK的制備包括如下步驟
(1)以副溶血弧菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得目標(biāo)基因/7W和
(2)采用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得融合蛋白基因flaA-ompK；
(3)選用表達(dá)載體ρΕΤ48ει，構(gòu)建重組質(zhì)粒flaA-omPK—m-2^i；轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選轉(zhuǎn)化子；在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目標(biāo)蛋白；經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到融合蛋白 FlaA-OmpK0本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FLaA的融合蛋白FLaA-OmpK，并以融合蛋白作為疫苗的抗原成分。融和蛋白FLaA-OmpK誘發(fā)有效抗體的作用顯著強(qiáng)于蛋白混合物Flaw+ OmpK。在相同免疫劑量(100 μ g/100g體重)的條件下，融和蛋白FLaA-OmpK 免疫組產(chǎn)生的有效抗體的效價(jià)是混合蛋白FLaA + OmpK免疫組的4倍。2,OmpK是主要抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK與其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高達(dá)95%以上。FLaA-OmpK亞單位疫苗具廣譜性，可應(yīng)用于防治包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌，鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌等同源性較高的致病弧菌引起的魚類弧菌病。3、鞭毛蛋白FlaA能夠激活魚腸道粘膜的TLR5受體，進(jìn)而激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)，從而顯著增強(qiáng)魚類機(jī)體對(duì)弧菌的抵抗能力。FlaA作為抗原成分，具有明顯的增強(qiáng)免疫效果的佐劑作用。在相同免疫劑量(100yg/100g體重)的條件下，F(xiàn)LaA-OmpK組(不含佐劑)產(chǎn)生的抗OmpK抗體滴度明顯高于OmpK組(含有增強(qiáng)佐劑)。4、本發(fā)明所制備的FLaA-OmpK亞單位疫苗，可通過注射或口服方式進(jìn)行給藥免疫?？诜呙绮捎帽┧針渲琁I號(hào)包裹融合蛋白FLaA-OmpK，具有腸溶功能，避免了胃蛋白酶的降解作用。口服微球疫苗粒徑10 - 50nm，其中10 — 30nm的粒子占70%以上，有利于魚腸后段對(duì)微球的吸收。


圖1為PCR擴(kuò)增flaA和產(chǎn)物電泳分析圖；1- ompk PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2-flaA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3-Marker。圖2為PCR擴(kuò)增融合基因flaA-ompK產(chǎn)物電泳分析圖；Marker，2 一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式以下所用生化試劑如無特別提及，均為常規(guī)試劑。實(shí)施例1 FlaA-OmpK亞單位疫苗的制備 (1)副溶血弧菌/7W和目的基因的克隆設(shè)計(jì)克隆基因的引物
上游5-GGATCCATGGCGATTAACGTT-3 (BamH I) 下游5-CTCGAGGCCCAACAAGCTTAg-3 (Xho I) 設(shè)計(jì)克隆基因的引物
上游5-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3 (BanH I) 下游5-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3 (Hind III) 以副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802)總DNA為模板，分別采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行鞭毛蛋白 A基因片段和外膜蛋白K基因片段的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，可觀察到明顯的特異性條帶。采用flaA引物的PCR產(chǎn)物約1150bp，采用引物的PCR產(chǎn)物約730bp，電泳結(jié)果如圖1所示。