專利名稱：：預(yù)防性結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(complex)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合!^(MrB-C廣弓胞的一種慢性感染性疾病，戶腿結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群目前包括結(jié)核分枝桿菌(M/w6ercw/a^J、牛分支桿斷MBo—、田鼠分支桿菌(M附/cro^^^瞎'卜l:^支桿菌(AfW/c麵附入根據(jù)世界衛(wèi)生組織，世界范圍內(nèi)每年記錄感染該疾病的新增病例約為8,000,000例，約3，000，000人死亡。認(rèn)為世界范圍內(nèi)現(xiàn)有皿2,000，000，000的人感染，每年產(chǎn)生新的感染數(shù)約為9千萬-l億。現(xiàn)有用于預(yù)防治療結(jié)核的疫苗是基于菌株BCG(卡介節(jié)的，其是牛分支桿菌的一種減毒變體。現(xiàn)有技術(shù)中描述了多種基于分枝桿菌屬毒力株或無毒力株的細(xì)胞壁片段的抗結(jié)核疫苗。還描述了用于該疫苗組合物中的佐劑顯著地影響其效果。E.Ribi等,Nature1963，198,1214-1215頁描述了4頓包含無毒力BCG株的細(xì)胞壁片段和礦物油的組合物進(jìn)行的免疫測(cè)定。所述片段通過在礦物油中勻漿所述菌株的培養(yǎng)物獲得。該組，比傳統(tǒng)的疫苗(BCG)更為有效。然而，在同一篇文章中提到在水中并且不存在礦物油的條件下勻1時(shí)，其不能引起倒可免疫反應(yīng)。D.P.Pal等，IndianJ.MedRes.1977，65,340~345頁，描述了用H37Rv毒力株的細(xì)鵬片段和礦物油制備的疫苗。在這種情況下，戶腿細(xì)M片段M將死細(xì)胞婦細(xì)中勻漿獲得，隨后向組合物中加入礦物油。其同樣描述了該7K相中的細(xì)胞斷段是非免疫原性的，礦物油的存，于疫苗的效力來說是必須的。GK,Khuller等，F(xiàn)oliaMicrobiol.,1992，37,407412頁，描述了用Freund不完全佐劑制備的結(jié)核分枝桿菌H37Ra無毒力,胞壁的不同片段的，效果，其同樣包括了礦物油。RM.Agger等,Scand.J.Immunol"2002，56，443氺7頁，描述了包含H37Rv毒力株的細(xì)胞壁片段的疫苗，當(dāng)其包含陽離子表面活性劑二甲基雙十八銨溴化物作為佐劑時(shí)是有效的。其同樣描述了在鼠模型觀啶中，使用不含有戶艦佐劑的勻漿的結(jié)核分枝桿菌并不會(huì)產(chǎn)對(duì)結(jié)核的抗性水平。I.M.OrmeVaccine,2006，24,2-19頁(其為關(guān)于抗結(jié)核新疫苗的近期綜述文章)，描述了常規(guī)的BCG疫苗在if[^人結(jié)核中基本上是無效的。在同一篇文章中還說明，對(duì)接受不同類型疫苗(蛋白亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒組合疫苗、重組株疫節(jié)的若干個(gè)候選行了領(lǐng)l賦，并且預(yù)期了新的發(fā)展。因此，需要一種預(yù)防性疫苗來預(yù)防由結(jié)核分枝桿菌弓胞的感染，其比基于減毒BCG株的當(dāng)前疫苗更為有效。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是包含MTB"C毒力胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療由結(jié)核分枝桿菌弓l起的感染的藥物中的用途。發(fā)明詳述專利申請(qǐng)ES2231037-A1公開了一種制備包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合ll(Mra-C)毒力株的細(xì)胞壁片段的免疫治療劑的方法。其同樣公開了含有該治療劑的組合物以及其用于與其他藥物聯(lián)用治療結(jié)核的治療應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了戶腿免疫治療劑在審恪預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途。