專利名稱：一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法
一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于Fab抗體及其制備領(lǐng)域,特別涉及一種抗多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(mult1-drug resistance, MDR)多為獲得性耐藥，即在治療前對藥物敏感，治療后對藥物耐受。多藥耐藥性是指不僅對使用藥物產(chǎn)生耐受，而且對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐受。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的最主要原因是瘤細(xì)胞膜過量表達(dá)一種ATP依賴性外排性泵，以減少化療藥物在細(xì)胞內(nèi)部的積累。這種ATP依賴性外排性泵屬于ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族,主要包括以下幾種(I)腫瘤多藥耐藥蛋白Ι/P-糖蛋白即為P-gp (Mult1-Drug Resistancel/ P-glycoprotein, MDRl/P-gp)也稱為 ABCBl (ATP-binding cassette BI)，它是 1976 年 Juliano等在耐藥的中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后Roninson等獲得人耐藥KB癌細(xì)胞株的MDRl基因序列[1]，P-gp也是現(xiàn)在引起腫瘤多藥耐藥性最常見的原因。(2)多藥耐藥相關(guān)蛋白(3)乳癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP) (4)肺耐藥相關(guān)蛋白(Lung resistance related protein, LRP)。
P-gp是引起腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的最主要原因，由多藥耐藥蛋白基因 I (mult1-drug resistancel,mdrl)編碼為兩個(gè)完全相同的單體組成,每個(gè)單體含有一個(gè)七次跨膜疏水區(qū)和一個(gè)ATP結(jié)合區(qū)，兩個(gè)單體組合成一個(gè)能量依賴性泵位于細(xì)胞膜上。P-gp 在分解ATP供給能量的同時(shí)，可以將腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的親脂性化學(xué)藥物排到細(xì)胞外，因此一些親脂性藥物可以競爭性抑制P-gp外排化療藥物的功能。P-gp誘導(dǎo)的多藥耐藥腫瘤中同時(shí)檢測到高水平的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC主要通過磷酸化P_gp藥物結(jié)合位點(diǎn)的絲氨酸而增強(qiáng)其外排化療藥物的功能。
第一代P-gp抑制劑為親脂性化合物，如維拉帕米、奎尼丁、環(huán)孢素A等，可作為 P-gp底物，與化療藥物競爭性或非競爭性結(jié)合P-gp，從而減少化療藥物外排。但是當(dāng)它們的應(yīng)用劑量達(dá)到抑制P-gp功能時(shí)有很強(qiáng)的毒副作用，這也限制了它們的臨床應(yīng)用。接著第二代P-gp抑制劑出現(xiàn)，如PSC-833 (環(huán)孢素D衍生物)和Biricodar,它們與P-gp的親和力更強(qiáng)，并且沒有免疫抑制副作用；但是它們?nèi)狈μ禺愋?，同樣抑制正常組織P-gp功能，而且還抑制細(xì)胞色素P450 3A的功能進(jìn)而影響藥物代謝，因此它們的研發(fā)也受到限制。于是以tariquidar、0C144-093、zosuquidar、elacridar為代表的第三代P-gp抑制藥物應(yīng)運(yùn)而生，它們對P-gp親和力高，而且對依賴細(xì)胞色素P450 3A的藥物代謝影響很小，然而它們在達(dá)到抑制P-gp功能劑量時(shí)，仍有一定的細(xì)胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代 P-gp抑制藥物還處于臨床試驗(yàn)階段。
臨床腫瘤出現(xiàn)多 藥耐藥性多與P-gp有關(guān)，它已成為腫瘤化療的最主要障礙之一。 通過競爭性或非競爭性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的主要手段，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，制備一種更特異的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物，在保證化療藥物抑制腫瘤組織生長的同時(shí)對機(jī)體正常生理代謝的影響降到最低成為可能。單克隆抗體用于抑制腫瘤多藥耐藥性有很多優(yōu)點(diǎn)如可以特異性的結(jié)合P-gp抗原表位，不會影響細(xì)胞色素P450 3A依賴的藥物代謝，小分子人源抗體在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中， 既不會引起機(jī)體變態(tài)性免疫反應(yīng)，又因?yàn)榉肿恿啃≡隗w內(nèi)代謝快，對正常組織細(xì)胞影響小， 有助于耐藥瘤細(xì)胞的化療等。但是，到目前為之還沒有抗P-gp單克隆抗體作為抑制腫瘤多藥耐藥的藥物。
噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌體結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，并與結(jié)構(gòu)基因融合表達(dá)于噬菌體外膜表面。現(xiàn)在噬菌體展示系統(tǒng)有多種，如絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、Τ4噬菌體展示系統(tǒng)等。