分別將ompK和flaA的PCR產(chǎn)物用純化試劑盒純化后，連接pMD_19_T simple載體，構(gòu)建pMD-19T-o /l和pMD19T-/7d重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)五co7iDH5 α ,藍(lán)白篩選獲得陽(yáng)性重組菌。重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。將pMD-19T_0mpK重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明基因大小為732bp。所測(cè)序列用blast搜索比對(duì)，與副溶血弧菌所報(bào)導(dǎo)ompK脅\ (GenBank登錄號(hào) D61392. 1)同源性達(dá)100%，表明所得到的PCR產(chǎn)物是目標(biāo)基因OmpK0將pMD-19T_FlaA重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明-MaA基因大小為lU8bp。所測(cè)序列用blast搜索比對(duì)，和已登錄的副溶血弧菌(RIMD2210633)鞭毛蛋白A (GenBank登錄NP798640. 1)基因的同源性高達(dá)99%，表明所得到的PCR產(chǎn)物是目的基因 flaA。(2)融合蛋白基因/7^-05 ^的構(gòu)建設(shè)計(jì)重疊延伸PCR引物
克隆融合片段基因的引物 FPA :5，-CGGGATCCATGGCGATTAACGTT -3，(BamH I) RPA :5’ -GCTACCGCCACCGCCGCCCAACAAGCTTAG -3’ 克隆融合片段基因的引物
FPK :5’ -GGCGGTGGCGGTAGCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT- 3’ RPK :5’ -CCGCTCGAG TTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA- 3’ (Xho I)采用設(shè)計(jì)的PCR引物，以上述獲得的/7M和片段為模板，實(shí)施重疊延伸PCR操作， 拼接擴(kuò)增得融合基因/Vd-o /^。延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，可觀察到目的片段，融合基因/Vd-Ofi4^片段的大小約為1800bp左右，與預(yù)計(jì)目的基因flaA-ompK (1875bp)相符合。分別將載體質(zhì)粒pET_28a (+)和融合基因flaA-ompK片段實(shí)施XhoI和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pET-28a-FlaA-0mpk重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中經(jīng)藍(lán)白篩選獲得重組菌。擴(kuò)培重組菌，收集重組質(zhì)粒。將pET28a-FlaA-0mpK重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明融合基進(jìn)flaA-ompK大 、為187^ρ，其中/7W基因片段為112^ρ，基因片段為73^ρ，連接頭為15bp片段。將DNA測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件搜索比對(duì)，結(jié)果如下融合基因flaA-ompK 的序列與預(yù)測(cè)的融合基因序列比對(duì)，相似度為100%。(3)重組蛋白Ompk、FlaA, FlaA-Ompk的表達(dá)與純化
將鑒定后的含重組表達(dá)載體的E. coli BL21，接種于含50 μ g/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600約為0. 5-0. 8，加入IPTG至終濃度0. 5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5h。4°C, 6000g離心收集菌體。將離心收集的菌體用適量預(yù)冷的PBS重懸，置冰浴中超聲波破碎。40C，6000g離心 20min,沉淀即為包涵體。根據(jù)Qiagen公司蛋白純化說明書進(jìn)行重組蛋白純化。將純化產(chǎn)物置于透析袋，用TE 緩沖液(lOOmmolL-1，Tris-HCl (pH8. 0)，10mmol/L EDTA)透析，透析液每Mi換一次，透析6次。采用PEG20000進(jìn)行濃縮。重組蛋白FlaA-Ompk C端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，可用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行分離純化。從圖2的SDS-PAGE電泳分析表明，純化后的重組蛋白FlaA-Ompk呈單一條帶，達(dá)到電泳純。在本專利中作為參照物的重組蛋白Ompk、FlaA同理制備，均達(dá)到電泳純。(4)重組蛋白FlaA-Ompk亞單位疫苗的制備抗原蛋白凍干后，4°C保存?zhèn)溆?。采用注射免疫方式時(shí)，將凍干的抗原蛋白FlaA-Ompk直接用生理鹽水溶解，即可進(jìn)行注射免疫。采用口服免疫方式時(shí)，需制備成口服腸溶微球疫苗。實(shí)施例2 FlaA-OmpK 口服腸溶微球疫苗的制備