因此，本發(fā)明的目的在于包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合^(MTB-C)毒力糊鵬片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中戶脫治療劑艦包含下述步驟的方法獲得-培養(yǎng)MTB"C毒力株等于或大于3周，隨后-在非離子表面活性劑的雜下勻魏胞歸物。戶，毒力株可以是MTB"C的樹可毒力株。本領(lǐng)域研究人員最常用的毒力fe—被稱為H"Rv，其可以在國家標(biāo)準(zhǔn)菌^(NationalCollectionofTypeCulture)(NCTC)，倫敦，英國免費(fèi)獲#(皿號(hào)NC007416)o戶;M毒力株可以在本領(lǐng)域公知的培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，例如Mddlebraok7H10或7H11瓊月旨，Sauton培養(yǎng)基或Proskauer-Beck線基。在等于或大于3周的期間JW毒力株，包含3周至4周。培養(yǎng)的，維持在34"38。C之間。一旦培養(yǎng)結(jié)束，采用諸如專利申請(qǐng)ES2231037-A1中描述的技術(shù)分離細(xì)胞?；罴?xì)胞的勻漿在非離面活性劑存在下，,在中性pH(例如在pH6-8之間)緩沖介質(zhì)中進(jìn)行，例如由PBS緩沖銜磷離緩沖銜麟?？梢酝∕聲處理的方法進(jìn)行勻漿，或Mii約lmm直徑的小爽例如zm化誠二氧化鋯/二氧化硅珠)和機(jī)械勻槳器的方法進(jìn)行。可采用的機(jī)械勻漿器例如為BioSpecBeadBeate漲型。通過該勻漿方法裂解MTB-C⑧細(xì)胞，獲得細(xì)胞壁小片段。該勻漿方法中4頓的非離子表面活性劑tt^自縫酚乙氧掛七物、山梨聚糖酯乙氧基化物及其混合物。更雌的，所述非離子表面活性劑選自雜酚乙tt化物。更雌的，艦包含7-8摩爾的環(huán)氧乙烷成分的辛基酚乙氧^f七物，該表面活性劑可以TritonX-l14⑧的名稱在市場(chǎng)上找到。在勻漿步驟中，所述非離子表面活性齊啲含量雌占勻漿物總重量的1%-10%M，更雌在3%-6%重量之間。艦常規(guī)處理分離含有細(xì)^段的勻漿物，并棄去非片段飾胞和可溶的成分。例如可應(yīng)用如專利申請(qǐng)ES2231037-A1中描述的在不同速度下的離心和緩沖溶液的洗滌。所職化步驟后，獲得含有細(xì)胞壁片段的沉淀物。將戶腿沉淀物分散于PBS緩沖液中，進(jìn)行常規(guī)處理保證在片段化和純化步驟后還可能保持活性的MTB-C細(xì)胞的完全失活。所述的處理可以是化學(xué)方法，例如用甲醛處理，或物理方法，例如ilii高壓滅菌或巴斯德滅菌處理的施。可以凍干滅活處理后在PBS緩沖液中的細(xì)M片段的分散齊似利于存儲(chǔ)。最后戶腿分散劑可分輕小瓶中，在-15至-25'C之間凍干，真SS為0.1-0.5mbar。凍干步驟后獲得的小瓶含有包含MTB-C細(xì)片段的免疫治療劑，其通常儲(chǔ)存在很低的鵬下，例如-7(TC。如前所述，本發(fā)明的目的是包含MIB-C毒力片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，艮P，在制滅結(jié)核疫苗中的用途。該預(yù)防性治療結(jié)核的藥物包含基于細(xì)胞壁片段的免疫治療劑以及任選的可藥用稀釋劑、佐劑和/^W劑。臓藥物可以是磷酸緩沖忠K、7jC溶液、乳劑劍旨質(zhì)體的形式。該藥物雌為脂質(zhì)體的形式。可采用常規(guī)輔助脂質(zhì)和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的獄，例如在專利申請(qǐng)ES2231037-A1中公開的另卩些，來形^B^脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體通常包括帶中性和/或陰性凈電荷的磷脂，以及甾醇類。所4頓的糊旨可以是，例如磷脂醐旦堿、磷脂,氨酸和磷脂鵬醇。戶m脂質(zhì)體的主要成分通常為磷脂miM堿，其可以合成m天然來源分離。常用的商業(yè)產(chǎn)品^u^衍生的卵磷脂，其為包括磷脂翻旦堿在內(nèi)的a^的磷脂混合物。用于制備脂質(zhì)體的甾醇類可以是膽固醇和膽鹽。