專利名稱：家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，屬于昆蟲抗菌肽的分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
昆蟲每天都會直接接觸、食入、吸入成千上萬的病原微生物而不至于患感染性疾病，這種抵抗外來致病微生物的能力主要是通過天然免疫的防御機制得以實現(xiàn)。抗菌肽是所有物種中天然防御機制的重要組成部分，這類多肽可以是固有表達的，也可以被病原微生物及其產(chǎn)物誘導(dǎo)表達。
昆蟲抗菌肽是一類分子量小、水溶性好、穩(wěn)定、抗菌譜廣且抗菌機制獨特的多肽，是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的物質(zhì)。不少科學(xué)家認為，昆蟲具有驚人的天然免疫力，并以抗菌肽作為其宿主防御機制的主要成分?？咕某蟹翘禺愋缘目共≡⑸锿猓€有抗腫瘤細胞的作用，而對人體的正常細胞無破壞作用。因此，抗菌肽的開發(fā)和利用是目前抗病原微生物藥物開發(fā)研究中的一個熱點。
家蠅是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，能夠機械傳播人、畜多種病原菌如細菌、病毒和寄生蟲卵等。目前國內(nèi)外報道已從其幼蟲血淋巴中分離到了多種抗細菌、真菌、原蟲的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼蟲體外分泌物中發(fā)現(xiàn)了廣譜的抗植物病原菌、植物根結(jié)線蟲及寄生蟲卵的物質(zhì)。但這些研究多集中于抗菌肽的誘導(dǎo)及活性檢測階段，而體外不同環(huán)境對其抗菌活性的影響均無報道。目前，抗菌肽的純化方法多使用性質(zhì)溫和的凝膠層析，但該方法所需時間較長，每次上樣量及目的蛋白的回收量較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明采用透析、固相萃取、超濾和反相高效液相色譜方法從家蠅幼蟲分泌物中分離到具廣譜抗菌活性的肽類物質(zhì)，使抗菌肽制備時間縮短，提高了分離純化的效率，而且該抗菌肽在體外不同的環(huán)境中其抗菌活性具有較強的穩(wěn)定性，可通過破壞細菌細胞膜通透性、抑制細菌體分裂、阻礙與細胞分裂相關(guān)的某些蛋白質(zhì)的合成等途徑發(fā)揮抗菌作用；具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對細菌感染有一定的保護作用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的家蠅分泌型抗菌肽的分離方法為將抗菌肽粗提液進行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進一步用反相高效液相色譜純化出兩個抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。
所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲外分泌物粗提液的制備為取三齡家蠅幼蟲置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時，不時振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 具體的分離方法為(1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超純水溶解，檢測該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆茫?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續(xù)將未透過超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測蛋白濃度和抗菌活性；(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過濾，100μl上C18反相色譜柱，流動相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色譜柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脫條件為梯度洗脫，30min內(nèi)己腈濃度從5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波長洗脫峰，即獲得兩個抗菌肽組分。
以上所用的Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱在加樣前預(yù)用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色譜柱為Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
上述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。
上述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細菌感染的藥物或保健品中的應(yīng)用。