絲狀噬菌體展示系統(tǒng)有很多種，Μ13絲狀噬菌體展示系統(tǒng)為其中一種，Μ13絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中的Μ13噬菌體呈長絲狀，直徑6. 5nm，長約900nm，內(nèi)含單鏈DNA基因組 (6，407個(gè)核苷酸)，被一層長圓柱狀核衣殼保護(hù)著，長圓柱狀核衣殼主要由gp8蛋白組成， 噬菌體的兩端為約3 5拷貝的gp3、gp6、gp7、gp9組成。M13噬菌體為溫和型噬菌體，感染萬.coli XLl-blue菌后，細(xì)菌生長緩慢，但不會導(dǎo)致細(xì)菌裂解，噬菌體以出芽的方式從宿主細(xì)胞中釋放。M13噬菌體展示系統(tǒng)也主要有2類(I)外源蛋白與主要核衣殼蛋白gp8融合表達(dá)，(2)外源蛋白與gp3蛋白融合表達(dá)。外源蛋白與gp8融合表達(dá)可以獲得高拷貝的外源蛋白，對外源蛋白起了放大作用，但過量的外源蛋白可能阻礙噬菌體再次侵染宿主菌，反而不利于淘選鑒定；外源蛋白與gp3蛋白融合表達(dá)，每個(gè)噬菌體攜帶有3 5拷貝的外源蛋白，對噬菌體結(jié)構(gòu)影響較小，有利于應(yīng)用到淘選鑒定中，獲得相對高親和力的抗體或受體。
噬菌體展示技術(shù)是一種將基因型和表型統(tǒng)一起來的基因工程技術(shù)，即淘選獲得目的蛋白的同時(shí)可得到該蛋白的基因序列。現(xiàn)在M13噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)須包括以下三個(gè)要素?cái)y帶噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白基因(最常用gp3)的噬菌粒載體、輔助M13噬菌體、帶F性菌毛 E. coli。首先將目的基因片段克隆到噬菌粒載體上，并轉(zhuǎn)化進(jìn)帶F性菌毛的疋coli宿主中；然后輔助M13噬菌體通過其一端由gp3、gp6、gp7組成的配體結(jié)構(gòu)與宿主菌F性菌毛結(jié)合，逐漸將其基因組釋放到宿主菌中；噬菌體在宿主菌內(nèi)復(fù)制，同時(shí)噬菌粒載體也表達(dá)與外源蛋白融合的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，噬菌體核衣殼便錯(cuò)誤地將噬菌粒載體包裝進(jìn)去，這種錯(cuò)誤包裝的噬菌體可以再次感染疋宿主菌，但不能再次擴(kuò)增出新的噬菌體。通過對釋放出的噬菌粒反復(fù)的“親和-洗脫-擴(kuò)增”過程，最終獲得表達(dá)目的蛋白的基因克隆，即完成表型與基因型的統(tǒng)一。
現(xiàn)在M13噬菌體展示技術(shù)在淘選特異性的單克隆抗體得到廣泛的應(yīng)用，近年來利用噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功制備了各種單鏈抗體、Fab抗體以及完整IgG抗體。噬菌體展示技術(shù)在制備淘選單克隆抗體方面相對于雜交瘤技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)容易實(shí)現(xiàn)高通量淘選、 可以制備小分子量亞單位單克隆抗體、獲得的抗體克隆株更容易長期保存、易于實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)等，因此噬菌體展示技術(shù)在單克隆抗體淘選和制備中引起重大變革。在構(gòu)建M13噬菌體抗體庫過程中最常用到pComb3載體及XLl-blue宿主菌，pComb3載體具有氨節(jié)青霉素抗性并且含有兩個(gè)克隆位點(diǎn)位于gp3基因上游的IgG重鏈克隆位點(diǎn)和單獨(dú)的輕鏈克隆位點(diǎn)； XLl-blue宿主菌具有四環(huán)素抗性，本身具有F性菌毛，可被M13噬菌體感染。
M13噬菌體 展示技術(shù)操作簡便，常用于分子生物學(xué)研究中，它不僅可以進(jìn)行高通量的抗體淘選，在研究蛋白質(zhì)之間相互作用方面也有獨(dú)到的優(yōu)勢，并且在以后研究藥物作用靶點(diǎn)、疾病的分子病理機(jī)制等方面將發(fā)揮越來越重要的作用。
通過競爭性或非競爭性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的主要手段，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用M13噬菌體展示技術(shù)制備一種更特異的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物，在保證化療藥物抑制腫瘤組織生長的同時(shí)對機(jī)體正常生理代謝的影響降到最低成為可能。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用M13噬菌體展示技術(shù)獲得特異性抗人P-gp跨膜區(qū) (氨基酸784 968)的Fab抗體克隆，及其制備方法。本發(fā)明為監(jiān)測因P_gp引起的腫瘤多藥耐藥的發(fā)生、研究P-gp跨膜區(qū)(氨基酸784 968)的功能以及制備抑制腫瘤多藥耐藥的抗體藥物提供可能。
本發(fā)明為人P-gp跨膜區(qū)氨基酸784 968的Fab抗體蛋白(以下簡稱為PFab29 抗體)，其輕鏈的基因序列具有SEQ ID No.1的序列，其輕鏈基因編碼的氨基酸序列具有SEQ ID No. 2的序列,其重鏈的基因序列具有SEQ ID No. 3的序列,其重鏈基因編碼的氣基酸序列具有SEQ ID No. 4的序列。
本發(fā)明PFab29抗體的制備方法如下(I)提取多藥耐藥人大腸癌組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物，序列如下
權(quán)利要求
1.一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體，其特征在于基因全序列見序列表SEQ ID No. 1,3。
2.如權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于輕鏈基因的序列全長為635bp，序列見序列表 SEQ ID No.1。
3.如權(quán)利要求2所述的序列，其特征在于輕鏈基因所編碼的多肽為211個(gè)氨基酸，見序列表 SEQ ID No. 2。
4.如權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于重鏈基因的序列全長為696bp，序列見序列表 SEQ ID No. 3。
5.如權(quán)利要求4所述的序列，其特征在于重鏈鏈基因所編碼的多肽為232個(gè)氨基酸， 見序列表SEQ ID No. 4ο