戶腿脂質(zhì)體im^大豆衍生的卵磷脂和膽酸鈉的混合物形成。劍旨質(zhì)體任選的含有改善其穩(wěn)定性的添加劑，例如維生素E，其作為脂質(zhì)抗氧化劑起作用。獲得柳旨質(zhì)體通常具有這樣的大小分布99.9%小于1。所述脂質(zhì)體可進(jìn)行凍干，以獲得凍干脂質(zhì)體形式的免疫治療劑。該藥物可以作為單劑或多劑的形式以一定的時(shí)間間隔重復(fù)施用，優(yōu)選的兩次給藥間隔2-5周，優(yōu)選間隔34周。該藥物可以經(jīng)粘膜給藥，例如，經(jīng)眼、鼻內(nèi)、口腔、胃、腸道、陰it^t粘膜，或胃腸外給藥，例如經(jīng)皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜S;WM內(nèi)。優(yōu)選胃腸外給藥。合適的劑量于^個(gè)參數(shù)，包括給藥的方法和所治療的，，但的劑量是1pg至1000pg之間，更優(yōu)選為25-700昭，更優(yōu)選為50-200呢。戶，包含MTB-C毒力胞壁片段的藥物可與其它結(jié)核的預(yù)防'|苗1^施用，例如在S.H.E.Kaufinann^NatureRev.Immunol.2006，6，699-704中蹈lj的那些，例如諸如BCG疫苗、亞單位疫苗或重組BCG疫苗。戶，疫苗的組合可同時(shí)施用，或間隔一定的時(shí)間分開接種兩次完成。接種之間的時(shí)間甚至可以皿數(shù)年。在分開接種的情況下，皿首先施用抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗，而隨后施用作為首次接種疫苗再剌激(增強(qiáng)瀏的包含MTB-C毒力糊SK)t段的藥物。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，施用戶;M包含基于廳-c毒力鄉(xiāng)!Wt段的免疫治療齊啲藥物會(huì),誘導(dǎo)TM型干擾素Y產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異餓原的應(yīng)答。戶;f^C原包括Ag85B和Ag85A，其為Ag85復(fù)合物的--部分，該復(fù)合物由在細(xì)生物合成中起決定性作用的低肝量蛋白家族《賊并且在細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)數(shù)期大M^生。已觀察到傳統(tǒng)的BCG疫苗不產(chǎn)生針對(duì)復(fù)合物Ag85抗原的免疫做應(yīng)答，其可能代表了較低的，能力。同樣發(fā)現(xiàn)接種戶艦免疫治療劑后用毒力株H37Rv感染的小,市中的存活菌數(shù)目低于對(duì)照小鼠組中的存活菌數(shù)目，并且戶皿數(shù)目與接種常規(guī)BCG疫苗的小鼠中的情況相當(dāng)。以下實(shí)施例用于向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明特定實(shí)施方案的詳細(xì)解釋。實(shí)施例1免疫治療劑作為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌引起感染的預(yù)防性疫苗的效果。本例中使用的免疫治療劑按照專利申請(qǐng)ES2231037-Al中實(shí)施例2描述的方法制備。所述基于MTB-C毒力株細(xì)鵬片段的免疫治療齊啲媒在6-8周齡且賺定病原體的C57BL/6型睢性小鼠中進(jìn)行測(cè)定。小鼠被分成3組，每組12只，按下述接種方案進(jìn)行1)無接種(對(duì)照組)，2)在微的第3周和第6周皮下接種兩劑的專利申請(qǐng)ES2231037-A1實(shí)施例2中獲得的285Mg免疫治療劑，3)在1^第0周時(shí)皮下接種2><106形,位的BCG丹麥菌銜Statens血清研究所，丹麥)。使用在Praskauer-Beck培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的結(jié)核分枝桿菌的毒力株(H37RvPasteur)感染，將其以lml的等分存儲(chǔ)在-7(TC下備用。在試驗(yàn)的第9周將小鼠置于Mddlebrook氣霧劑感染儀中用所述毒力株的氣霧劑感染，其在小鼠肺中微了約10-50存活菌的接種物。