上述家蠅分泌型抗菌肽在動物飼料或防腐劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明以家蠅幼蟲體外分泌物為原料，采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，對幼蟲外分泌型抗菌肽的分離、純化及其性質(zhì)進行了研究，并初步探討了該抗菌肽的抑菌機理。同時，將抗菌肽應(yīng)用于正常和感染小鼠，研究其對小鼠免疫功能、血液生化指標(biāo)及重要器官病理變化的影響，為昆蟲抗菌肽的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
一、本發(fā)明抗菌肽的分離純化發(fā)明人通過研究摸索到一條純化時間短、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線首先用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析除掉粗提液中的鹽及小分子雜質(zhì)，透析內(nèi)液進一步用0％-80％的甲醇進行固相萃取梯度洗脫，洗脫組分冷凍干燥濃縮，再經(jīng)30KD超濾管超濾處理，除掉大分子的無活性成分，余下組分進一步用C18反相高效液相色譜純化，最終在15.5min和18.5min處得到兩個活性蛋白峰，紫外吸收光譜分析證明為蛋白肽類物質(zhì)。整個純化過程純化倍數(shù)為27.93倍，活性回收率9.62％。
抗菌肽常常存在于胞漿顆粒中，其分子量較低。一般而言，提取多肽樣品的方法主要有水浸提法、有機溶劑抽提法和有機酸抽提法等。本研究采用的抗菌肽提取方法是基于發(fā)明人的長期摸索，將幾種純化方法進行詳細比較以后得到的較為成熟和簡便的方法。
首先，考慮到家蠅幼蟲分泌物粗提液中除了其分泌的抗菌肽以外，還有許多腸道的一些內(nèi)容物、鹽類和其他小分子物質(zhì)，因此，我們利用截留分子量為3500D的透析袋將粗提液進行透析，以此除掉小分子的雜質(zhì)和鹽類等物質(zhì)。固相萃取是目前對生物分子分離的一種常用方法，本發(fā)明使用的是Sep-Pak C18Cartridge柱，該柱能減少樣品制備的時間，操作簡便，快捷?？赏瓿杉兓?、樣品富積或濃縮、分級分離及溶劑交換等工作。在樣品的分級分離中，根據(jù)分析物極性的不同，采用梯度增加溶劑強度的辦法，選擇性地洗脫和分離分析物。透析以后的幼蟲分泌物經(jīng)固相萃取后，0％、10％、20％、30％組分固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法均沒有顯示抗菌活性，而40％-50％組分活性弱且不穩(wěn)定，僅60％～80％組分具有較強抗菌活性，而且活性非常穩(wěn)定。發(fā)明人前期在摸索固相萃取條件的同時也采用凝膠層析的老方法來分離分泌物抗菌肽，但綜合比較，效果始終不如固相萃取好，主要是后者所需時間長，層析后樣品還需要脫鹽，而且活性的穩(wěn)定性也沒有萃取高，因此，本發(fā)明最終選擇了固相萃取來分離抗菌肽。
超濾是一種膜分離的單元操作，它是利用膜的選擇性，溶液各組分透過膜的遷移率不同而分離，在分離中被傳遞的是溶劑，屬于速率控制的傳質(zhì)過程，具有操作方便，無相變，無化學(xué)變化，處理效率高和節(jié)能等優(yōu)點。發(fā)明人將萃取活性組分合并后，分步使用截留分子量為3KD和30KD的超濾管，發(fā)現(xiàn)活性組分分子量介于3-30KD間，符合前人研究的結(jié)論。
高效液相色譜在生物分子的分離純化中具有獨特的優(yōu)點，為生物分子的分離分析提供了良好的生物兼容性，對復(fù)雜混合物的分離能力強。其分辨率極高，固定相是帶有多孔的微小硅膠顆粒的表面固定上了非極性的C-8或C-18非極性基團，流動相用極性溶液如己腈、甲醇、水或低鹽緩沖液等。被分離組分中極性強的大分子物質(zhì)首先被洗脫，小分子物質(zhì)后被洗脫，而極性小的物質(zhì)則保留時間較長?？咕膶儆跇O性物質(zhì)，易于分配在極性流動相中。
發(fā)明人用瓊脂擴散法和活菌計數(shù)法對本發(fā)明所提取的抗菌肽活性進行檢測發(fā)現(xiàn)，該抗菌肽對條件致病菌如大腸桿菌、致病菌如金黃色葡萄球菌有抑制作用，而且對非條件治病菌枯草芽孢桿菌也有抑制作用，對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抗菌活性無明顯差異，提示其對致病菌和非致病菌的抑制作用可能沒有選擇性。從抑菌結(jié)果來看，首先該抗菌肽對消化道感染菌大腸埃希菌有抑制作用，提示此抗菌肽類物質(zhì)可能有治療大腸埃希菌性消化道疾病及調(diào)節(jié)消化道內(nèi)菌群平衡的作用；其次，它對外傷感染菌如金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等有抑制作用，提示其可以用于預(yù)防和治療禽畜外傷感染，促進傷口愈合。在抗菌肽對多種細菌的抗菌效果檢測中，可以看出對于同種不同株的細菌，作用效果基本相同，但總體而言，該抗菌肽對革蘭氏陰性菌的抗菌效果要好于革蘭氏陽性菌。據(jù)研究，大多已報道的抗菌肽對革蘭氏陰性菌(G-)的抗菌效果強于革蘭氏陽性菌(G+)，這是由于大多數(shù)抗菌肽屬于中性或偏堿性蛋白，能通過與G-菌外膜上的脂多糖等負電物質(zhì)相互作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)以發(fā)揮抗菌作用。而G+菌沒有脂多糖膜，只能通過表面肽聚糖中的胞壁酸、糖醛酸等帶少量負電荷。本發(fā)明提取的抗菌肽對G-的抗菌效果優(yōu)于G+，推測亦屬于中性或偏堿性蛋白。
銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等是臨床上最常見的病原菌，易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致臨床難治性感染。對家蠅抗菌肽進行開發(fā)利用之后，將會對臨床抗感染治療，特別是對耐藥菌感染的治療發(fā)揮重要作用，同時也必將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
二、本發(fā)明抗菌肽的生化特性發(fā)明人參照Hermann Schagger等(1987)和吳冠蕓等的方法進行Tris-TricineSDS-PAGE，檢測了本發(fā)明分離純化所得提純物的純度。以分子量2,512、6,210、8,159、10,700、14,404、16,949Da為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，先測定各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳相對遷移率(Rf)，然后以各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，其Rf值為橫坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，測出未知蛋白的Rf值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該蛋白質(zhì)的分子量。
首先用低分子量的Mark來檢測抗菌活性物質(zhì)的純度，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)最低分子量(14.4KD)條帶稍下有一清晰蛋白條帶，分子量小于14.4KD?？紤]到目的蛋白的分子量偏小，又選用超低分子量Mark再次電泳，發(fā)現(xiàn)該活性組分的主要成分確實在14.4KD稍下，但同時，在8,159D和6,210D間出現(xiàn)了一條顏色較淺的條帶，蛋白含量明顯低于上一條帶。該現(xiàn)象提示，經(jīng)60％-80％甲醇洗脫得到的抗菌活性組分，主要蛋白的分子量為14.4KD以下，即抗菌活性成分不是單一物質(zhì)。測定上述電泳凝膠中各種標(biāo)準(zhǔn)多肽的電泳相對遷移率(Rf)，然后以各種標(biāo)準(zhǔn)多肽分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，其Rf值為橫坐標(biāo)，作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣方法測得家蠅幼蟲分泌物抗菌肽的Rf分別為0.7467和0.9067。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝-1.6959x+5.4173，R＝0.9899)，計算其分子量分別為14157D和7579D。
抗菌肽的胰蛋白酶水解片段的質(zhì)譜分析結(jié)果電泳條帶上抗菌肽I經(jīng)胰蛋白酶水解后，被水解成38個肽段，應(yīng)用肽指紋圖譜技術(shù)，對酶解后隨機選擇的片段進行質(zhì)譜分析。通過Mascot查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫，該抗菌肽與溶菌酶的前體(登陸號qi47117014)的氨基酸序列有一定的同源性，但序列覆蓋率僅為20％，且兩者分子量有明顯差異，質(zhì)譜測定抗菌肽I的精確分子量為14264D，而后者(抗菌肽II)分子量為16179D。
抗菌肽I水解后的肽段1為K.SQQGWTAWSTWK.YLys.Ser-Gln-Gln-Gly-Trp-Thr-Ala-Trp-Ser-Thr-Trp-Lys.Tyr賴氨酸.絲氨酸-谷胺酰胺-谷胺酰胺-甘氨酸-色氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-色氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-色氨酸-賴氨酸.酪氨酸肽段2為K.SELPQWTCIAEHESSYR.TLys.Ser-Glu-Leu-Pro-Gln-Trp-Thr-Cys-Ile-Ala-Glu-His-Glu-Ser-Ser-Tyr-Arg.Thr賴氨酸.絲氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷胺酰胺-色氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-組氨酸-谷氨酸-絲氨酸-絲氨酸-酪氨酸-精氨酸.蘇氨酸抗菌肽I中的其余肽段和抗菌肽II中的肽段正在進一步地研究、測試之中。
通過檢測抗菌肽的抑菌譜，試管稀釋法測定對多株細菌的最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)；觀察在不同pH值、陽離子濃度、動物血清環(huán)境中抗菌肽活性的變化；檢測抗菌肽的凝血及溶血效應(yīng)。結(jié)果表明家蠅分泌型抗菌肽對多株革蘭氏陽性和陰性菌均有很好的抗菌效果，對標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌、傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC是32.74μg/ml，對銅綠色假單胞菌的MIC為16.37μg/ml，對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的MIC為65.48μg/ml。其在中性至弱堿性(pH6-9)條件下抗菌活性較好；一價和二價陽離子對抗菌活性無明顯影響；該抗菌肽在體外既無凝血效應(yīng)亦無溶血效應(yīng)。