稱取IOOmg FlaA-QmpK蛋白，溶于20mL TE_buffer中，15g丙烯酸樹脂II號(hào)溶于250mL 乙醇中，這兩種溶液磁力攪拌混合均勻，作為內(nèi)油相。該內(nèi)油相于高速攪拌(彡10000r/min)下緩緩加入含IOOOmL含0. 5mL卵磷脂和 0. 35%Span80的液體石蠟中，乳化30min，后改為磁力攪拌(600r/min)，持續(xù)攪拌使乙醇完全揮發(fā)，微球固化。離心收集沉淀，石油醚洗滌數(shù)次，減壓干燥12h，即得最終產(chǎn)品。所制備腸溶微球，其載藥量為1%，包封率達(dá)77. 5%士3. 7%。電鏡觀察，粒子近球狀， 粒徑分布10-50nm, 粒徑10-30 nm的粒子占70%。按照魚的個(gè)體重量和攝食習(xí)慣，將所需劑量的口服腸溶疫苗微球與粉狀魚飼料按一定的比例混合，擠壓成型，即可直接投料喂養(yǎng)。實(shí)施例3 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)海水養(yǎng)殖黑石斑魚的免疫原性研究 3. 1 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)海水養(yǎng)殖黑石斑魚的免疫原性研究
6健康的美洲黑石斑魚(100士IOg/尾)隨機(jī)挑選分組，完全適應(yīng)養(yǎng)殖池環(huán)境后，進(jìn)行免疫試驗(yàn)。注射免疫方式，分為4個(gè)免疫組(OmpK組，融合蛋白FlaA-OmpK高劑量組，融合蛋白FlaA-OmpK低劑量組和混合蛋白組(OmpK +FlaA)，每組各25尾。上述實(shí)驗(yàn)組每尾魚給藥量(0. 2ml)分別為 OmpKClOOy g),FlaA-OmpK (230 μ g),FlaA-OmpK (100 μ g),0mpK+FlaA 等摩爾混合物(100 μ g)。OmpK組免疫時(shí)，藥物成分與弗氏完全佐劑(第一次免疫)/弗氏不完全佐劑(第二次免疫)按1:1混合，完全乳化后，腹腔注射。含F(xiàn)laA蛋白的免疫組，均不添加佐劑。對(duì)照組注射0.2mL無菌生理鹽水。首次免疫20天后，各組魚按首免劑量和方式加強(qiáng)免疫一次。首次免疫后每十天隨機(jī)挑選每組3尾石斑魚斷尾采血，分離血清，-200C 保存?zhèn)溆??？诜庖叻绞?，將石斑魚隨機(jī)分為二組，每組各25尾，分別投喂含有微球疫苗和未加疫苗的餌料。含有微球疫苗的自制餌料中重組蛋白含量為100yg/g餌料。第一次免疫，按0. 8g餌料/尾投喂石斑魚，即每次每只石斑魚免疫劑量為SOyg左右，連續(xù)投喂(自然攝食)3天。首次免疫后第20天加強(qiáng)免疫一次，口服免疫劑量與第一次免疫相同。與對(duì)照組相比，各重組蛋白免疫組均產(chǎn)生了顯著的特異性抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表1)表明
(1)在相同給藥劑量(IOOyg/尾魚)條件下，注射FlaA-OmpK組的抗體效價(jià)最高。 FlaA-OmpK組的抗OmpK抗體效價(jià)是FlaA+OmpK組的4倍，表明融合蛋白FlaA-OmpK的免疫原性顯著高于混合蛋白OmpK +FlaA。FlaA-OmpK組(不含佐劑)的抗OmpK抗體效價(jià)是 OmpK組(含有免疫增強(qiáng)佐劑)的2倍，表明融合蛋白FlaA-OmpK中的FlaA具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。(2)在試驗(yàn)給藥的劑量范圍內(nèi)，注射FlaA-OmpK高劑量組和低劑量組的血清抗體效價(jià)沒有差異，表明在低劑量FlaA-OmpK (IOOyg/尾魚)時(shí)已足以引起石斑魚的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。(3) 口服疫苗組的抗體效價(jià)在第30-40天達(dá)到最高值，明顯高于對(duì)照組，抗體效價(jià)達(dá)到1280，表明口服疫苗已誘發(fā)免疫反應(yīng)，盡管抗體效價(jià)低于注射組的抗體效價(jià)。表1 ELISA檢測(cè)第四十天魚血清抗體效價(jià)