在動(dòng)物被氣霧劑感染后3周(微的第12周)后，聊市勻漿的系列稀釋液在Middlebrook7H11瓊脂中于37'C下培養(yǎng)4周，測(cè)定肺中的存活菌數(shù)。肺在lml雙蒸7乂存在下勻漿。表I的結(jié)果,御市中鑒定的每，^^形成單位(CFU)的對(duì)數(shù)表I小鼠組疫苗Log10CFU/ml1無(對(duì)照組)6,42±0242月旨質(zhì)體包裹的免疫治療劑5.72±0.303BCG5.71±0.58未接種小鼠組和接種組結(jié)^L間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的?？梢杂^察到，在接種脂質(zhì)體包裹的免疫治療劑的小鼠組中，檢測(cè)至啲肺部存活菌劍氐于未接種小鼠中的情況，與接種常規(guī)BCG疫苗的小鼠中的數(shù)目基料目同。因此，接種基于MTB-C毒力鄉(xiāng)胞斷段的免疫治療劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)由結(jié)核分枝桿菌弓I起的感染的保護(hù)作用。實(shí)施例2免疫治療劑產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌引起感染的特異性Thl應(yīng)答的有效性本實(shí)施例中^ffi的免疫治療劑按照專利申請(qǐng)ES2231037-Al中實(shí)施例2描述的方法制備。所述基于MTB"C毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑的有效性在6-8周齡且，定病原體的C57BL/6型雌性小鼠中進(jìn)行體外i微測(cè)定。小鼠被分成4只一組，按下述接種方^S行1)在試驗(yàn)的第3周和第6周皮下接種鹽水(對(duì)照組)，2)在試驗(yàn)的第3周和第6周皮下接種兩齊摶利申請(qǐng)ES2231037-A1實(shí)施例2中獲得的285Mg免疫治療劑，3)在微第0周時(shí)皮下接種2xl()6離形鵬位的BCG丹麥菌銜Statens血清研究所，艘)，在微的第3和第6周接種舫乂。4)在試驗(yàn)第3周時(shí)皮下接種2xl06菌落形成單位的結(jié)核分枝桿菌的毒力株(H37RvPasteur)，在微的第6周接種lbJC。小鼠在第7周處死，取其脾臟，浸泡在含有5mlL-谷氨i^-RPMl(Gibco)的試管中。試管保留在冰中直至微結(jié)束。機(jī)械裂解脾臟，用直徑70拜的尼龍篩過濾懸浮液，隨后在300g下離心10併巾。沉淀物用15mlTris和氯化銨的雙蒸水溶液重構(gòu)，對(duì)細(xì)Kffi豫解。8射中后用20mlL-谷氨Sfcfl安-RPM1洗滌，在300g下離心10分鐘。將獲得的沉淀再懸浮于5mlL-谷氨St^-RPMl中，懸細(xì)直徑70拜的尼龍篩過濾。用Neubauerchamber計(jì)數(shù)細(xì)胞。將來自小鼠脾臟的細(xì)胞以lxl()5細(xì)胸孔的比例接種于培養(yǎng)皿中，用200m1由補(bǔ)充有滅活的胎牛血清、艦西林、鶴素、丙酮,和2-巰基乙醇的L谷胺E^-RPMI纟賊的完全培養(yǎng)與CCM)或200Ml補(bǔ)充結(jié)核分枝桿菌，(10ng/ml的抗原PPDXstatens血清研究所，iW)和5ng/ml的ESAT-6、Ag85A和Ag85B(LionexDiagnosticsandTTier^euticsGmbH,德意志聯(lián)邦共和國)的完全培養(yǎng)萄CCM)蹄。這些細(xì)胞在37。C下于5^的c02氣氛中孵育。％小時(shí)后，培養(yǎng)皿在300g下離心10頒，麟它們每一個(gè)的上清液。冷凍上清液，^EB^狀態(tài)保留至少24小時(shí)后，用雙夾心ELISA技術(shù)采用對(duì)鼠干擾素y特異性的單克隆抗^iaclone)分析干擾素Y成分。表n顯示了以1og,op^ml表示的平均千擾素Y濃度，M每一組小鼠中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原而被誘導(dǎo)。