三、本發(fā)明抗菌肽的體外抗菌機理通過觀察抗菌肽在最小抑菌濃度(MIC)下大腸埃希菌(ATCC 25922)生長曲線、胞內(nèi)酶含量及菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的變化；透射電鏡觀察抗菌肽形態(tài)變化；流式細胞儀對菌體細胞周期進行分析。結(jié)果提示抗菌肽對大腸埃希菌的抑菌機理可能是1、改變細菌細胞膜的通透性；2、抑制調(diào)控細菌生長、分裂相關(guān)蛋白的合成，阻礙其分裂和生長。
四、本發(fā)明抗菌肽對小鼠免疫功能的影響檢測巨噬細胞功能和胸腺、脾臟重量是觀察藥物對整體免疫影響的重要指標(biāo)。發(fā)明人在對家蠅幼蟲分泌物抗菌肽體外抗菌實驗有效的前提下，檢測了抗菌肽體內(nèi)對小鼠免疫功能的影響，為進一步探明抗菌肽在天然免疫中的作用提供了實驗依據(jù)。
為探討抗菌肽對正常小鼠免疫功能的影響，以小白鼠為試驗動物，分別采用不同濃度(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)研究了抗菌肽對小白鼠免疫器官指數(shù)、非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響。結(jié)果表明1、10mg/kg.d和20mg/kg.d的抗菌肽量對小鼠體重?zé)o明顯影響，但對胸腺和脾臟生長有一定的促進作用，其中，中、高劑量組明顯高于對照組。說明抗菌肽能促進免疫器官的生長，提高免疫器官指數(shù)。2、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞和碳粒廓清實驗中，抗菌肽中、高劑量組巨噬細胞吞噬指數(shù)、吞噬百分數(shù)及小鼠碳粒廓清指數(shù)均明顯高于對照組。說明抗菌肽具有提高小鼠機體的非特異性免疫的功能。3、抗菌肽中、高劑量能增強ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)等細胞免疫功能來提高機體的特異性防御能力。
(一)抗菌肽的安全性評價以小白鼠為試驗動物，采用改良寇氏法，計算該抗菌肽的半數(shù)致死量(LD50)，但最大給藥量為200mg/kg.d動物均無中毒及死亡現(xiàn)象，提示該劑量下抗菌肽為基本無毒。以實驗兔為對象，采用熱源性試驗法和刺激性試驗法對抗菌肽進行熱原和刺激性檢查，結(jié)果表明，該抗菌肽無熱源性和刺激性，以腹腔注射方法給藥是安全的。
(二)抗菌肽對小鼠非特異性免疫功能的影響1.抗菌肽對小鼠體重及免疫器官指數(shù)的影響抗菌肽低劑量組(5mg/kg)小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與對照組相比，分別提高了5％和18％，體重降低了3％，但無顯著性差異(P＞0.05)。中劑量組和高劑量組(10mg/kg和20mg/kg)小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與對照組相比明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異有顯著性(P＜0.05)，即抗菌肽對小鼠的胸腺、脾臟有一定的促生長作用，能明顯提高小鼠的免疫器官重量，此作用有一定的量效關(guān)系，隨著用量增加而重量增加。實驗組小鼠的體重較對照組稍低一些，尤其是實驗組I，但采用配對T檢驗對實驗組和對照組的體重進行差異顯著性檢驗，得P＞0.05，故抗菌肽低、中、高劑量組小鼠的體重與對照組相比無顯著性差異。

2.抗菌肽對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響由下表可知，抗菌肽低劑量對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力沒有提升作用，但中、高劑量則可明顯提高腹腔巨噬細胞的吞噬百分數(shù)、吞噬指數(shù)。同時，低、中、高劑量的抗菌肽均能提高小鼠的碳粒廓清指數(shù)K和α，其中，以中、高劑量組效果較為明顯。
抗菌肽對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

抗菌肽對小鼠碳粒廓清活性的影響

*表示與生理鹽水組比較差異顯著性(P＜0.05)，**表示與生理鹽水組比較差異極顯著(P＜0.01)。
3.抗菌肽對脾臟ACP活性的影響抗菌肽低劑量組小鼠脾臟ACP活性為213.75±29.27，對照組為186.66±17.16兩組相比P＞0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。中高劑量抗菌肽組小鼠脾臟ACP活性分別為268.60±36.64和270.48±54.63，與對照組及低劑量組相比，P值均＜0.05，差異有顯著性。提示中高劑量的抗菌肽作用后，能提高小鼠脾臟ACP的活性。
4.抗菌肽對小鼠血清溶菌酶活性的影響抗菌肽對小鼠血清溶菌酶含量的影響

(三)抗菌肽對小鼠特異性免疫功能的影響1.實驗結(jié)果1.1抗菌肽對小鼠脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，抗菌肽低、中、高劑量組能顯著增強ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞增殖能力(見下表)，其中以中、高劑量組增強效果較好，提示5-20mg/kg的抗菌肽對小鼠細胞免疫功能均有增強作用。