3. 2 FlaA-OmpK免疫黑石斑魚抗血清對(duì)不同弧菌的交叉反應(yīng)性研究分別將副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、哈維氏弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、鰻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、溶藻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)以及2株創(chuàng)傷弧菌包被96孔酶標(biāo)板，采用間接 ELISA測(cè)定黑石斑魚FlaA - OmpK抗血清對(duì)5種弧菌的交叉反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑石斑魚FlaA - OmpK抗血清對(duì)于副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、哈維氏弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)、溶藻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)和鰻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株、野生株)均具有良好的交叉反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)稀釋度250-4000時(shí)，其P/N彡2. 1。創(chuàng)傷弧菌分為表面有莢膜型和表面無莢膜型。FlaA-OmpK免疫的黑石斑魚抗血清對(duì)表面無莢膜的創(chuàng)傷弧菌具有明顯的交叉反應(yīng)性，但對(duì)表面有莢膜的創(chuàng)傷弧菌反應(yīng)性較弱。創(chuàng)傷弧菌表面莢膜影響了抗血清中抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的接觸。表2 FlaA-OmpK免疫的黑石斑魚抗血清對(duì)不同弧菌的交叉反應(yīng)性(滴度)
實(shí)驗(yàn)菌株
反應(yīng)滴度
稀釋翻
副溶血弧菌
哈維氏弧菌
溶藻弧菌
111(
鰻弧菌
標(biāo)準(zhǔn)株(ATCCmo:) 野生株i+VpSP) 標(biāo)準(zhǔn)株ATCC E 野生株All-01) 標(biāo)準(zhǔn)株..AJCC 1 If^tti JS6051 標(biāo)準(zhǔn)株+ATCC ι 野生株 S狐5
創(chuàng)傷弧菌(帶莢膜HH 創(chuàng)傷弧菌(不帶芙膜".
50—4000 5C—40Μ. JC—4C0C
；η— Jirpr — Ar-.pr·.
J tJ — u Lr u
；η— j r."n 31J L·' υ· υ
5C— 4G0C 50—400C 30—40CC
實(shí)施例4 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)黑石斑魚預(yù)防副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保護(hù)
作用
攻擊病原菌為副溶血弧菌野生株(Vp89)，首先試驗(yàn)確定半致死量LD5(1。隨機(jī)將黑石斑魚(100士 IOg/尾)分成3組，每組10尾。Vp89活菌液按照梯度稀釋，每只黑石斑魚腹腔注射0. 2mL菌液，觀察14天，記錄死亡的個(gè)數(shù)。測(cè)定Vp89的LD5tl為2. 53 X IO6,攻毒菌數(shù)采用 10 X LD5。，即 2. 53X 107。對(duì)照組的黑石斑魚人工感染后表現(xiàn)出典型的急性細(xì)菌出血性敗血病癥狀皮膚和鰭潰爛出血，腹部腫脹，眼球突出，鰓絲和腸道充血，少量腹水，肝臟腫大，具出血點(diǎn)，腸道充血發(fā)紅，膽囊萎縮，性腺發(fā)炎，后腎腫大，大多數(shù)在感染后2-4日內(nèi)死亡。從瀕死的魚體中分離病菌重新鑒定證明與用于人工感染的菌株相同。本實(shí)施例考察了 FlaA-OmpK亞單位疫苗在不同給藥方式時(shí)對(duì)副溶血弧菌感染的預(yù)防保護(hù)作用。免疫劑量與實(shí)施例3相同，即注射組，免疫劑量為IOOyg/尾魚，20天后再免疫第2次；口服微球疫苗組，平均每天每尾魚投喂餌料0. 8g，其中含腸溶微球疫苗80yg，自然攝食，連續(xù)3天投喂含腸溶微球疫苗的餌料，20天后再免疫第2次。
用融合蛋白FlaA-OmpK免疫過的黑石斑魚對(duì)于副溶血弧菌Vp89的攻擊均表現(xiàn)出較高的抵抗能力。FlaA-OmpK注射組對(duì)于10倍LD5tl劑量副溶血弧菌Vp89的攻擊，保護(hù)率仍高達(dá)80%; 口服FlaA - Ompk保護(hù)率為50%，雖然低于注射組，但也達(dá)到較理想的效果。本專利所提供的FlaA-OmpK亞單位疫苗，無論采用注射免疫方式或口服腸溶微球疫苗免疫方式，均能有效地發(fā)揮免疫保護(hù)作用，預(yù)防副溶血弧菌感染。表3 FlaA _ OmpK免疫的黑石斑魚對(duì)副溶血弧菌Vp89攻擊的免疫保護(hù)作用
實(shí)施例5 FlaA-OmpK亞單位疫苗對(duì)歐洲鰻鱺預(yù)防鰻弧菌(SMTO)感染的免疫交叉保護(hù)
作用
權(quán)利要求