表n<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)組2和組3之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(2)組2和組4之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(3)組3和組4之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異表n的結(jié)果顯示，細(xì)基于結(jié)核分枝桿菌毒力胸胞壁片段的脂質(zhì)體爐的免疫治療劑接種2次會(huì)^誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異'鵬原的干擾素Y。這表示其誘導(dǎo)了Thl型保護(hù)'腿答。特別的，由接種針對(duì)抗原PPD、Ag85B和Ag85A的脂質(zhì)體爐的免疫治療劑的小鼠組誘導(dǎo)的應(yīng)答與接種結(jié)核分枝桿菌H37RV毒力株的小鼠組的應(yīng)答之間沒有顯著差異。戶腿應(yīng)答比接種BCG菌銜常規(guī)疫節(jié)的小鼠組反應(yīng)更好，因?yàn)楹笳邇H誘導(dǎo)針對(duì)PPD而不針對(duì)Ag85B和Ag85A的應(yīng)答。只有接種戶皿毒力株的小鼠組能誘導(dǎo)針)m原ESAr-6的應(yīng)答。因此，基于結(jié)核分枝桿菌毒力胸鵬片段的免疫治療劑能誘導(dǎo)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的Thl型^^'腿答，表明其可有效用于預(yù)防由結(jié)核分枝桿菌弓胞的感染。權(quán)利要求1、包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中所述治療劑通過包含以下步驟的方法獲得一培養(yǎng)所述MTB-C毒力株等于或大于3周的時(shí)間，以及隨后一在非離子表面活性劑的存在下勻漿該細(xì)胞培養(yǎng)物。2、權(quán)利要求1的用途，其特征在于培養(yǎng)時(shí)間在34周之間。3、權(quán)利要求1或2的用途，辦征在于臓非離子表面活性劑選自'^S酚乙竊化物、山梨聚糖酯乙氧,物及其混合物。4、權(quán)利要求3的用途，辦征在于戶腿非離豫面活性劑選自雜酚乙氧靴物。5、權(quán)利要求4的用途，賺征在于戶腿非離子表面活性劑選自含有7-8摩爾環(huán)氧乙烷成分的酚乙氧,物。6、權(quán)利要求1-5任一戶;M的用途，，征在^3槳在中性pH值的緩沖介質(zhì)中進(jìn)行。7、權(quán)利要求1-6任一戶脫的用途，其特征在于戶雄方法進(jìn)一步包括下列步驟—i!31離心分離未片段化的細(xì)胞和溶解的成分，—對(duì)細(xì)鵬片段級(jí)鄉(xiāng)行化學(xué)或物理處理，滅活最終含有的最終毒力胸胞，以及一Mil凍干的方^B喿獲得的免疫治療劑。8、權(quán)利要求l-7任一戶腿的用途，其特征在于戶腿藥物為脂質(zhì)體的形式。9、權(quán)利要求1-8任一戶腐的用途，其特征在于以單劑或多齊啲形用戶腿藥物。10、權(quán)利要求9的用途，^T征在于以雙劑的形式施用戶艦藥物。11、權(quán)利要求10的用途，其特征在于戶腿的雙劑以2-5周的間隔絲施用。12、權(quán)利要求1-11任一戶腿的用途,嫌征在于與其它抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗齢施用艦藥物。13、權(quán)利要求12的用途，其特征在于戶腿疫苗在時(shí)間上分開的兩次接種中齢施用。14、權(quán)利要求13的用途，其特征在于首先鵬抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗，隨后施用包含MTB-C毒力胞壁片段的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中所述試劑通過包含以下步驟的方法獲得培養(yǎng)所述MTB-C毒力株等于或大于3周，以及隨后在非離子表面活性劑的存在下勻漿該細(xì)胞培養(yǎng)物。文檔編號(hào)A61K39/04GK101600455SQ200780040568公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2007年10月17日優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日發(fā)明者I·阿馬特列拉,P·J·卡多納伊格萊西亞斯申請(qǐng)人:阿爾西維爾法爾瑪公司