抗菌肽對小鼠脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響

1.2利用耳腫脹法測定了二硝基氟苯(DNFB)對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明抗菌肽中高劑量組顯著增強小鼠對DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)(見下表)。
抗菌肽對DNFB致小鼠DTH反應(yīng)的影響

1.3抗菌肽對小鼠血清溶血素的影響結(jié)果見表，各實驗組和對照組間血清溶血素比較差異沒有顯著性，提示抗菌肽的使用對小鼠血清溶血素沒有明顯影響。
抗菌肽對小鼠血清溶血素的影響

2結(jié)論2.1免疫器官指數(shù)脾臟和胸腺是動物的重要免疫器官。由于機體內(nèi)的免疫細胞大多數(shù)分布于胸腺和脾臟中，成年動物的胸腺重量逐漸下降。因此，脾臟與胸腺重量增高，則相對的表明機體的免疫功能增強。胸腺是產(chǎn)生免疫的中樞淋巴器官，是T淋巴細胞分化成熟的場所，T淋巴細胞主要參與機體的細胞免疫功能，在機體自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中起主導(dǎo)作用。脾臟是體內(nèi)最大的淋巴器官，其免疫細胞中以B淋巴細胞為主(約占50％-60％)，B淋巴細胞主要參與體液免疫。此外，脾臟還能清除自身衰老的血細胞和免疫復(fù)合物。免疫器官的重量在一定程度上可以反映器官內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量，從而間接了解體內(nèi)淋巴細胞的總體水平。如果兩者的系數(shù)都增加，說明藥物對細胞免疫和體液免疫都有促進作用。
本實驗結(jié)果顯示，抗菌肽中高劑量對小鼠的免疫器官指數(shù)均有明顯的增高，從一定程度上反映了本發(fā)明抗菌肽可以增強動物的免疫功能。從不同劑量的抗菌肽作用結(jié)果來看，抗菌肽的增強免疫作用有一定劑量依賴性，低劑量效果不明顯，隨著劑量的增加，免疫器官指數(shù)增高明顯，但并非高劑量效果總是強于中劑量。
2.2巨噬細胞吞噬功能巨噬細胞是一種非特異性免疫細胞，它能吞噬和消滅外來異物及自身衰老死亡的細胞。此外，它在免疫反應(yīng)中還起到了處理抗原，傳遞抗原信息，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等重要作用。巨噬細胞功能的測定采用對碳粒廓清吞噬能力和吞噬雞紅細胞能力的檢測。
碳粒廓清能力的大小是評價機體非特異免疫功能重要指標(biāo)。吞噬顆粒狀異物是單核-巨噬細胞系統(tǒng)的重要功能。肝臟和脾臟是執(zhí)行此功能的主要器官，肝枯否氏細胞占吞噬量的90％，脾臟細胞占10％左右。向血液中注射一定量的碳粒懸液，其在血液中的清除速率反映了本系統(tǒng)細胞吞噬功能的狀態(tài)。在一定濃度范圍內(nèi)，碳粒的清除速率與其劑量呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，即吞噬速率與血碳濃度成正比，而與已吞噬的碳顆粒成反比。廓清指數(shù)K反映的是碳粒清除速率。而單核-巨噬細胞系統(tǒng)一旦被激活，常伴有肝、脾Mφ增生，吞噬指數(shù)α以單位重量組織的吞噬活性為評價標(biāo)準(zhǔn)，排除了增生因素的影響，只評價吞噬細胞功能的活躍程度。小鼠尾靜脈注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝、脾等器官內(nèi)皮網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬而使其血漿濃度下降，因此其廓清率間接反映單核巨噬細胞系統(tǒng)的的吞噬功能。
本研究的結(jié)果顯示，抗菌肽中高劑量可以明顯提高小鼠的廓清指數(shù)，而低劑量組雖然對吞噬雞紅細胞能力有所提高，但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)上的意義(P＞0.05)。小鼠碳粒廓清實驗和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗，雖然都能反應(yīng)機體免疫系統(tǒng)的吞噬功能，但因二者實驗方法不同，免疫作用的場所也不一樣，被吞噬異物的種類不同，引起吞噬細胞游走及殺滅異物的機理也不同，本實驗中兩者結(jié)果基本相符，提示抗菌肽可以增強小鼠的非特異性免疫功能。
2.3脾臟ACP的活性巨噬細胞消化率的強弱，主要由巨噬細胞內(nèi)溶酶體數(shù)量及其幾十種酶含量的多少來決定，其中，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體的標(biāo)志酶，在消化異物及細胞代謝方面起著重要作用。ACP活性的增強是巨噬細胞激活的一個主要標(biāo)志。增強巨噬細胞的吞噬消化功能，就意味著提高機體的非特異性免疫力。巨噬細胞與淋巴細胞關(guān)系密切，前者具有攝取抗原的功能，而后者不易直接攝取抗原，通過巨噬細胞來傳遞抗原的免疫信息。因此，巨噬細胞在機體抵抗病原入侵的過程中發(fā)揮著重要作用，其處理抗原作用的強弱，可影響到機體的特異性免疫。