1.一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK 和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作為抗原成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，抗原成分為FlaA和 OmpK通過連接肽Gly4Ser相連成重組融合蛋白FlaA-OmpK ；重組融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ. NO. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，該疫苗用于防治副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對(duì)魚類的感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗的類型為腹腔注射疫苗或口服腸溶微球疫苗，免疫方式為腹腔注射免疫或口服免疫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于腹腔注射免疫時(shí)， 疫苗為重組融合蛋白FlaA-OmpK的生理鹽水溶液，免疫劑量為80-100 μ g/次，按IOOg體重計(jì)；口服免疫時(shí)，將口服腸溶微球疫苗摻合餌料中，自然攝食，免疫劑量為80-200 μ g/ 天，按IOOg體重計(jì)，連續(xù)2-4天口服免疫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述口服腸溶微球疫苗，采用丙烯酸樹脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有腸溶功能，同時(shí)所制備的口服疫苗為微球狀，粒徑10 - 50nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述口服腸溶微球疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)融合蛋白FlaA-OmpKIOOmg溶于20mL TE_buffer中，10_30g丙烯酸樹脂II號(hào)溶于 250mL乙醇中，這兩種溶液在攪拌條件下混合均勻，作為內(nèi)油相；(2)內(nèi)油相在lOOOOr/min攪拌條件下緩慢加入IOOOmL液體石蠟，所述液體石蠟含 0. 1-1. OmL卵磷脂和0. 1-0.6% Span80，乳化30min后，改為常規(guī)攪拌600r/min，持續(xù)攪拌至乙醇完全揮發(fā)，微球固化；(3)離心收集微球顆粒，用乙醇洗滌數(shù)次，60°C干燥4h，即得口服腸溶微球疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于所述融合蛋白 FlaA-OmpK的制備包括如下步驟(1)以副溶血弧菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得目標(biāo)基因/7W和(2)采用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得融合蛋白基因flaA-ompK；(3)選用表達(dá)載體ρΕΤ48ει，構(gòu)建重組質(zhì)粒flaA-omPK—m-2^i；轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選轉(zhuǎn)化子；在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目標(biāo)蛋白；經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到融合蛋白 FlaA-OmpK0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于防治魚類致病性弧菌感染的廣譜亞單位疫苗及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該疫苗以副溶血弧菌表面具有保守結(jié)構(gòu)的外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白OmpK-FlaA作為抗原成分。其特征是將副溶血弧菌的ompK和flaA基因通過重疊延伸PCR獲得融合蛋白基因flaA-ompK；構(gòu)建flaA-ompK－pET-28a重組質(zhì)粒，經(jīng)外源誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲到高純度融合蛋白FlaA-OmpK。本發(fā)明制備的疫苗安全無毒副作用，可以采用注射免疫,也可以采用口服腸溶微球疫苗免疫，可針對(duì)魚類致病性弧菌(副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌)產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K39/106GK102512674SQ20111042708
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者唐鳳翔, 林海英, 石賢愛, 鄭允權(quán), 鄭磊, 郭養(yǎng)浩 申請(qǐng)人:福州大學(xué)