6.—種權(quán)利要求1所述的抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體的制備方法如下(1)提取多藥耐藥人大腸癌組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物，序列如下Sense primer CCGGAATTCCTCACCAAGCGGCTCCGAT ；Ant1-sense primer CCGCTCGAGGAGTTTATGTGCCACCAAGTAG ；上游(5'端)引物引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游(3'端)引物引入Xho I酶切位點(diǎn)，合成引物，利用設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的基因片段JfpET28a(+)載體和P_gp784_968目的基因分別進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，然后凝膠回收并定量；(2)pET28a(+)載體與P_gp784_968目的基因連接，熱激轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞涂布 LB/Kan (卡那霉素)平板，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行Xho1、EcoR I雙酶切鑒定，選擇酶切結(jié)果陽性的克隆，測序，見序列表SEQ ID No. 5的序列；(3)取鑒定正確的陽性克隆P_gp784_968菌液，于LB/Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化，得P_gP784-968蛋白，見序列表SEQ ID No. 6的序列，備用；(4)另取多藥耐藥性大腸癌病理組織，免疫小鼠，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定抗體滴度抗體滴度大于1:512，提取總RNA并在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；以cDNA為模板， PCR法擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR，設(shè)計(jì)17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物及20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物，序列見SEQ ID No. 7-50，其中重鏈Y引物引入Xho I酶切位點(diǎn)3'引物引入Spe I酶切位點(diǎn)，輕鏈5'引物引入Sac I酶切位點(diǎn)，3'引物引入Xba I酶切位點(diǎn)；(5)將載體pComb3質(zhì)粒與重鏈Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行Xho1、Spe I雙酶切并連接， 連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，得到重鏈Fd-pComb3庫質(zhì)粒，將輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與 T載體連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，得到輕鏈T-L庫質(zhì)粒，重鏈Fd-pComb3 庫質(zhì)粒與輕鏈T-L庫質(zhì)粒分別進(jìn)行Xba1、Sac I雙酶切，連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至 XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，得到Fab抗體庫；(6)取Fab抗體庫，加入噬菌體VCSM13，振蕩培養(yǎng)，得到Fab噬菌體抗體庫，備用；(7)用純化后的P_gp784-968蛋白包被ELISA板，對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行淘選，經(jīng)過五輪淘選后，提取陽性克隆質(zhì)粒，分別進(jìn)行Xba I ,Sac I和Xho I ,Spe I雙酶切鑒定，得酶切鑒定后的Fab抗體克隆株；(8)取酶切鑒定后的Fab抗體克隆株，F(xiàn)ab抗體克隆株加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物分別以高表達(dá)P-gp的大腸癌組織勻漿液以及原核表達(dá)的P_gP784-968肽段為抗原行Elisa檢測，兩項(xiàng)檢測一致、讀值最高的克隆再行westernblot鑒定；提取雙重鑒定均為陽性的克隆株質(zhì)粒，Spel/Nhel雙酶切后連接，重新轉(zhuǎn)熱激轉(zhuǎn)化XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞，獲得鼠源抗人大腸癌P_gP784-968的Fab抗體克隆株P(guān)Fab29，測序所表達(dá)的抗體為IgG2a亞型，見序列SEQ IDNo. 1，3。
7.權(quán)利要求1所述的抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體在制備抑制腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法，屬于抗體及其制備領(lǐng)域；本發(fā)明為取多藥耐藥性大腸癌病理組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增出P-gp跨膜區(qū)(氨基酸784～968)基因片段，克隆至pET28a(+)載體并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后WesternBlot鑒定。將純化的P-gp784-968蛋白作為抗原，對利用17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物；20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物，用原核表達(dá)的P-gp784-968肽段對pComb3載體的P-gpFab抗體庫進(jìn)行五輪淘選，最終淘選所獲得的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過ELISA及WesternBlot鑒定后獲得陽性克隆菌株，并測序，得PFab29。本發(fā)明為制備抑制腫瘤多藥耐藥的藥物提供可能。
文檔編號A61K39/395GK103044547SQ20121037925
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者張學(xué)梅, 張海玉, 王清, 李俊 申請人:大連大學(xué)