脾臟是機體最大的淋巴器官，其中的巨噬細胞來源于骨髓中的髓樣干細胞，通過血流不斷流入，稱為游走和固定巨噬細胞。血液中的單核細胞進入脾臟，在局部微環(huán)境的影響下分化成熟，成為巨噬細胞。巨噬細胞體積增大，細胞表面脊?fàn)钔黄鹪龆啵麅?nèi)有完善的細胞器，且溶酶體、線粒體增多，通過吞噬和細胞內(nèi)殺傷而發(fā)揮抗感染作用，但只有活化的巨噬細胞才有強大的殺滅能力。本實驗選擇了脾臟中的標(biāo)志酶ACP的活性來觀察巨噬細胞活性的高低，從而進一步估計機體非特異性免疫功能的強弱。
本實驗結(jié)果顯示，中劑量和高劑量的抗菌肽對正常小鼠脾臟ACP活性均顯著提高，分別比對照組提高了43％和44％，說明二者都能增強正常小鼠脾臟中巨噬細胞的活性，從而促進小鼠的非特異性免疫功能。
2.4溶菌酶的活力小鼠巨噬細胞吞噬的外源性物質(zhì)在細胞內(nèi)消化分解主要是依靠胞內(nèi)的酶系統(tǒng)來完成，溶菌酶就是這個酶系統(tǒng)中具有重要作用的酶之一。
小鼠經(jīng)卡介苗(BCG)免疫后血清溶菌酶水平明顯升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清溶菌酶活性達高峰時，經(jīng)金黃色葡萄球菌感染的小鼠死亡率最低，說明血清溶菌酶水平同抗感染力有一定的關(guān)系。溶菌酶除了在抗菌方面有重要作用外，還能夠激活單核細胞，增加PMNS和巨噬細胞的吞噬功能及巨噬細胞的抗原呈遞功能。
因此，本發(fā)明家蠅幼蟲分泌物抗菌肽增強吞噬細胞的吞噬功能可能是多種原因綜合作用的結(jié)果，其途徑可能是①激活巨噬細胞；②促進功能細胞分泌溶菌酶；③提高溶菌酶的活性等。
2.5脾T淋巴細胞增殖能力脾臟是機體最大的外周免疫器官，也是T、B淋巴細胞定居和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所，以刀豆蛋白A(ConA)為代表的有絲分裂原能非特異性的誘導(dǎo)T淋巴細胞活化，導(dǎo)致細胞因子合成，細胞因子受體表達及最終活化增殖。T淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受ConA等刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，進而轉(zhuǎn)化為較大的淋巴母細胞。轉(zhuǎn)化率的高低反應(yīng)機體細胞免疫水平。ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗中，T淋巴細胞受ConA刺激后發(fā)生母細胞轉(zhuǎn)化，活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解酶可將MTT(一種淡黃色的唑氮鹽)分解為藍紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值的變化能反應(yīng)細胞的增殖情況。從實驗結(jié)果可知，各劑量組都有不同程度的提高T淋巴細胞增殖能力的作用，以中高劑量組效果較明顯。
2.6遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)即T淋巴細胞受抗原刺激后，分化為特異性的致敏淋巴細胞，當(dāng)有相同抗原再次侵入時，引起局部致敏淋巴細胞釋放出多種淋巴因子，導(dǎo)致以單核細胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚紅腫，硬結(jié)。炎癥反應(yīng)的程度可以衡量機體對該抗原特異性細胞免疫力的大小。
2.7血清溶血素的測定血清溶血素是檢測機體體液免疫功能的一個指標(biāo)，是抗體生成細胞檢測試驗之一。用抗原(SRBC)免疫動物后，B淋巴細胞受到SRBC刺激后，分化為漿細胞，漿細胞產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素)，當(dāng)再次與SRBC一起孵育，在補體的參與下，可使羊紅細胞發(fā)生溶血反應(yīng)，并釋放血紅蛋白。Yasuji等從中國柞蠶中提取的抗菌肽D，能促進鼠造血細胞的生長、功能與分化作用，還能調(diào)節(jié)淋巴細胞DNA的合成，以及粒性白細胞和巨噬細胞的群體形成，也能應(yīng)能影響B(tài)細胞抗體的產(chǎn)量。
本實驗結(jié)果顯示，抗菌肽對小鼠血清溶血素的含量沒有明顯的影響。
總結(jié)上述結(jié)果，本發(fā)明家蠅幼蟲分泌物抗菌肽能顯著增強正常小鼠非特異性免疫功能，并有利于調(diào)節(jié)免疫平衡。
五、本發(fā)明抗菌肽對細菌感染小鼠的干預(yù)性研究本實驗利用大腸埃希菌感染小鼠的疾病動物模型，從家蠅幼蟲分泌物抗菌肽干預(yù)后動物的生理、生化及病理變化等幾個角度初步研究了抗菌肽的體內(nèi)作用，為抗菌肽在動物體內(nèi)的作用提供了實驗依據(jù)。
通過建立小鼠腹腔感染大腸埃希菌的動物模型，按抗菌肽預(yù)防性干預(yù)組(感染前3天預(yù)防性給抗菌肽10mg/kg.d)、治療性干預(yù)組(感染后予抗菌肽10mg/kg)和對照組(予生理鹽水)給不同處理。首先，觀察感染后動物的一般情況，檢測感染后不同時間段(4h、8h、12h、24h)腹腔液細菌計數(shù)；其次，檢測小鼠血清內(nèi)毒素、溶菌酶、一氧化氮(NO)含量，小鼠外周血TNF-α、IL-6等細胞因子水平；最后，比較了各組小鼠肝、肺、腎等重要臟器的病理形態(tài)學(xué)變化。
(一)抗菌肽對細菌感染小鼠血清TNF-α、IL-6、NO、內(nèi)毒素水平的影響1.抗菌肽對細菌感染小鼠細胞因子的影響細菌感染小鼠后，4h內(nèi)血清TNF-α的含量急劇上升，從正常小鼠的23.3pg/ml增加到158.56pg/ml，而給予家蠅幼蟲抗菌肽后，TNF-α含量均有不同程度的下降，尤其以預(yù)防性給藥組較為明顯，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，各時間段的TNF-α含量與模型組相比差異均有顯著性(P＜0.05)。
抗菌肽對小鼠血清TNF-α含量的影響

抗菌肽對小鼠血清IL-6含量的影響

2.抗菌肽對小鼠血清NO含量的影響抗菌肽對小鼠血清NO含量的影響

3.抗菌肽對小鼠血清內(nèi)毒素含量的影響抗菌肽對小鼠血清內(nèi)毒素含量的影響

(二)抗菌肽對小鼠腹腔液細菌數(shù)及器官組織結(jié)構(gòu)的影響
1.腹腔液細菌計數(shù)給細菌后4h，模型組小鼠腹腔液菌落計數(shù)可達4949CFU/μl，12h后降低為1594CFU/μl，而同期預(yù)防性和治療性給抗菌肽組小鼠的細菌數(shù)明顯少于模型組，其中以預(yù)防性給藥組效果尤為明顯，兩者與模型組相比較均P＜0.01，差異有極顯著性。
抗菌肽對細菌感染小鼠腹腔液細菌數(shù)的影響

本實驗結(jié)果顯示，感染細菌后，模型組小鼠腹腔液細菌量從4h的4949CFU/μl，降到12h的1594CFU/μl，說明小鼠依靠自身的免疫力可以消滅一定的細菌，而抗菌肽組小鼠的細菌量明顯低于模型組，提示腹腔給予抗菌肽后，抗菌肽在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了一定的抗細菌作用，可以殺滅細菌或抑制細菌繁殖，這個作用與機體的自身免疫力結(jié)合，最終增強了機體殺菌的功效。預(yù)防性給藥組小鼠的細菌量最少，可能是因為感染前給予的抗菌肽在一定程度上提高了機體的抗感染能力所致。
2.各組小鼠肺組織學(xué)的變化大腸埃希菌感染8h后，小鼠肺泡隔增厚，有炎癥細胞浸潤，可見肺組織淤血、出血及肺氣腫；感染后24h，小鼠肺組織損傷更加明顯，肺泡間隔明顯增厚，有大量炎癥細胞浸潤，可見明顯的肺出血及肺氣腫。抗菌肽預(yù)防組，小鼠肺泡也有炎癥細胞浸潤，肺泡隔有一定程度的增厚，但均較模型組明顯減輕，治療性給抗菌肽組炎癥程度介于抗菌肽預(yù)防組及模型組之間。
對器官組織結(jié)構(gòu)進行觀察結(jié)果顯示，家蠅幼蟲分泌物抗菌肽減輕了細菌內(nèi)毒素引起的肺、肝的組織損傷。
上述實驗結(jié)果表明對感染小鼠予抗菌肽干預(yù)后，能減少腹腔液的細菌數(shù)量，以預(yù)防性給藥后效果較好。同時抗菌肽能降低感染小鼠血清TNF-a、IL-6、NO、內(nèi)毒素含量；還可以在不同程度上降低感染對重要臟器的損害。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用透析、固相萃取、超濾和反相高效液相色譜方法分離純化家蠅幼蟲分泌型抗菌肽，提供了一條簡便、快捷、高效、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線，使抗菌肽制備時間縮短，提高了分離純化的效率。而且該抗菌肽具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對細菌感染有一定的保護作用，為抗菌肽在制備藥物、保健品以及動物飼料或防腐劑中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例1取三齡家蠅幼蟲置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時，不時振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆?1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)固相萃取Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱用4ml甲醇活化后，4ml0.05％三氟乙酸平衡。取透析后抗菌肽粗提液1.5ml上柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超純水溶解，檢測該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離，透過超濾管的部分為分子量小于3KD的組分；繼續(xù)將未透過超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測蛋白濃度和抗菌活性。(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過濾，100μl上C18反相色譜柱(Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm)。流動相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色譜柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脫條件如下梯度洗脫，30min內(nèi)己腈濃度由5％上升至60％，流速1ml/min，手工收集214nm波長洗脫峰，即獲得兩個抗菌肽組分。所得抗菌肽經(jīng)凍干之后為白色粉末狀固體。
本發(fā)明的實施例2將實施例1所得的抗菌肽1g和市獸的普通肉雞飼料1Kg混合，每天喂養(yǎng)肉雞2-3次，連續(xù)喂養(yǎng)30天，與添加中草藥抗生素喂養(yǎng)的肉雞相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面差異均無顯著性，表明本發(fā)明抗菌肽有促進生長和提高免疫力的作用。
本發(fā)明的實施例3將實施例1所得的抗菌肽1g和市獸的肉豬飼料1Kg混合，每天喂養(yǎng)肉豬23次，連續(xù)喂養(yǎng)30天，與添加中草藥抗生素飼料喂養(yǎng)的肉豬相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面差異均無顯著性。
本發(fā)明的實施例4將實施例1所得的抗菌肽用蒸餾水溶解后，加入食用表面活性劑溶液，完全溶解，用泵定量加入到高剪切攪拌的去離子水中，然后攪拌成熟，過濾，得到乳化液，該乳化液可作為防腐劑應(yīng)用于食品、藥品等的防腐。
本發(fā)明的實施例5本發(fā)明抗菌肽20％、羥基酯類防腐劑1％、聚乙二醇400或丙二醇2.5％、氯化鈉0.6％、余量為水(所述百分比均為重量百分比)取羥基酯類防腐劑溶解于適量水中，加熱至45℃左右使之全部溶解；再加入聚乙二醇400或丙二醇、氯化鈉，攪拌使全部溶解，高溫滅菌，制成輔料溶液；將實施例1所得的抗菌肽加入輔料溶液中，添加水至全量，混勻，分裝于定量噴霧器中，即得噴霧制劑。該制劑可用于治療外傷感染。
權(quán)利要求
1.一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于將抗菌肽粗提液進行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進一步用反相高效液相色譜純化出兩個抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。
2.按照權(quán)利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲外分泌物粗提液的制備為取三齡家蠅幼蟲置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時，不時振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.按照權(quán)利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于(1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇和三氟乙酸后，超純水溶解，檢測該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液20℃保存?zhèn)溆茫?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續(xù)將未透過超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測蛋白濃度和抗菌活性；(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過濾，100μl上C18反相色譜柱，流動相A0.1％三氟乙酸-水溶液；B0.1％三氟乙酸-甲醇溶液；色譜柱用5％甲醇-0.1％三氟乙酸溶液平衡，洗脫條件為梯度洗脫，30min內(nèi)已腈濃度從5％上升到60％；流速1ml/min，手工收集214nm波長洗脫峰，即獲得兩個抗菌肽組分。
4.按照權(quán)利要求3所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于所用的Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱在加樣前預(yù)用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色譜柱為Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。
6.如權(quán)利要求5所述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細菌感染的藥物或保健品中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述家蠅分泌型抗菌肽在動物飼料或防腐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，將抗菌肽粗提液進行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進一步用反相高效液相色譜純化出兩個抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。本發(fā)明提供了一條簡便、快捷、高效、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線，使抗菌肽制備時間縮短，提高了分離純化的效率。而且經(jīng)實驗證明該抗菌肽具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對細菌感染有一定的保護作用，為抗菌肽在制備藥物、保健品以及動物飼料或防腐劑中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/00GK101054408SQ20071020037
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者吳建偉, 國果, 宋智魁, 付萍, 秦容貴, 張勇 申請人:貴陽醫(yī)學(xué)院